Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.
September 2nd, 2011
Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu In vitro Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, epi hava yolu modelini kullanarak primer insan solunum epitel dokuları ile Tiplendirilemeyen Hemophilus influenza veya NTHI'nin uzun süreli ko-kültürünü gerçekleştirmektir. Bu, bakterilerin ikinci bir adım olarak dokulara yapışmasına ve girmesine izin vermek için apikal yüzeyin NTHI ile aşılanmasıyla elde edilir. Ekler, normal mukus akışını taklit etmek ve müsin atık ürünlerini ve hücresel kalıntıları gidermek için her 24 saatte bir ön ısıtma DPBS ile yıkanır.
Daha sonra, dokular istenen zaman noktasında toplanır ve toplam hücre ile ilişkili veya içselleştirilmiş NTHI'nin sağkalımı belirlenir. Son olarak, bu yöntemle, canlı bakteri sayımlarına dayalı olarak dokular içinde zaman içinde NTHI sağkalımının suşa özgü özellikleri değerlendirilebilir. Bu yöntem, tiplenemeyen hemofilus influenza ile uzun süreli enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir.
Moraxella Alis gibi diğer insan patojenlerinin çalışmasında da kullanılabilir, bu prosedürün Dr. Doin'in laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olacağını göstermektedir. Taşıma plakasını ambalajından çıkarın ve deneye başlamaya hazırlanın. Taşıma plakasına %70 etanol püskürtün ve plakayı biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
Dört santigrat derece bir mililitre, epi hava yolları, altı kuyulu bir plakanın her bir kuyucuğuna bakım ortamı. Daha sonra bandı çıkardıktan sonra plakayı açın ve epi hava yolu eklerini kaplayan gazlı bezi çıkarın. Bir bükme hareketi kullanarak, arostan bir eki serbest bırakmak için cımbız kullanın.
Gerekirse, eki altı kuyulu plakanın kuyularından birine yerleştirin. Membrana dokunmaktan kaçınarak arosları ek parçadan dikkatlice çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Eklerin altında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.
Ve sonra altı kuyulu plakayı bir inkübatöre yerleştirin. Ekleri her gün aşağıdaki gibi yıkayın, DPBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile önceden ısıtın ve bir ucunu DPBS ile doldurun. Daha sonra steril forseps kullanarak, 200 mikrolitre ön ısıtma DPBS'yi dokuya nazikçe pipetleyin.
Ardından, dokuya dokunmadan DPBS'yi eşit şekilde dağıtmak için eki sallayın. Ardından, kesici ucu belirli bir açıyla eğin ve bir P 1000 pipet ucunu, kesici ucun altındaki zarı tutan plastik halkaya yerleştirin. Daha sonra tampon çözeltisini dikkatlice aspire edin ve çözeltiyi daha sonra çalışmak üzere bir kriyo tüpüne yerleştirin.
Son olarak, bazal bakım ortamını aspire edin ve bir mililitre taze ortamla değiştirin. Daha fazla DPBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile önceden ısıtın. 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre ön ısıtma DPBS ekleyin ve ardından gece boyunca çikolatalı agar üzerinde yetiştirilen tek tiplendirilemeyen influenza veya NTHI kolonilerini tüpe yeniden süspanse edin.
Şimdi tüpü en az 10 saniye kuvvetlice girdap haline getirin ve ardından optik yoğunluğu ölçün. Bakteri konsantrasyonu yaklaşık 0.7'lik bir OD 600 nanometreye ulaşana kadar NTHI'nin tek kolonilerini eklemeye devam edin. Daha sonra, her bir EPI hava yolu ekini daha önce olduğu gibi önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve ardından her bir ekin apikal yüzeyine 28 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin.
Bazal bakım ortamını aşılamaktan kaçınmak. Ardından, NTHI önce ön ısıtmayı ölçmek için plakayı inkübatöre geri koyun ve ardından kuru çikolata agar plakalarını yüzey haline getirin. Daha sonra, NTHI aşısını% 0.1 jelatin veya PBSG ile steril PBS kullanarak seri olarak seyreltin.
Aşının 10 mikrolitrelik alikotunu plakalara damlatın ve ardından plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Ertesi gün, her damlada 15 ila 30 farklı koloniye sahip seyreltmeyi sayarak ve toplam hücreyle ilişkili bakterileri hasat etmek için gerçek geçerli NTHI aşınıza geri hesaplayarak mililitre başına CFU'ları belirleyin. Epi hava yollarının apikal yüzeyini kalsiyum veya magnezyum içermeyen 200 mikrolitre DPBS ile üç kez durulayın.
Ardından ek parçayı eğin ve bazal membranda kalan bakım malzemelerini durulayın. Yıkanmış eki altı oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin ve her dokunun apikal yüzeyine 250 mikrolitre steril,% 1 saponin çözeltisi ekleyin. Plaka inkübe edilirken plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.
Her bir seyreltme tüpünü 900 mikrolitre PBSG ile doldurarak seri seyreltme için tüpler ayarlayın. Daha sonra, ileri geri hareketlerle P 1000 pipet ucuyla dokuyu zardan ovalayın ve ardından dokuyu ekin kenarlarından çıkarmak için dairesel bir hareket izleyin. Daha sonra steril büyük delikli bir P 1000 pipet ucu kullanarak, süspansiyonu boş bir 1,5 mililitrelik einor tüpüne yerleştirin.
Şimdi ekin apikal yüzeyine 250 mikrolitre DPBS ekleyin ve ardından herhangi bir dokunun alınıp alınmadığını belirlemek için ters faz kontrast mikroskobu kullanarak eki inceleyin. Süspansiyonu einor tüpüne ekleyin ve kuvvetlice 500 mikrolitre DPBS ile doldurun. Hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca vorteksleyin.
Daha sonra 26 gauge iğne ile donatılmış steril bir mililitrelik şırınga kullanarak. Süspansiyonu iğne vasıtasıyla şırıngaya aspire edin. Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek süspansiyonu iğneden üç kez yavaşça geçirin.
Ardından süspansiyonu bir dakika daha kuvvetlice girdaplayın. Ardından, 100 mikrolitre süspansiyonu ilk seyreltme tüpüne aktarmak için büyük delikli bir pipet ucu kullanın. Tüpü beş saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın ve ardından seyreltmeyi çikolata agar plakalarına bir ila 10 seri seyreltme damla plakası yapın.
Daha sonra, içselleştirilmiş bakterileri hasat etmek için canlı bakteri sayımları için plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Her bir parçayı yalnızca 200 mikrolitre DPBS ile üç kez yıkayın. Bazal bakım ortamını mililitre gentamisin sülfat başına 100 mikrogram içeren ortamla değiştirin ve ardından apikal yüzeye 300 mikrolitre Gentamisin içeren bakım ortamı ekleyin.
Uçlar inkübe edilirken ekleri bir saat boyunca inkübatöre geri koyun, bazı DPBS'leri önceden ısıtın. Daha sonra Gentamisin içeren bakım ortamını apikal yüzeyden çıkarın. Daha sonra, eklerin apikal yüzeyini ve bazal membranını ön ısıtma DPBS ile yoğun bir şekilde yıkayın.
Son olarak, bu şekilde içselleştirilmiş bakterilerin seri seyreltmelerini ve kaplamasını gerçekleştirmeden önce gösterilen yıkama ve hasat prosedürünü tekrarlayın. Solda enfekte olmamış epi hava yolu dokularının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ile sağda beş günlük NTHI enfekte epi hava yolu dokularının karşılaştırılması. NTHI ile uzun süreli ko-kültürün apikal dokularda önemli bir hasara yol açmadığı görülebilir ve bu da epi hava yolu modelinin faydasını vurgulamaktadır.
Burada, bir epi hava yolu Ko-kültürü sırasında zaman içinde içselleştirilen NTHI sayısını gösteren bir grafik gösterilmektedir. R 2 8 6 6 suşu, kesici uç başına yedinci CFU'nun yaklaşık 10 katında aşılandı. Daha sonra içselleştirilmiş bakteriler hasat edildi ve belirtilen her zaman noktasında numaralandırıldı.
Bu videoyu izledikten sonra, A PRE modelini kullanarak NTHI'nin birincil hormon solunum dokuları ile uzun süreli ko-kültürünün nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu yöntem, primer insan solunum epitel dokusunu kullanan biyolojik olarak ilgili bir in vitro model olan EpiAirways ile uzamış bakteriyel eş kültürün karakterizasyonuna izin verir. Yaklaşım, uzun süreli eş kültür için uygun olan herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Solunum Biyolojisi
- In Vitro Modelleri
Arka Plan
- Nontypeable Hemophilus influenza (NTHI), solunum yolu enfeksiyonlarında önemli bir patojendir.
- Bakteryal etkileşimlerin solunum epitel dokularında nasıl olduğunu anlamak, tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- EpiAirways modeli, insan hava yolu ortamını taklit eder.
- Uzun süreli eş kültür çalışmaları, bakteriyel hayatta kalma ve davranış hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- NTHI'nin primer insan solunum epitel dokuları ile uzun süreli eş kültürünü gerçekleştirmek.
- Zamanla dokular içinde NTHI'nin hayatta kalmasını değerlendirmek.
- NTHI hayatta kalmasının suşa özgü özelliklerini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Epitel dokularının apikal yüzeyine NTHI'nin inokülasyonu.
- Mukusu akışını taklit etmek için her 24 saatte bir ön-ısıtılmış DPBS ile insertlerin yıkanması.
- Arzu edilen zaman noktalarında dokuların analiz için hasat edilmesi.
- Toplam hücreye ilişkin veya içselleştirilmiş NTHI'nin hayatta kalmasının belirlenmesi.
Ana Sonuçlar
- NTHI ile uzun süreli enfeksiyonlar hakkında bilgiler elde edildi.
- Canlı bakteri sayımları, NTHI hayatta kalma özelliklerini değerlendirmek için kullanıldı.
- Yöntem, ilgili bir modelde bakteriyel davranışı değerlendirme yeteneğini gösterdi.
- Bulgular, solunum yolu enfeksiyonları hakkında gelecekteki araştırmalara bilgi sağlayabilir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, insan solunum dokuları ile bakteriyel eş kültürünü incelemek için değerli bir araç sağlar.
- Epitel hücreleri ile NTHI etkileşimlerinin anlaşılmasını artırır.
- Yaklaşım, benzer çalışmalarda diğer mikroplarda da uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The EpiAirway model enables long-term co-culture of respiratory pathogens with primary human epithelial tissues, addressing a critical gap in preclinical infection modeling. This approach supports mechanistic de-risking of host-pathogen interactions and improves predictive confidence in early-stage antimicrobial target validation. By maintaining tissue integrity and physiological relevance over extended periods, it enhances translational continuity from discovery to preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of cell-associated and internalized bacteria over time.
- Operational Value: Supports functional target validation by assessing strain-specific survival characteristics in a human-relevant system.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by modeling chronic infection phenotypes not supported by submerged cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative dependent variable measurements (CFU counts) for evaluating antimicrobial efficacy and bacterial persistence.
- Operational Value: Enables assay standardization through daily washing with pre-warmed DPBS to mimic mucociliary clearance and reduce variability.
- Scientific Value: Supports screening readiness by allowing mucin production and cytokine profiling as secondary readouts for host response.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant system (normal human tracheo-bronchial cells) to improve translational biomarker alignment for respiratory infections.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical work by maintaining tissue structure and function during long-term co-culture.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by characterizing long-term host-pathogen interactions without significant apical tissue damage.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory antimicrobial development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal tracking of bacterial adherence, invasion, and survival.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility via standardized inoculum preparation (OD 600 nm ~0.7) and serial dilution plating for viable bacterial counts.
- Analytics: Generates quantitative readouts (CFU/mL) that allow comparison of strain-specific survival and evaluation of intervention effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of primary human tissues that retain cytokine production and mucin secretion capabilities.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform adaptable to other respiratory pathogens (e.g., Moraxella catarrhalis) beyond NTHi.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in chronic infection models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via antibiotic-free conditions and defined washing protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying compounds that reduce bacterial internalization or persistence over time.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on longitudinal infection dynamics rather than acute cytotoxicity endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary tissue handling and biosafety level 2 practices for co-culture of bacteria and human cells.
- Dependent on specialized inserts and air-liquid interface culture systems (e.g., MatTek EpiAirway).
- Necessitates cross-team standardization of inoculum preparation, washing frequency, and harvesting procedures.
- Adaptation considerations include validation of pathogen compatibility with mucociliary clearance mimicry and tissue integrity over time.
- Practical limitation: Extended co-culture increases contamination risk, requiring strict aseptic technique in shared biosafety cabinets.
