Name: Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin, EpiAirway modeli kullanarak NTHI ile insan solunum epitel dokularında uzun vadeli ko-kültür ve bakteri sağkalımını değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım solunum enfeksiyonları araştırmalarına değerli katkılar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için teşekkür Patrick Hayden (Mattek) ve Robert Smith ve EM becerileri Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi Libby Perry. Bu çalışmada DAD NIDCD hibe DC010187 tarafından finanse edildi

1. Biyogüvenlik kabini EpiAirway dokular için hazırlanması <ol><li> Geri ve eldiven bağlı saç, özel bir laboratuvar önlüğü giymek, laminer akış başlar. 5 dakika sonra, kabine (Pipet, ipuçları, santrifüj tüpleri, vb) herhangi bir alet taşımak bir yana, sprey,% 70 etanol ve temiz bir kağıt havlu ile silin ile biyogüvenlik kabini iç ve kanat. % 70 etanol ile tekrar temizlenir iç Sprey ve kurumaya bırakın. Temiz tarafında araçları hareket ettirin ve etanol prosedürü tekrarlayın. </li><li> Kabine aerosol bariyer pipet uçları ve adanmış Pipet kullanın. Ayrı ayrı sarılmış steril serolojik pipetler kullanmak için, ambalaj dışında atarak, laminer akış ile takılı sonuna geçmesi açık ara ve kabin içine pipet kaydırın. </li><li> EpiAirway ekler steril forseps ile ele alınması gerekir. Yeri 6-inç ince ucu kavisli kendinden sızdırmaz sterilizasyon keseleri ve otoklav içine forseps diseksiyon. En az altı günlük kullanım için hazır olması için yeterli hazırlayın. </li></ol> 2. EpiAirway dokuların Unpacking <ol><li> % 70 etanol ile biyogüvenlik kabini çalışma yüzeyine püskürtün ve temiz bir kağıt havlu ile silin. Tekrar Sprey ve yüzey kullanmadan önce kurumasını bekleyin. EpiAirway kutusunu açın ve strafor ve ambalaj malzemesi atmak. </li><li> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya, HAVA-100-AA ABF (MM), Mattek sahipli ve ekler ile kit olarak gönderilir. Biyogüvenlik kabini, ortam türü ve tarihi ile etiket altı steril 50 ml santrifüj tüplerine ve kapakları gevşetin. % 70 etanol ile medya şişe Sprey ve kabin içinde açık. 4 ° C'de kısım her tüp için yeni bir steril serolojik pipet kullanarak her bir tüp içine 25 ml MM, kapaklar, ve mağaza sıkın. MM her gün taze bir kısım kullanın. </li><li> 2.2 1 X Dulbecco'nun taze bir şişe fosfat, kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin (D-PBS) kullanarak yukarıdaki tekrarlayın. Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tekrar tekrarlayın. 4 alikotları Mağaza ° C. </li><li> EpiAirway ekler HAVA-100 ° C katı medya içeren agaroz 4, 24 plaka gelmesi ve 6-iyi kullanmak için tabak içine yerleştirilmesi gerekir. Etanol-dayanıklı bir kalem kullanarak tarih ve açıklama ile her plaka etiketleyin. Her kuyuya 4 ° C EpiAirway MM Yeri 1 mililitre. Ulaşım, ambalaj,% 70 etanol ile sprey, ve biyogüvenlik kabini yer plaka çıkarın. Bandını çıkarın ve plakasını açın. Otoklavlanmış forseps kullanarak, EpiAirway ekler Nemli gazlı bez üzerine çıkarın. </li><li> 6 plaka bir kuyuya bir agaroz serbest yardım etmek için bir kıvırma hareketi ile otoklava forseps ile insert, yer ve Pick up. Bazı agaroz ortam için taşıma plakası sıcaklığı artar, özellikle de eklemek uygun olabilir. Steril bir pamuklu çubukla dikkatlice yerleştirin agaroz kaldırmak için kullanın. Membran dokunmaktan kaçının ve ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Plaka% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> Ortak kültürler başlamadan önce inkübatör dengeye dokular için en az 24 saat bekleyin. </li></ol> 3. EpiAirway dokuların bakımı <ol><li> Otoklavlanmış forseps kullanarak, bir ekleme pick up ve doku üzerine hafifçe kalsiyum ve magnezyum ile, önceden ısıtılmış D-PBS 200 mikrolitre pipet ve ekleme rock. Tilt bir açıyla yerleştirin ve insert altındaki membran tutan plastik halka karşı steril P1000 pipet yerleştirmek. Doku dokunmayın. D-PBS durulama ve etiketli bir steril cryovial yerleştirmek aspire edin. Numuneler -20 ° C'de dondurulmuş ve sonraki bir tarihte, müsin ve / veya sitokin ifade için test edilebilir. </li><li> Aspire ve taze MM 1 mililitre ile değiştirerek günlük bazal MM değiştirin. Her bir kuyu için yeni bir bariyer pipet kullanın. Bir gecede% 10 çamaşır suyu ile kullanılan medya davranın ve atın. </li></ol> 4. Aşılama, EpiAirway dokuların <ol><li> Çikolata agara, dondurulmuş gliserol stok tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) taze bir kültür dışarı Streak . Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör geceleme büyütün. </li><li> Ertesi gün, kalsiyum ve magnezyum ile yaklaşık 0,7 OD (600 nm) önceden ısıtılmış D-PBS NTHi tek koloniler tekrar süspansiyon haline getirin. Optik yoğunluk ölçüm şiddetle önce Vortex. Optik yoğunluk ilişkisi koloni oluşturan NTHi ml (CFU / ml) başına birimleri 0.2 'lik bir OD (600 nm) yaklaşık 1.0 x 10 8 CFU / ml eşittir. Bu nedenle, bir OD 0.7 (600 nm) yaklaşık 3.5 x 10 8 CFU / ml. Bu algoritma, aşılama için önce her NTHi suşu için valide edilmelidir. </li><li> EpiAirway dokuların HAVA-100, 0.6 cm 2 ve 0,4 mikron membran yüzey alanına sahip ekler yetiştirilmektedir . ~ 8.0 x 10 5 ~ 1.0 x 10 6 dokularda oluşan &lt;/&gt; Hücreleri destek. 12 - Bu nedenle, 1.0 x 10 7 CFU bir aşılama yaklaşık 10 enfeksiyon çokluğu karşılık gelir. Aşılamak için, 3.1 'deki gibi her EpiAirway eklemek yıkayın, daha sonra bakteriyel süspansiyon biyogüvenlik kabini içinde her EpiAirway eklemek apikal yüzeye 4.2 hazırlanan 28 mikrolitre ekleyin. Bazal MM aşılamak etmeyin. Inkübatör her plaka dönün. </li></ol> 5. NTHi inokulum Kantitasyonu <ol><li> Sterilize etmek için% 0,1 jelatin (PBS-G), otoklav ile fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi hazırlayın. Her tüpe steril PBS-G ve inokulum kısım 900 mikrolitre OD (600 nm) dayalı istenilen 01:10 dilüsyonları Etiket steril 1,5 ml Eppendorf tüpleri. </li><li> Çikolata agar plaklarına inoküle NTHi numaralandırmak için gerekli sayısını belirler. , Bir saat boyunca üst yarısında dinlenme plakanın alt baş aşağı bir hava inkübatör bu levhaların yerleştirin. Bu plaka 37 sıcak ° C ve NTHi açılan kaplama kolaylaştırılması, kuru yüzey. Sağlayacaktır </li><li> 4.2 'den ilk tüp bakteriyel süspansiyon 100 mikrolitre ekleyerek inokulum seri 01:10 dilüsyonları başlayın. Vorteks her seyreltme 5 saniye boyunca güçlü bir şekilde bir sonraki önce yapmak için. Her bir seyreltme için yarım tabak kullanarak, önceden ısıtılmış ve yüzey kurutulmuş çikolata agar plakları üzerine 10 mikrolitrelik alikotları bırakın. Beş altı 10 mikrolitrelik alikotları birlikte çalışan her 100 mm plaka bir yarım sığabilir. , Baş aşağı 37 nemlendirilmiş bir kuru yer ° C CO 2 inkübatör geceleme . </li><li> Ertesi gün, her açılan 15-30 farklı koloniler dilüsyonları sayma ve NTHi gerçek canlı inokulum geri hesaplanırken CFU / ml belirlemek. </li></ol> 6. NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür <ol><li> -20 Bakteri ve dondurma aynı gerginlik ° C gelecek analizi için etiketli cryovial inoküle her doku yıkamalar havuzu, sonra 3.1 'deki gibi, her 24 saatte bir, ekler yıkayın. Bu örnekler nokta leke müsin varlığı veya ELISA ile sitokinlerin ifadesi için çalışılmalıdır. Alternatif olarak, dokularda mRNA için hasat edilebilir ve qPCR ilgi genlerin yapılabilir. 3.2 'deki gibi günlük bazal MM değiştirin. Co-kültür boyunca devam edin. </li></ol> 7. EpiAirway dokuların hasadı <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS saponin taze% 1 solüsyon hazırlayın, filtre sterilize ve 37 ° C sıcak </li><li> 37 ° C, kalsiyum ve magnezyum olmadan, MM ve D-PBS başka bir 50 ml tüp Sıcak </li><li> 5.1 'sulandırma tüpleri hazırlayın yanı sıra eklemek sayısı ve NTHi gerilme ile etiketlenmiş eklemek başına bir boş steril 1,5 ml Eppendorf tüp,. </li><li> EpiAirways yapışık ve içselleştirilmiş organizmalar, ya da sadece içselleştirilmiş bakteriler için iki içeren, toplam hücre ilişkili bakteri ya da hasat edilebilir. </li><li> , Damla plakalı hücre ilişkili veya 5.2 gibi bir hava inkübatör etiket ve bir saat süreyle kuru NTHi işgal gerekli çikolata agar plaklarına sayısını belirler. </li><li> Toplam hücre ilişkili bakteriler hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan 200 mikrolitre D-PBS ile üç kez EpiAirways apikal yüzey durulama, daha sonra ekleme eğilme ve bazal membran kalan MM durulayın. Ilk yıkamada daha sonra analiz için dondurulmuş olabilir; aşağıdaki yıkar iptal. </li><li> 7.1 'den% 1 steril saponin çözüm yıkanmış MM olmadan yeni bir 6-plaka, insert, ve pipetle 250 mikrolitre her doku apikal yüzeye yerleştirin. 10 dakika boyunca inkübatör dön. </li><li> Inkübatör çıkar ve P1000 steril bir pipet kullanarak, geri ve ileri hareket, insert kenarlarından doku kaldırmak için dairesel bir hareket takip membran dokuların fırçalayın. Büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak, 7.3 'de hazırlanan boş etiketli tüpe süspansiyon yerleştirin. Eklemek apikal yüzeye kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 250 mikrolitre ekleyin. </li><li> Kalan herhangi bir doku hasat edilebilir olup olmadığını belirlemek için ters bir faz-kontrast mikroskop kullanarak eklemek inceleyin. Gerekirse, başka bir steril P1000 pipet ile tekrar fırçalayın, sonra büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak tüp 7.8 süspansiyon ekleyin. 1 mililitre kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tüp toplam hacmi getirin. </li><li> En yüksek hızda bir dakika boyunca şiddetle vorteks hücre süspansiyonu. 26 gauge iğne ile donatılmış, 1 ml steril bir şırınga, iğne süspansiyon ile enjektöre aspire. Yavaş yavaş süspansiyon özen baloncuklar oluşturmak için değil, iğne 3 kez geçmektedir. Bir dakika boyunca kuvvetlice tekrar karıştırın. </li><li> 7 hazırlanan ilk sulandırma tüpü içine geniş çaplı bir pipet, yer süspansiyon 100 mikrolitre kullanma.3. Vortex şiddetle beş saniye sonra seri 01:10 dilüsyonları. Drop-plaka yüzey kuru çikolata agar plakları üzerine istenilen dilüsyonları. </li><li> Içselleştirilmiş bakteri sadece hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 200 mikrolitre her ekleme 3 kere yıkayın. Ilk yıkamada saklayın ve dondurma. Önceden ısıtılmış MM nihai konsantrasyonu 100 mikrogram / ml gentamisin sülfat ekleyin. 1.5 ml eklemek için hasat edilebilir başına medya hazırlayın. Gentamisin içeren MM ile bazal MM değiştirin ve apikal yüzeye gentamisin içeren MM 300 mikrolitre ekleyin. Bir saat geri plaka CO 2 kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Apikal yüzey gentamisin içeren MM çıkarın ve apikal yüzey ve yaygın olarak kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısıtılmış D-PBS ile ekleme bazal membran yıkayın. 7,7-7,11 içinde gibi devam edin. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: NTHi ile 5 günlük bir ko-kültür (A) bulaşmamış EpiAirway doku ve (B) doku elektron mikrograflar sonra Tarama Şekil 1'de gösterildiği NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür apikal önemli bir hasara yol açmaz . dokular, EpiAirway modeli yardımcı programı vurgulayan. Dokular içinde zamanla sayısal içselleştirilmiş bakteri sayısını gösteren bir grafik Şekil 2'de gösterildiği gibi, her ikisi de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar, EpiAirway dokular ve tutarlı bir insan üst solunum yolu in vitro model biyolojik ilgili çalışma NTHi konak- patojen etkileşimleri. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 EpiAirway dokuların elektron mikroskobu Tarama. A. bulaşmamış kontrolü doku. NTHi eş-kültür beş gün sonra B. Doku. Apikal yüzey enfekte dokularda önemli bir hasar yok görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 NTHi sayısı EpiAirway ko-kültür sırasında zamanla içselleştirilmiş. Gerilme R2866 sonra her Belirtilen bir zaman noktasında içselleştirilmiş bakteriler hasat yaklaşık 1.0 x 10 7 CFU / ekleme (Gün 0) ekildi. Barlar = 3, en az iki nüsha halinde çoğaltır n temsil eder. Hata çubukları, SD.

<ol><li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae%3A+a+review+of+clinical+aspects%2C+surface+antigens%2C+and+the+human+immune+response+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li>
<li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Infect.+Dis.+J%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li>
<li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li>
<li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+tracheal%2Fbronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li>
<li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother.+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li>
<li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li>
<li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, hava-sıvı arayüzü birincil insan solunum dokuların biyolojik ilgili bir arka planda uzun vadeli konak-patojen etkileşimleri soruşturma sağlar. Burada bulaşmasını organizma olarak NTHi kullanılan, ancak herhangi bir bakterinin zamanla kabul edilemez sitotoksisite tanıtmak gelmez bu yöntem ile etkileşimi sayılabilir olabilir. EpiAirway model aynı zamanda, virüsler, ilaçlar, ya da kimyasalların bu etkiyi insan üst solunum yolu 5 çalışma için kullanılan, 6, 7, 8 . Biz, en az 10 gün NTHi ile ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558.255-25GM </td><td> Kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS içinde% 1, sterilize filtre </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum ve magnezyum ile tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum veya magnezyum olmadan tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz dokular </td><td> Mattek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya </td><td> Mattek </td><td> HAVA-100-AA-ABF </td><td> Kit ile birlikte </td></tr><tr><td> 10X fosfat tamponlu salin solüsyonu </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1X seyreltik kullanmadan önce </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> 1 X PBS ve otoklav bir final konsantrasyon% 0.1 ekle </td></tr><tr><td> Difco GC Orta Bankası (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Otoklav 500 ml GKD 2 O 36 - 60 g ve serin ° C </td></tr><tr><td> BBL Hemoglobin (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60 500 ml GKD 2 O serin Otoklav 10 g ° C ve üzerinde GC orta tabanı ile karıştırın </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX zenginleştirme (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> - 55 ° C ve 10 ml rehidrate IsoVitaleX eklemek, çikolata agar plaklarına dökün GC orta taban ve hemoglobin karışımı soğutun </td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, ince uçlu, kavisli </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Sızdırmazlık sterilizasyon keseleri </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin sülfat, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> 10 mikrolitre / ml gentamisin öldürmek için EpiAirway MM </td></tr></tbody></table>

uzun vadeli host-patojen etkileşimleri karakterize epiairway model kullanın.

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

2; Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), tekrarlayan ve kronik solunum mukoza 1 enfeksiyonlara yol açabilir insan adapte Gram-negatif bakteriler . Bu organizmalar solunum dokularda ve iç hayatta hangi mekanizmaları, bakteri ve insan hücreleri başarılı bir şekilde uzun vadeli işbirliği kültürü yapılabilir hangi modelin incelenmesi. Biz hava-sıvı arayüzü yükseltilmiş birincil insan solunum yolu epitel dokuların kullanımı, EpiAirway modeli (Mattek, Ashland, MA). Bu sıkı kavşaklar, siliyalı ve nonciliated hücreleri, müsin üreten ve enfeksiyona karşı sitokin üretme yeteneğini muhafaza goblet hücreleri içeren olmayan ölümsüzleştirdi, iyi diferansiye, 3-boyutlu dokular. Bu biyolojik olarak insan üst solunum yolu in vitro model ilgili bir dizi şekillerde kullanılabilir; zamanla bu yöntem genel hedefi, NTHi ve Asitli EpiAirway dokuların uzun vadeli işbirliği kültürü hücre ilişkili ve içselleştirilmiş bakteriler gerçekleştirmek için . Yanı sıra, enfekte ko-kültür müsin üretimi ve sitokin profili tespit edilebilir. Bu yaklaşım, pek çok mevcut protokoller mevcut yöntemleri geliştirir uzun süre 3 üzerinde bakteriyel enfeksiyonlar destekleme yeteneğine sahip değildir, insan hücrelerinin batık tek tabaka veya transwell kültürleri, kullanın . Örneğin, eğer bir organizmanın üstteki medya çoğaltmak, bu deney tutuklamak, sitotoksisite ve ev sahibi hücrelerin kaybı kabul edilemez düzeyde neden olabilir. EpiAirway modeli uzun vadeli konak-patojen etkileşimi karakterizasyonu sağlar. EpiAirway için kaynak ölümsüzleştirilen çizgisinden daha çok bir normal insan trakea-bronş hücreleri beri Ayrıca, her gerçek insan üst solunum yolu doku yapısı ve fonksiyonu 4 hem de mükemmel bir temsil,. Bu yöntem için, EpiAirway dokular teslimattan 2 gün önce anti-mikrobiyal ve anti-mantar bileşiklerin sütten ve tüm işlemler antibiyotik koşullar altında yapılmaktadır. Bu her iki bakteri ve birincil insan dokuları aynı Biyogüvenlik kabini olduğundan, özel durumlar gerektirmektedir ve uzun süre ko-kültür vardır.

Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Tipize edilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), solunum sisteminin tekrarlayan ve kronik enfeksiyonlarına neden olabilen, insan adaptasyonuna sahip Gram-negatif bakterilerdir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, epi hava yolu modelini kullanarak Nontypeable Hemophilus influenza veya NTHI ile primer insan solunum epitelyal dokularının uzun süreli ko-kültürünü gerçekleştirmektir. Bu, bakterilerin dokulara tutunmasını ve ikinci bir adım olarak dokulara girmesini sağlamak için apikal yüzeyin NTHI ile inoküle edilmesiyle sağlanır. Normal mukus akışını taklit etmek, müsin atık ürünlerini ve hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için insertler her 24 saatte bir önceden ısıtılmış DPBS ile yıkanır.Ardından, dokular istenen zaman noktasında toplanır ve toplam hücre ilişkili veya internalize olmuş NTHI'ın sağkalımı belirlenir. Son olarak, bu yöntemle, canlı bakteri sayılarına dayanarak dokular içindeki NTHI sağkalımının zamana bağlı suşa özgü özellikleri değerlendirilebilir. Bu yöntem, tip edilemeyen hemophilus influenza ile seyreden uzun süreli enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir.Bu yöntem, Moraxella Alis gibi diğer insan patojenlerinin çalışılmasında da kullanılabilir; bu prosedürü gösteren kişi laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr.Doin'dir. Transport plağını paketinden çıkarın ve deneye başlamak için hazırlık yapın. Transport plağını %70 etanol ile püskürtün ve plağı biyogüvenlik kabinine yerleştirin.Altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa, 4 °C sıcaklıktaki 1 mL epi airway bakım besiyerini ekleyin. Ardından bandı çıkarıp plağı açın ve epi airway insertlerinin üzerindeki gazlı bezi kaldırın. Bir cımbız yardımıyla, döndürme hareketi yaparak bir inserti aros'tan çıkarın.İnserti altı kuyucuklu plakanın kuyucuklarından birine yerleştirin. Gerekirse, membrana dokunmamaya dikkat ederek, bir steril pamuklu çubuk yardımıyla insert üzerindeki hava kabarcıklarını dikkatlice temizleyin. Insertlerin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Ardından altılı kuyucuklu plakayı bir inkübatöre yerleştirin. Insertleri her gün şu şekilde yıkayın: kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'yi önceden ısıtın ve bir pipet ucunu DPBS ile doldurun. Daha sonra steril pensler kullanarak bir inserti nazikçe kaldırın ve dokunun üzerine 200 µL önceden ısıtılmış DPBS pipetleyin.Ardından, dokuya dokunmadan DPBS'nin eşit şekilde dağılması için inserti sallayın. Daha sonra, inserti bir açıyla eğin ve P 1000 pipet ucunu insertin altındaki membranı tutan plastik halkaya dayayın. Ardından tampon çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve çözeltiyi daha sonraki çalışmalar için bir kriyotüpe aktarın.Son olarak, bazal bakım medyumunu aspire edin ve yerine bir mililitre taze medyum ekleyin. Kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS'den daha fazla miktar önceden ısıtın. 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre önceden ısıtılmış DPBS ekleyin ve ardından çikolata agarda gece boyunca büyütülmüş tip belirlenemeyen influenza veya NTHI tek kolonilerini tüp içinde resüspande edin.Şimdi tüpü en az 10 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından optik yoğunluğu ölçün. Bakteriyel konsantrasyon yaklaşık 0,7 OD 600 nanometreye ulaşana kadar tekil NTHI kolonileri eklemeye devam edin. Sonra, her bir EPI havayolu insertini daha önce olduğu gibi önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve ardından her bir insertin apikal yüzeyine 28 µL bakteriyel süspansiyon ekleyin.Bazal bakım medyasının inoküle edilmesinden kaçının. Ardından, NTHI miktarını belirlemek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin; önce ön ısıtma yapın ve ardından çikolata agar plaklarını yüzeyden kurutun. Sonrasında, NTHI inokulumunu %0,1 jelatin içeren steril PBS veya PBSG kullanarak seri şekilde dilüe edin.Plakalara inokülümden 10 µL'lik alikotlar damlatın ve ardından plakaları gece boyunca 37 °C'de %5 karbondioksit içeren ortamda inkübe edin. Ertesi gün, her damlada 15 ila 30 adet belirgin koloni bulunan dilüsyonu sayarak ve toplam hücre ilişkili bakterileri toplamak için gerçek canlı NTHI inokülüm miktarınıza geri hesaplama yaparak mililitredeki CFU'ları belirleyin. Epi hava yollarının apikal yüzeyini, kalsiyum veya magnezyum içermeyen 200 µL DPBS ile üç kez durulayın.Ardından inserti eğerek bazal membranda kalan bakım ortamını durulayın. Yıkanmış inserti taze bir altı kuyucuklu plakaya yerleştirin ve her dokunun apikal yüzeyine 250 µL steril, %1 saponin çözeltisi ekleyin. Plaka inkübe olurken, plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Her bir dilüsyon tüpünü 900 µL PBSG ile doldurarak seri dilüsyon tüplerini hazırlayın. Ardından, dokuyu membrandan uzaklaştırmak için bir P 1000 pipet ucuyla ileri-geri hareketler ve ardından insert'in kenarlarındaki dokuyu temizlemek için dairesel hareketlerle kazıma işlemi yapın. Daha sonra, steril, geniş ağızlı bir P 1000 pipet ucu kullanarak süspansiyonu boş bir 1,5 mL einor tüpüne aktarın.Şimdi insertin apikal yüzeyine 250 µL DPBS ekleyin ve ardından hasat edilecek herhangi bir dokunun kalıp kalmadığını belirlemek için inserti evirtmiş faz kontrast mikroskobu altında inceleyin. Süspansiyonu einor tüpüne ekleyin ve üzerine 500 µL DPBS ekleyerek kuvvetlice karıştırın. Hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca vorteksleyin.Ardından, 26 gauge bir iğne takılmış steril bir mililitrelik şırınga kullanarak süspansiyonu iğne aracılığıyla şırıngaya çekin. Kabarcık oluşmamasına dikkat ederek süspansiyonu yavaşça üç kez iğneden geçirin.Ardından süspansiyonu bir dakika daha kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra, süspansiyondan 100 µL'yi ilk dilüsyon tüpüne aktarmak için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. Tüpü beş saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve ardından 1'e 10 oranında seri dilüsyon yaparak dilüsyonu çikolata agar plaklarına damlatın.Ardından, internalize olmuş bakterileri toplamak için canlı bakteri sayımı amacıyla plakları 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda gece boyunca inkübe edin. Her bir insertı 200 µL DPBS ile yalnızca üç kez yıkayın. Bazal bakım medyasını 100 µg/mL gentamisin sülfat içeren medya ile değiştirin ve ardından apikal yüzeye 300 µL gentamisin içeren bakım medyası ekleyin.Insertler bir saat boyunca inkübatörde bekletilirken, bazı DPBS önceden ısıtın. Ardından, Gentamisin içeren bakım ortamını apikal yüzeyden uzaklaştırın. Sonra, insertlerin apikal yüzeyini ve bazal membranını önceden ısıtılmış DPBS ile iyice yıkayın.Son olarak, bu şekildeki internalize olmuş bakterilerin seri dilüsyonları ve ekimini gerçekleştirmeden önce, az önce gösterilen ovalama ve toplama işlemini tekrarlayın. Soldaki enfekte edilmemiş epi havayolu dokularının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ile sağdaki beş günlük NTHI enfekte epi havayolu dokuları karşılaştırıldığında; NTHI ile uzun süreli ko-kültürün apikal dokularda anlamlı bir hasara yol açmadığı görülmektedir, bu da epi havayolu modelinin kullanışlılığını vurgulamaktadır.Burada, bir epi hava yolu ko-kültürü sırasında zamanla internalize olan NTHI sayısını gösteren bir grafik sunulmuştur. R 2 8 6 6 suşu, insert başına yaklaşık 1 × 10⁷ CFU olacak şekilde inoküle edilmiştir. Ardından, internalize olan bakteriler belirtilen her bir zaman noktasında toplanmış ve sayılmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, A PRE modelini kullanarak NTHI'nin primer hormon solunum dokularıyla uzun süreli ko-kültürünün nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

Konak-patojen etkileşimlerinin in vitro çalışması spesifik immün yanıtların karakterizasyonuna izin verirken, karmaşık yanıtların etkilerini gözlemlemek için in vivo modeller gereklidir. Candida albicans maruziyetini ve ardından Pseudomonas aeruginosa aracılı akciğer enfeksiyonunu kullanarak, ventilatörle ilişkili pnömoni patojenitesinde yer alan mikrobiyal etkileşimlerin bir fare modelini oluşturduk.

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

İmmün yetersiz farelerde kronik yara enfeksiyonları oluşturmak için gecikmiş bir aşılama protokolünü tanımladık.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Bu yazıda, viral enfeksiyon sırasında pnömokokların asemptomatik bir kolonizatörden hastalığa neden olan bir patojene geçişi için yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu model, hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ve çeşitli konakçılarda polimikrobiyal ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Mevcut protokol, in vitro olarak konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için organotipik doku modellerinin uygulanmasını özetlemektedir. Spesifik olarak, açıklanan model sistemi, ağız sağlığına karşı hastalık bağlamında biyofilmlerle (diş plağı) ilişkili mikroorganizmalara maruz kalan çok katmanlı bir ağız epiteli kullanır.

Konak-Patojen Etkileşimlerinin İn Vitro Araştırılması için Organotipik Doku Model Sistemleri

Şu anda kronik bakteriyel enfeksiyonlara karşı ilaç taramasına uygun in vivo modellerin eksikliği vardır. Burada, zebra balığı larvalarında kalıcı bir enfeksiyon oluşturmak için bir Pseudomonas aeruginosa klinik izolatı ile yara enfeksiyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Öğrenin, EpiAirway modeli kullanarak NTHI ile insan solunum epitel dokularında uzun vadeli ko-kültür ve bakteri sağkalımını değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım solunum enfeksiyonları araştırmalarına değerli katkılar sunar.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Daha fazla video keşfet