Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, epi hava yolu modelini kullanarak primer insan solunum epitel dokuları ile Tiplendirilemeyen Hemophilus influenza veya NTHI'nin uzun süreli ko-kültürünü gerçekleştirmektir. Bu, bakterilerin ikinci bir adım olarak dokulara yapışmasına ve girmesine izin vermek için apikal yüzeyin NTHI ile aşılanmasıyla elde edilir. Ekler, normal mukus akışını taklit etmek ve müsin atık ürünlerini ve hücresel kalıntıları gidermek için her 24 saatte bir ön ısıtma DPBS ile yıkanır.

Daha sonra, dokular istenen zaman noktasında toplanır ve toplam hücre ile ilişkili veya içselleştirilmiş NTHI'nin sağkalımı belirlenir. Son olarak, bu yöntemle, canlı bakteri sayımlarına dayalı olarak dokular içinde zaman içinde NTHI sağkalımının suşa özgü özellikleri değerlendirilebilir. Bu yöntem, tiplenemeyen hemofilus influenza ile uzun süreli enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir.

Moraxella Alis gibi diğer insan patojenlerinin çalışmasında da kullanılabilir, bu prosedürün Dr. Doin'in laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olacağını göstermektedir. Taşıma plakasını ambalajından çıkarın ve deneye başlamaya hazırlanın. Taşıma plakasına %70 etanol püskürtün ve plakayı biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

Dört santigrat derece bir mililitre, epi hava yolları, altı kuyulu bir plakanın her bir kuyucuğuna bakım ortamı. Daha sonra bandı çıkardıktan sonra plakayı açın ve epi hava yolu eklerini kaplayan gazlı bezi çıkarın. Bir bükme hareketi kullanarak, arostan bir eki serbest bırakmak için cımbız kullanın.

Gerekirse, eki altı kuyulu plakanın kuyularından birine yerleştirin. Membrana dokunmaktan kaçınarak arosları ek parçadan dikkatlice çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. Eklerin altında hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.

Ve sonra altı kuyulu plakayı bir inkübatöre yerleştirin. Ekleri her gün aşağıdaki gibi yıkayın, DPBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile önceden ısıtın ve bir ucunu DPBS ile doldurun. Daha sonra steril forseps kullanarak, 200 mikrolitre ön ısıtma DPBS'yi dokuya nazikçe pipetleyin.

Ardından, dokuya dokunmadan DPBS'yi eşit şekilde dağıtmak için eki sallayın. Ardından, kesici ucu belirli bir açıyla eğin ve bir P 1000 pipet ucunu, kesici ucun altındaki zarı tutan plastik halkaya yerleştirin. Daha sonra tampon çözeltisini dikkatlice aspire edin ve çözeltiyi daha sonra çalışmak üzere bir kriyo tüpüne yerleştirin.

Son olarak, bazal bakım ortamını aspire edin ve bir mililitre taze ortamla değiştirin. Daha fazla DPBS'yi kalsiyum ve magnezyum ile önceden ısıtın. 15 mililitrelik bir tüpe üç mililitre ön ısıtma DPBS ekleyin ve ardından gece boyunca çikolatalı agar üzerinde yetiştirilen tek tiplendirilemeyen influenza veya NTHI kolonilerini tüpe yeniden süspanse edin.

Şimdi tüpü en az 10 saniye kuvvetlice girdap haline getirin ve ardından optik yoğunluğu ölçün. Bakteri konsantrasyonu yaklaşık 0.7'lik bir OD 600 nanometreye ulaşana kadar NTHI'nin tek kolonilerini eklemeye devam edin. Daha sonra, her bir EPI hava yolu ekini daha önce olduğu gibi önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve ardından her bir ekin apikal yüzeyine 28 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin.

Bazal bakım ortamını aşılamaktan kaçınmak. Ardından, NTHI önce ön ısıtmayı ölçmek için plakayı inkübatöre geri koyun ve ardından kuru çikolata agar plakalarını yüzey haline getirin. Daha sonra, NTHI aşısını% 0.1 jelatin veya PBSG ile steril PBS kullanarak seri olarak seyreltin.

Aşının 10 mikrolitrelik alikotunu plakalara damlatın ve ardından plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Ertesi gün, her damlada 15 ila 30 farklı koloniye sahip seyreltmeyi sayarak ve toplam hücreyle ilişkili bakterileri hasat etmek için gerçek geçerli NTHI aşınıza geri hesaplayarak mililitre başına CFU'ları belirleyin. Epi hava yollarının apikal yüzeyini kalsiyum veya magnezyum içermeyen 200 mikrolitre DPBS ile üç kez durulayın.

Ardından ek parçayı eğin ve bazal membranda kalan bakım malzemelerini durulayın. Yıkanmış eki altı oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin ve her dokunun apikal yüzeyine 250 mikrolitre steril,% 1 saponin çözeltisi ekleyin. Plaka inkübe edilirken plakayı 10 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.

Her bir seyreltme tüpünü 900 mikrolitre PBSG ile doldurarak seri seyreltme için tüpler ayarlayın. Daha sonra, ileri geri hareketlerle P 1000 pipet ucuyla dokuyu zardan ovalayın ve ardından dokuyu ekin kenarlarından çıkarmak için dairesel bir hareket izleyin. Daha sonra steril büyük delikli bir P 1000 pipet ucu kullanarak, süspansiyonu boş bir 1,5 mililitrelik einor tüpüne yerleştirin.

Şimdi ekin apikal yüzeyine 250 mikrolitre DPBS ekleyin ve ardından herhangi bir dokunun alınıp alınmadığını belirlemek için ters faz kontrast mikroskobu kullanarak eki inceleyin. Süspansiyonu einor tüpüne ekleyin ve kuvvetlice 500 mikrolitre DPBS ile doldurun. Hücre süspansiyonunu bir dakika boyunca vorteksleyin.

Daha sonra 26 gauge iğne ile donatılmış steril bir mililitrelik şırınga kullanarak. Süspansiyonu iğne vasıtasıyla şırıngaya aspire edin. Kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek süspansiyonu iğneden üç kez yavaşça geçirin.

Ardından süspansiyonu bir dakika daha kuvvetlice girdaplayın. Ardından, 100 mikrolitre süspansiyonu ilk seyreltme tüpüne aktarmak için büyük delikli bir pipet ucu kullanın. Tüpü beş saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın ve ardından seyreltmeyi çikolata agar plakalarına bir ila 10 seri seyreltme damla plakası yapın.

Daha sonra, içselleştirilmiş bakterileri hasat etmek için canlı bakteri sayımları için plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Her bir parçayı yalnızca 200 mikrolitre DPBS ile üç kez yıkayın. Bazal bakım ortamını mililitre gentamisin sülfat başına 100 mikrogram içeren ortamla değiştirin ve ardından apikal yüzeye 300 mikrolitre Gentamisin içeren bakım ortamı ekleyin.

Uçlar inkübe edilirken ekleri bir saat boyunca inkübatöre geri koyun, bazı DPBS'leri önceden ısıtın. Daha sonra Gentamisin içeren bakım ortamını apikal yüzeyden çıkarın. Daha sonra, eklerin apikal yüzeyini ve bazal membranını ön ısıtma DPBS ile yoğun bir şekilde yıkayın.

Son olarak, bu şekilde içselleştirilmiş bakterilerin seri seyreltmelerini ve kaplamasını gerçekleştirmeden önce gösterilen yıkama ve hasat prosedürünü tekrarlayın. Solda enfekte olmamış epi hava yolu dokularının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri ile sağda beş günlük NTHI enfekte epi hava yolu dokularının karşılaştırılması. NTHI ile uzun süreli ko-kültürün apikal dokularda önemli bir hasara yol açmadığı görülebilir ve bu da epi hava yolu modelinin faydasını vurgulamaktadır.

Burada, bir epi hava yolu Ko-kültürü sırasında zaman içinde içselleştirilen NTHI sayısını gösteren bir grafik gösterilmektedir. R 2 8 6 6 suşu, kesici uç başına yedinci CFU'nun yaklaşık 10 katında aşılandı. Daha sonra içselleştirilmiş bakteriler hasat edildi ve belirtilen her zaman noktasında numaralandırıldı.

Bu videoyu izledikten sonra, A PRE modelini kullanarak NTHI'nin birincil hormon solunum dokuları ile uzun süreli ko-kültürünün nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.