Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, epi hava yolu modelini kullanarak Nontypeable Hemophilus influenza veya NTHI ile primer insan solunum epitelyal dokularının uzun süreli ko-kültürünü gerçekleştirmektir. Bu, bakterilerin dokulara tutunmasını ve ikinci bir adım olarak dokulara girmesini sağlamak için apikal yüzeyin NTHI ile inoküle edilmesiyle sağlanır. Normal mukus akışını taklit etmek, müsin atık ürünlerini ve hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için insertler her 24 saatte bir önceden ısıtılmış DPBS ile yıkanır.

Ardından, dokular istenen zaman noktasında toplanır ve toplam hücre ilişkili veya internalize olmuş NTHI'ın sağkalımı belirlenir. Son olarak, bu yöntemle, canlı bakteri sayılarına dayanarak dokular içindeki NTHI sağkalımının zamana bağlı suşa özgü özellikleri değerlendirilebilir. Bu yöntem, tip edilemeyen hemophilus influenza ile seyreden uzun süreli enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntem, Moraxella Alis gibi diğer insan patojenlerinin çalışılmasında da kullanılabilir; bu prosedürü gösteren kişi laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr.Doin'dir. Transport plağını paketinden çıkarın ve deneye başlamak için hazırlık yapın. Transport plağını %70 etanol ile püskürtün ve plağı biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

Altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa, 4 °C sıcaklıktaki 1 mL epi airway bakım besiyerini ekleyin. Ardından bandı çıkarıp plağı açın ve epi airway insertlerinin üzerindeki gazlı bezi kaldırın. Bir cımbız yardımıyla, döndürme hareketi yaparak bir inserti aros'tan çıkarın.

İnserti altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarından birine yerleştirin. Gerekirse, membrana dokunmamaya dikkat ederek, bir steril pamuklu çubuk yardımıyla insert üzerindeki hava kabarcıklarını dikkatlice temizleyin. Insertlerin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.

Ardından altılı kuyucuklu plakayı bir inkübatöre yerleştirin. Insertleri her gün şu şekilde yıkayın: kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'yi önceden ısıtın ve bir pipet ucunu DPBS ile doldurun. Daha sonra steril pensler kullanarak bir inserti nazikçe kaldırın ve dokunun üzerine 200 µL önceden ısıtılmış DPBS pipetleyin.

Ardından, dokuya dokunmadan DPBS'nin eşit şekilde dağılması için inserti sallayın. Daha sonra, inserti bir açıyla eğin ve P 1000 pipet ucunu insertin altındaki membranı tutan plastik halkaya dayayın. Ardından tampon çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve çözeltiyi daha sonraki çalışmalar için bir kriyotüpe aktarın.

Son olarak, bazal bakım medyumunu aspire edin ve yerine bir mililitre taze medyum ekleyin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'den daha fazla miktar önceden ısıtın. 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre önceden ısıtılmış DPBS ekleyin ve ardından çikolata agarda gece boyunca büyütülmüş tip belirlenemeyen influenza veya NTHI tek kolonilerini tüp içinde resüspande edin.

Şimdi tüpü en az 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından optik yoğunluğu ölçün. Bakteriyel konsantrasyon yaklaşık 0,7 OD 600 nanometreye ulaşana kadar tekil NTHI kolonileri eklemeye devam edin. Sonra, her bir EPI havayolu insertini daha önce olduğu gibi önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve ardından her bir insertin apikal yüzeyine 28 µL bakteriyel süspansiyon ekleyin.

Bazal bakım medyasının inoküle edilmesinden kaçının. Ardından, NTHI miktarını belirlemek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin; önce ön ısıtma yapın ve ardından çikolata agar plaklarını yüzeyden kurutun. Sonrasında, NTHI inokulumunu %0,1 jelatin içeren steril PBS veya PBSG kullanarak seri şekilde dilüe edin.

Plakalara inokülümden 10 µL'lik alikotlar damlatın ve ardından plakaları gece boyunca 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Ertesi gün, her damlada 15 ila 30 adet belirgin koloni bulunan dilüsyonu sayarak ve toplam hücre ilişkili bakterileri toplamak için gerçek canlı NTHI inokülüm miktarınıza geri hesaplama yaparak mililitredeki CFU'ları belirleyin. Epi hava yollarının apikal yüzeyini, kalsiyum veya magnezyum içermeyen 200 µL DPBS ile üç kez durulayın.

Ardından inserti eğerek bazal membranda kalan bakım ortamını durulayın. Yıkanmış inserti taze bir altı kuyucuklu plakaya yerleştirin ve her dokunun apikal yüzeyine 250 µL steril, %1 saponin çözeltisi ekleyin. Plaka inkübe olurken, plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.

Her bir dilüsyon tüpünü 900 µL PBSG ile doldurarak seri dilüsyon tüplerini hazırlayın. Ardından, dokuyu membrandan uzaklaştırmak için bir P 1000 pipet ucuyla ileri-geri hareketler ve ardından insert'in kenarlarındaki dokuyu temizlemek için dairesel hareketlerle kazıma işlemi yapın. Daha sonra, steril, geniş ağızlı bir P 1000 pipet ucu kullanarak süspansiyonu boş bir 1,5 mL einor tüpüne aktarın.

Şimdi insertin apikal yüzeyine 250 µL DPBS ekleyin ve ardından hasat edilecek herhangi bir dokunun kalıp kalmadığını belirlemek için inserti evirtmiş faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Süspansiyonu einor tüpüne ekleyin ve üzerine 500 µL DPBS ekleyerek kuvvetlice karıştırın. Hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca vorteksleyin.

Ardından, 26 gauge bir iğne takılmış steril bir mililitrelik şırınga kullanarak süspansiyonu iğne aracılığıyla şırıngaya çekin. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek süspansiyonu yavaşça üç kez iğneden geçirin.

Ardından süspansiyonu bir dakika daha kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra, süspansiyondan 100 µL'yi ilk dilüsyon tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. Tüpü beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından 1'e 10 oranında seri dilüsyon yaparak dilüsyonu çikolata agar plaklarına damlatın.

Ardından, internalize olmuş bakterileri toplamak için canlı bakteri sayımı amacıyla plakları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin. Her bir insertı 200 µL DPBS ile yalnızca üç kez yıkayın. Bazal bakım medyasını 100 µg/mL gentamisin sülfat içeren medya ile değiştirin ve ardından apikal yüzeye 300 µL gentamisin içeren bakım medyası ekleyin.

Insertler bir saat boyunca inkübatörde bekletilirken, bazı DPBS önceden ısıtın. Ardından, Gentamisin içeren bakım ortamını apikal yüzeyden uzaklaştırın. Sonra, insertlerin apikal yüzeyini ve bazal membranını önceden ısıtılmış DPBS ile iyice yıkayın.

Son olarak, bu şekildeki internalize olmuş bakterilerin seri dilüsyonları ve ekimini gerçekleştirmeden önce, az önce gösterilen ovalama ve toplama işlemini tekrarlayın. Soldaki enfekte edilmemiş epi havayolu dokularının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ile sağdaki beş günlük NTHI enfekte epi havayolu dokuları karşılaştırıldığında; NTHI ile uzun süreli ko-kültürün apikal dokularda anlamlı bir hasara yol açmadığı görülmektedir, bu da epi havayolu modelinin kullanışlılığını vurgulamaktadır.

Burada, bir epi hava yolu ko-kültürü sırasında zamanla internalize olan NTHI sayısını gösteren bir grafik sunulmuştur. R 2 8 6 6 suşu, insert başına yaklaşık 1 × 10⁷ CFU olacak şekilde inoküle edilmiştir. Ardından, internalize olan bakteriler belirtilen her bir zaman noktasında toplanmış ve sayılmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, A PRE modelini kullanarak NTHI'nin primer hormon solunum dokularıyla uzun süreli ko-kültürünün nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.