Name: İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Öğrenin bazofil aktivasyon testi ile IgE aracılı ilaç aşırı duyarlılığını tespit etme yöntemini. İlaç-protein konjugatları üreterek alerji mekanizmalarını araştırabilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF) hibe P18820-B13 tarafından finanse edildi. Etik bir bildirimde: Çalışma, 1983 yılında gözden geçirilmiş ve katılan tüm hastaların yazılı bilgilendirilmiş onam verdi Helsinki Declaraction uygun Salzburg Üniversitesi, İnsanlar ve / veya Hayvanlar katılımı Deneyler (PLUS_Ethik_090514) Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Ilaç konjugatları hazırlanması <ol><li> 1,5 ml reaksiyon tüp içinde 10 mg 1 ml dH 2 O DF çözülür. Bu DF çözüm daha fazla ilerlemeden 95 ul kullanın. PP konjuge HSA 500 ul 0.3 M sodyum hidroksit (NaOH) 30.4 mg PP türev (304 g / mol) çözülür. </li><li> (N-morfolino) ethanesulfonic asit (MES) tampon pH 6,5 - 95 ul çözünmüş DF - 430,6 ul dH 2 O ve 100 ul 0.5 M 2 ekleyin . 33.1 ul dH 2 O, ve PP örnek 2 M MES tampon pH 2.9 140 ul ekleyin . </li><li> 57.5 taze hazırlanmış N-etil-N 'ul ekle DF örnek mg / ml konsantrasyon, ya da 100 10 ul EDC çözüm dH 2 O çözünmüş carbodiimide hidroklorür (EDC) stok solüsyonu (3-Gaz sistemlerinde ) PP örnek. Vortex 1 dakika boyunca örnekleri. </li><li> Her bir örnek için 118 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile HSA çözüm 16.9 ul ekleyin. </li><li> 300 mermi / dak sallayarak ederken örnekleri 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> DF ve PP örnekleri 3 kez, her biri için birkaç saat fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 2 litre karşı Dialyze. 4 ° C'de bütün diyaliz adımları uygulayın. </li><li> Örnek 10 dakika 14.000 xg'de santrifüjleyin ve supernatant içeren DF veya konjuge HSA PP toplamak. </li><li> Proteinleri SDS-PAGE gerçekleştirerek% 12 jeller kullanarak süpernatant kontrol edin. Bir jel yuvaya yaklaşık 12 mikrogram HSA konjuge yükleyin. </li></ol> 2. Ilaç konjugatları kavrama oranı (Şekil 2) belirleyin <ol><li> 150 mM NaCl ve% 0.05 sodyum azid içeren 100 mM sodyum fosfat tamponu pH 6.5 HPSEC DF ve PP konjugatları kaplin oranı analizi için kullanın. TSK-Gel G2000 SWXL sütun bir 7.8 mm x 300 kullanın. </li><li> Online birleştiğinde RI ve UV dedektör sistemi kullanarak sinyallerin tespit gerçekleştirin. </li><li> DH 2 O 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyon ile HSA standart bir örnek hazırlayın Dedektör kalibrasyonu için 50 ul HSA standart solüsyon enjekte edilir. </li><li> RI sabiti k RI ve dedektör UV sabiti k UV hesaplayın. Formüller alan RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c Kalkış Desteği (HSA) ve alan UV = k UV * [(dA / dc) HSA * c Kalkış Desteği (HSA)] (dn / dc) HSA = 0,185 ve (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> DF ve her iki standartları, 5, 10, ve 30 nmol miktarda kolaylıkla enjekte edilebilir HPSEC için PP türev standartları hazırlayın. </li><li> (Dn / dc) için ilaç ve her iki standardın (dA / dc) ilaç ortalama değerleri hesaplayın. DF, (dn / dc) 39.000 ± 0.010 (dA / dc) ± 0,493 0,235 tespit edildi. PP, 0.328 ± 0.016 (dn / dc) ve (dA / dc) 53,155 ± 2,464 tespit edildi. </li><li> HPSEC ilaç konjügatları enjekte edilir ve RI ve UV pik alanları belirlemek. </li><li> DF, PP türev, ve HSA konsantrasyonu = k RI * (dn / dc) ilaç * c (ilaç) + (dn / dc) HSA * c Kalkış Desteği (HSA) ve alan UV iki denklemler alanında RI çözme hesaplayın = k UV * [(dA / dc) ilaç * c (ilaç) + (dA / dc) HSA * c] bilinmeyenli Kalkış Desteği (HSA). </li></ol> 3. BAT kullanarak ilaç konjugatları <ol><li> Yedi akış sitometri şişeleri hazırlayın ve içeriklerine bağlı olarak etiket: lekesiz kontrol, negatif kontrol, pozitif kontrol ve ilaç konjugatları. </li><li> B-CCR-STB stimülasyon, lekesiz ve negatif kontrol için ayrılmış şişeleri içine tampon (Flow2 CAST, Buhlmann Laboratuvarları, Schönenbuch, CH) Pipet 50 ul. Pozitif kontrol olarak, bir anti-FcεRI çözüm Flow2 CAST seti tarafından sağlanan 50 ul kullanın. 0.02 -20 mg / ml DF konjuge ve PP konjuge (200 ul bir test hacmi son konsantrasyonları) 1:10 seyreltme serisi oluşturarak, ilaç konjugatları için ayrılmış şişeleri, konjuge çözüm uygun miktarlarda ekleyin. Bu titrasyon deneyleri, her bir hasta numunesi için en uygun bazofil aktivasyon konsantrasyonunu belirlemek için yapılmalıdır. </li><li> Her bir tüp ve 50 ul hasta EDTA tam kan için 100 ul stimülasyon tampon ekleyin. Örnekleri dikkatlice karıştırın. </li><li> Pipet 20 ul Flow2 CAST boyama fikoeritrin (PE) ve her tüp floresein izotiyosiyanat (FITC) ile işaretli anti-CD63 antikorları ile işaretli anti-CCR3 antikorları içeren reaktif ve tekrar karıştırın. Lekesiz numune boyama reaktif pipetle etmeyin! </li><li> 37 ° C'lik su banyosunda 45 dakika örnekleri inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon durdurun. </li><li> Her flakon ve vorteks hafifçe 2.0 ml Flow2 CAST parçalama reaktifi eklenerek eritrositler Lyse. Numune karanlık oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> 500 xg'de 5 dakika ve dikkatle boşaltmak süpernatant için numuneleri santrifüjleyin. </li><li> Akış sitometri kadar buz üzerinde 500 ul Flow2 CAST yıkama tamponu ve mağaza hücrelerin tekrar </li><li> Akış sitometresinin gerilim s ayarlayınileri ve yan dağılım (FSC, SSC) yarlar lekesiz örnek elde edilirken. </li><li> Kapısı hücreleri SSC-PE arsa SSC-FSC arsa lenfositler olarak öngördü. Bazofiller CCR3 hi SSC lo ve kapı FITC-PE arsa içine PE etiketli anti-CCR3 antikor tarafından tespit edilir. Aktive bazofiller tespit anti-CD63 antikor FITC etiketli. </li><li> CD63 yüksek negatif kontrol olarak bazofiller cut-off maksimum% 2,5 'i ayarlayın. &gt;% 5 bazofiller CD63 hi ve negatif kontrol MFI bölünmüş örnek ortalama floresan indeksi (MFI) 2 aşarsa (Şekil 3), örnek bir bazofil aktivasyonu için pozitif olarak kabul edilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Bu deney, IgE bağımlı ilaç aşırı duyarlılık tespit etmek için yararlı bir araç olarak BAT değerlendirir. NSAİİ Protein konjugatları bazofil aktivasyonu için kullanılır. HPSEC olarak RI ve UV saptaması toplama devlet, kaplin derece ve konjugatları etkin verim ile belirlenir. Şekil 4'te görüldüğü gibi, DF konjugatları 43.5% 5.0 DF / HSA kaplin derecesi ile monomerik kaldı. Agrega için 9.5 kaplin derece tespit edildi. Propyphenazone konjuge 68.5% 21.2 kaplin derecesi ile monomerlerin oluştuğu gösterilmiştir. Agregaların kaplin derece 27,9 oldu. DF konjugatları belirlenen kaplin derece toplam 7.6 DF ve PP konjugatları 23.2 idi. BAT IgE bağımlı NSAİİ aşırı duyarlılık reaksiyonları soruşturma izin optimize koşulları (konjugatları konsantrasyonu, stimülasyon süresi) altında konjugatları ile yapıldı. Bazofil% 20,6 aktif floresan bir günlük vardiya ile karakterizedir: Şekil 5 de görüldüğü gibi, sadece PP konjuge bazofil aktivasyonu CD63 yüzey ekspresyonu bir upregülasyonu tarafından görüntülendi tetiklemek mümkün . MFI, 1893 için 4.9 kat artarak 386 (negatif kontrol). Buna karşılık, DF konjuge kullanarak bazofiller sadece% 3.1,% 5 cut-off altında olduğu aktive edildi. Ayrıca, MFI 210 197 (negatif kontrol), 1.1 (sınırı 2,0) bir faktör sadece arttı. Testi geçerliliği tarafından verilen (i) &lt;% 5 negatif kontrol bazofil aktivasyonu, bazofil ICSI'nin floresan yoğunluğu (ii) bir günlük vardiya, ve (iii)&gt;% 50 aktif bazofiller (pozitif kontrol). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 HSA DF ve PP türevi çiftlenmesi. Çözüldükten sonra ilaç, su, MES tampon ve EDC (kaplin reaktif) eklenir. HSA ilaç çözümlere pipetlenir önce örnekleri 1 dakika için vortekslenmiş. , Oda sıcaklığında sallayarak 2 saat içinde ilaçlar HSA kovalent bağlanır. Monomerler yanı sıra agrega neden olabilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 kaplin derece hesaplanması. İlk olarak, RI ve k UV k sabitleri belirlenmiştir. Bu nedenle, bilinen konsantrasyon ile HSA standardı HPSEC sistemi içine enjekte edilir. (Dn / dc) ve HSA (dA / dc) sırasıyla 5, 0,185 ve 0,518 değerleri verilmiştir. Pik alanları sabitleri hesaplamak için kullanılır. İkincisi, her ilaç için üç standartları ilaç ve konsantrasyon-RI ve UV alanları belirlemek için enjekte edilir. Yukarıdaki adımları, k RI ve k UV sabitleri bilinen bu yana, ilaca özgü (dn / dc) ve (dA / dc) türevleri hesaplanabilir . Üçüncü olarak, ilaç-HSA konjugatları HPSEC içine enjekte edilir. Sonuçta elde edilen pik alanları iki bilinmeyen değişkenler ile iki denklemleri çözerek tepe başına ilaç ve HSA konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanılır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 bazofil yolluk. Lenfositleri forward scatter karşı kapılı yan dağılım (SSC-FSC arsa) gibi hücre öngördü. Bazofiller CCR3 hi SSC lo kapılı lenfositler (SSC CCR3-PE arsa) olarak tanımlanır. Bazofil aktivasyon (CD63 hi), CD63-FITC-CCR3-PE arsa analiz edilmektedir. Negatif kontrol CD63 hi kalan maksimum% 2.5 bazofiller cut-off ayarlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 ilaç konjugatları kaplin derece kararlı. RI ve UV sinyallerinin ilaç HSA konjugatları agrega (düşük tutma hacmi salınımlı) ve monomerlerin (yüksek tutma hacmi az salınımlı) temsil eden iki tepe göstermektedir. Monomerlerin ve agrega yüzdesi (RI sinyalleri tespit) ve kaplin derece (n = 1) tasvir edilmektedir. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 bazofil activatitest. CD63-FITC-CCR3-PE araziler (n = 1) ilaç bileşimi ile aktive örnekleri, negatif kontrol, pozitif kontrol sonuçları gösterilmiştir.

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils%2C+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li>
<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BAT iyi kurulmuş henüz IgE aracılı allerjik hastalık 6,7 tanısı için rutin olarak kullanılan yöntem olsa da. Ilaç aşırı duyarlılık için düşük molekül ağırlıklı bileşikler çapraz IgE reseptörleri, bazofil aktivasyon 8 için bir ön koşul değildir, ancak, bunun uygulanabilirliği tehlikeye düşer. Bu nedenle, soruşturma altında ilaçların kovalent uygun taşıyıcı proteinler (örneğin HSA) ile birleştiğinde olması gerekir. Daha da önemlisi, kaplin derecesi (yani taşıyıcı protein başına ilaç moleküllerinin sayısı) konjugatları (yani IgE reseptörü cross-linking) immünolojik aktivite garanti etmek için kontrol edilmesi gerekiyor. Teorik olarak, taşıyıcı molekül başına iki hapten IgE reseptörü için yeterli olmalıdır çapraz bağlama ve HSA başına beş DF molekülleri gibi birkaç hücre bazlı analiz 4 mediatör salınımını tetikler görülmüştür. Her iki konjugatları, PP-HSA ve DF-HSA, yeterince yüksek bir bağlantı derecesi (HPSEC) gösterilecek ve onlara BAT kullanım için uygun reaktifler immünolojik etkin olacak şekilde tespit edilmiştir. Bir diğer sorun, ana ilacın yerine metaboliti olarak aşırı duyarlılık reaksiyonuna neden olabilir, ilaç metabolitleri bir rol oynayabilir olabilir. DF durumunda, bu olasılığı daha önce beş büyük Faz I metabolitleri ve bir bağ varyant 4 kullanılarak ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir . Açıklanan teknik mastering için önemli faktörler kan örneği (&lt;kan toplama, tespit bazofiller sayısı bu yana 12 saat&gt; 500) ve stimülasyon koşullarının optimizasyonu (zaman, doz) kalite içerir. Buna ek olarak, bu bile pozitif kontrol (antikor IgE reseptörü yöneltilen) tespit edilmesi ile reaksiyona girmeyen olmayan-yanıt olarak adlandırılır. Bu nedenle, doğrulama kriterleri, pozitif kontrol olarak bir anti-FcεRI antikor dahil etmek zorunda. Ilaç konjugatları kullanarak önemli bir avantajı DF-HSA konjuge anti-BAT 4 FcεRI antikor ile birlikte stimülasyon için gösterilen saf ilaçlar, aksine non-toksik ortaya çıktığı bir gerçektir. Saf DF, aksine, 1.25 mg / ml konsantrasyonda BAT 9 yorumlanabilirliğini sorunlara neden sitotoksik etkileri gösterir. Genel olarak, potansiyel sitotoksisite test kuvvetle her yeni üretilen ilaç bileşimi için tavsiye edilir. Burada, BAT IgE aracılı aşırı duyarlılık ortaya çıkarmak için kullanılan PP-HSA konjuge potansiyel göstermiştir. Buna karşılık, DF aşırı duyarlılık DF-HSA konjuge yanıt bazofil aktivasyon eksikliği gösterdiği IgE ile ilişkili değildir. Önemlisi, IgE aracılı bir mekanizma ile ilgili belirsizlik durumunda, konjugatları DF 4 gösterildiği gibi, in vitro hücre tabanlı test sistemleri immünolojik aktivite için değerlendirilmek üzere. Uygun protein taşıyıcı kovalent düşük molekül ağırlıklı ilaçların conjugating açıklanan kurulumu kullanarak, antibiyotikler de dahil olmak üzere ilaç, diğer NSAID, radiocontrast medya, kas gevşeticiler, anestezi karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları bir dizi moleküller, vb IgE aracılıklı bir katılımı için soruşturma olabilir mekanizması. Bu nedenle, BAT tanı (cilt testi, oral provokasyon testi) mevcut yöntemlere ek olarak hizmet verebilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / cihaz Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 2 - (N-morfolino) ethanesulfonic asit </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7.8 x 300 mm TSK Jel -G2000SWXL sütun </td><td> Bioscience Tosoh </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II. </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Masa üstü santrifüj </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diklofenak sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 CAST Seti </td><td> Buhlmann Laboratuvarları </td><td> FK-CCR </td><td> Etkili 14 Haziran 2011 Flow2 CAST kiti Akış CAST </td></tr><tr><td> HP1100 HPLC sistemi </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> İnsan Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Laboratuvar Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-etil-N&#39;-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide hidroklorür (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS tablet </td><td> ¸ </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone türevi </td><td> Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Salzburg Üniversitesi, Avusturya </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodyum azid </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodyum hidrojen karbonat </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodyum hydroxid </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Üçlü dedektör dizi </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> Kişisel BioVortex V-1 artı </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Su banyosu 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

İlaç aşırı duyarlılık ige aracılığı ile mekanizmalarının araştırılması bazofil etkinleştirme test

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Propyphenazone (PP) ve diklofenak (DF) gibi non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID) karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjik reaksiyonlar 1 I-benzeri türü olarak tezahür edebilir . Klinik uygulamada, ilaç aşırı duyarlılık tanısı deri testleri güvenilir değildir ve oral provokasyon testi 2 hasta için hayatı tehdit eden riskler taşımaktadır esas olarak hastanın öyküsü tarafından yapılır. Dolayısıyla, altta yatan bir IgE aracılı pathomechanism delil elde etmek zordur. Burada, in vitro yöntem, ilaca duyarlı hastalarda in vivo olarak, alerjik efektör reaksiyon taklit edilen insan bazofiller kullanımına dayalı bir sunuyoruz. Ilaç alerjik hastalarda bazofil suçlu ilaç için spesifik IgE molekülleri taşıyan, IgE reseptörü crosslinking üzerine aktif ve alerjik effektör moleküllerin serbest hale gelir. Bazofil aktivasyonu CD63 yüzey ekspresyonu flow sitometri 3 kullanarak upregülasyonu belirlenmesi ile takip edilebilir. Düşük molekül ağırlıklı ilaçların durumunda, konjugatları bazofiller IgE reseptörü crosslinking sağlamak için tasarlanmıştır. Şekil 1, iki temsilci NSAİİ tasvir gibi, PP ve DF, bir karboksil grubu ile lizin kalıntılarının temel amino grubu ile reaksiyona Kalkış Desteği (HSA) insan serum albumini için kovalent bağlıdırlar. DF, bir karboksil grubu içeren PP türevi organochemically önce çalışma 1 sentezlenebilir sahipken, bu nedenle, doğrudan 4 kullanılabilir içsel bir karboksil grubu ve taşımaktadır . Iki IgE reseptör molekülleri crosslinking garanti etmek için protein taşıyıcı molekül düşük molekül ağırlıklı bileşikler ve mekansal dağılımının kaplin derece önemlidir. Burada açıklanan protokol sıralı bir kırılma indeksi (RI) ve ultraviyole (UV) kaplin derecesinin belirlenmesi için algılama sistemi ile donatılmış yüksek performans boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) geçerlidir. Açıklanan metodoloji diğer ilaçlar için uygulanan olabilir, bazofil aktivasyon testi (BAT), ilaç aşırı duyarlılık IgE aracılı mekanizmaların belirlenmesi için kullanılan olma potansiyeli taşımaktadır. Burada, PP aşırı duyarlılık IgE aracılı ve DF aşırı duyarlılık, BAT, non-IgE aracılı olarak belirlemek.

Bazofil aktivasyon testi, IgE bağımlı alerji tespiti için güçlü bir araçtır<em&gt; In vitro</em&gt;. Burada, bazofil aktivasyon testi için optimize edilmiş bir protokol ilaç aşırı duyarlılık araştırmak için kullanılır. Kovalent ilaç-protein konjugatları ve fizikokimyasal karakterizasyonu ve verimli üretim için bir yöntem açıklanmıştır.

İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test

Propifenazon (PP) ve diklofenak (DF) gibi non-steroid anti-inflamatuvar ilaçlara (NSAİİ) karşı gelişen aşırı duyarlılık reaksiyonları, Tip I benzeri...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iyi karakterize edilmiş HAP ile immobilize ilaç taşıyıcı protein konjugatlarını kullanarak bazofil aktivasyon testi aracılığıyla IgE aracılı ilaç aşırı duyarlılığını tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle bir ilacın, içsel veya organokimyasal olarak eklenmiş bir karboksil grubu aracılığıyla insan serum albumininin lizin kalıntılarına kimyasal olarak bağlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci olarak, yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi (H-P-S-E-C), ardışık kırılma indisi ve ultraviyole deteksiyonu uygulanarak kesin bağlanma derecesini belirlemek amacıyla konjugatların fiziksel kimyasal karakterizasyonu yapılır.Ardından, iyi karakterize edilmiş ilaç konjugatları, ilaca karşı hipersensitivitesi olan donörlerin bazofillerini stimüle etmek için kullanılır. Nihayetinde, bazofil aktivasyon testi veya BAT, ilaç hipersensitivitesindeki IgE aracılı mekanizmaları değerlendirmek için kullanılabilir. Ben, Avusturya'daki Salzburg Üniversitesi Alerji Araştırma Grubu'ndan Michael Steiner.Bugün sizlere, ilaç aşırı duyarlılık reaksiyonlarında ilaca özgü IgE antikorlarının rolünü ölçme imkanı sağlayan bir tekniği tanıtmak istiyoruz. Burada, steroid olmayan antiinflamatuar ilaçların yaygın olarak kullanılan iki temsilcisi olan propiyon ve diklofenak ile prosedürü gösteriyoruz. Bununla birlikte, bu yöntemin hemen tip ilaç alerjilerinin rutin tanısında kullanılma potansiyeli bulunmaktadır.Genel olarak, propafenone veya PP örneğine 10 µL taze hazırlanmış N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidroklorür veya EDC stok çözeltisi ekleyin. Örneği bir dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, örneğe 118 mg/mL konsantrasyonda 16,9 µL insan serum albümini veya HSA çözeltisi ekleyin ve ardından örneği oda sıcaklığında, dakikada 300 devir hızında çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin.Çalkalama işlemi tamamlandıktan sonra, numuneleri dört santigrat derecede, her biri birkaç saat sürecek şekilde, iki litre PBS'ye karşı üç kez diyalizleyin. Ardından, numuneleri oda sıcaklığında 14.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve HSA'ya konjuge olmuş NSAİİ'leri içeren S süpernatantını toplayın. %12'lik jeller kullanarak SDS-PAGE uygulayarak süpernatanttaki proteinleri kontrol edin.Yüksek performanslı boyut dışlama kromatografisi veya H-P-S-E-C ile NSAİİ konjugatlarının bağlanma hızının analizi için, bir jel yuvasına yaklaşık 12 µg HSA konjugatı yükleyin. Öncelikle HSA standart örneğini, demineralize su içerisinde 1 mg/mL konsantrasyona seyreltin. Detektör kalibrasyonu için 50 µL HSA standart çözeltisi enjekte edin.Ardından, 7,8 x 300 milimetre TSK jel, G 2000 SSW XL kolon ve çevrimiçi bağlı bir kırılma indisi (RI) veya RI ve UV detektör sistemi kullanın. Detektör için RI sabiti $\text{C}_{\text{RI}}$ ve UV sabiti $\text{K}_{\text{UV}}$ değerlerini hesaplayın. Bu iki formülü kullanarak, enjeksiyon kolaylığı sağlamak amacıyla H-P-S-E-C için PP türev standartlarınıle iletkenliği giderilmiş suda 5, 10 ve 30'luk miktarlarda seyreltin ve ardından her iki standart için ilacın $\text{DN/DC}$ ve $\text{DA/DC}$ ortalama değerlerini hesaplayın.Şimdi bu iki formülü kullanarak ilaç konjugatlarını H-P-S-E-C üzerine enjekte edin ve bunların RI ve UV pik alanlarını belirleyin. Ardından, aynı iki denklemi kullanarak bilinmeyenler için PP türevlerinin ve HSA konsantrasyonunu hesaplayın. İlk olarak, içeriklerine göre yedi akış sitometrisi tüpünü etiketleyin: boyanmamış kontrol, negatif kontrol, pozitif kontrol ve ilaç konjugatları.Ardından, boyanmamış ve negatif kontrol için ayrılan tüplere 50 µL bazofil stimülasyon tamponu pipetleyin. Pozitif kontrol tüpüne Flow 2 Cast kitinden 50 µL anti-FC epsilon R1 solüsyonu ekleyin. Şimdi, ilaç konjuge tüplerine 1:10 dilüsyon serisi şeklinde 0,02 ile 20 µg/mL arasında PP konjugatı ekleyin ve ardından her tüpe 100 µL stimülasyon tamponu ile 50 µL hastadan alınan EDTA'lı tam kan ekleyin.Numuneleri dikkatlice karıştırın. Ardından, ilaç konjuge ile pozitif ve negatif kontrol tüplerinin her birine PE işaretli anti CCR3 antikorları ve ZI işaretli anti CD63 antikorları içeren 20 µL akış boyama reaktifi ekleyip karıştırın.Örnekleri tekrar 37 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından reaksiyonu durdurmak için örnekleri beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Sonrasında, her tüpe iki mililitre flow two lizleme reaktifi ekleyerek eritrositleri lize edin.Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. Ardından numuneleri oda sıcaklığında 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Süpernatanı dikkatlice dökün, hücreleri 500 µL flow cytometry yıkama tamponu ile yeniden süspande edin ve numuneleri akış sitometrisi işlemine kadar buz üzerinde saklayın.Akım sitometresi voltaj ayarlarını düzenlemek için boyanmamış örneği kullanın. Ardından, yan saçılım ileri saçılım grafiği içerisinde lenfosit olduğu öngörülen hücreleri kapılayın (gate). Bu örnek şekle benzer şekilde, bazofiller önce CCR3 yüksek yan saçılım düşük olarak tanımlanır.Bu saçılım grafiğine benzer şekilde. Hücreler fit EPE grafiğinde kapılandıktan sonra, aktive olmuş bazofiller, FIT E etiketli CD 63 pozitiflikleri ile daha ileri düzeyde tanımlanabilir. Negatif kontrolde bazofillerin maksimum %2,5'i CD 63 yüksek olarak belirlenerek eşik değer ayarlandıktan sonra, bazofillerin %5'inden fazlası CD 63 yüksekse ve örneğin MFI değerinin negatif kontrolün MFI değerine bölümü ikiyi aşıyorsa, örnek bazofil aktivasyonu için pozitif kabul edilebilir.Bu yöntem, IgE bağımlı ilaç aşırı duyarlılık proteinini tespit etmek için faydalı bir araç olarak bat'i değerlendirmektedir. NSAİİ konjugatları, RI ve UV deteksiyon agregasyonu ile H-P-S-E-C tarafından bazofillerin aktivasyonu için kullanılır. Konjugatların bağlanma derecesi ve etkili verimi, bu şekilde betimlendiği üzere belirlenir.DF konjugatlarının %43,5'i monomerik kalmış olup, agregatlar için HSA başına 5,0 DF bağlanma derecesi saptanmıştır. Burada gösterildiği üzere, 9,5'lik bir bağlanma derecesi belirlenmiştir. PPP konjugatının ise %68,5 monomerden oluştuğu ve bağlanma derecesinin 21,2 olduğu gösterilmiştir.Agregatların bağlanma derecesi 27,9 idi. Toplamda, DF konjugatlarının belirlenen bağlanma derecesi 7,6 df, PPP konjugatlarınınki ise 23,2 idi. Optimize edilmiş koşullar altında konjugatlarla gerçekleştirilen BAT, NSAİİ hipersensitivitesindeki IgE bağımlı reaksiyonların araştırılmasına olanak tanır.Burada gösterildiği gibi, sadece PP konjuge basofil aktivasyonunu CD 63 yüzey ekspresyonundaki bir artışla görselleştirerek tetikleyebilmiştir. Basofillerin %20,6'sı, floresan yoğunluğundaki artışla karakterize edilen aktivasyon göstermiş ve MFI değeri negatif kontrol için 386'dan 1893'e çıkarak 4,9 kat artmıştır.Buna karşılık, DF konjugatı kullanıldığında bazofillerin sadece %3,1'i aktive olmuş olup bu değer %5'lik eşik değerinin altında kalmıştır. Ayrıca, MFI değeri negatif kontrol için 197'den 210'a yükselerek yalnızca 1,1 kat artmıştır. Analizin geçerliliği, negatif kontrolde bazofil aktivasyonunun %5'ten az olmasıyla kanıtlanmıştır.İkincisi, bir bazofil alt popülasyonunda floresan yoğunluğunda bir log kayması ve pozitif kontrol için %50'den fazla aktive olmuş bazofillerdir. Bu videoyu izledikten sonra, bazofil aktivasyon testlerinin nasıl gerçekleştirileceği ve en önemlisi, IgE aracılı ilaç aşırı duyarlılık reaksiyonlarının IgE aracılı olmayanlardan nasıl ayırt edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, bazofil aktivasyon testinin ilaç alerjileri için uygulanabilirliğini, polen, gıda ve böcek alerjilerindeki mevcut kullanımının ötesine nasıl genişletebileceğinizi anlamış olmalısınız.

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Alerjik astım Deneysel fare modelleri hastalığı patogenezinde okuyan ve yeni ilaçlar geliştirmek için yeni olanaklar sunar. Bu modeller de alerjik immün yanıt, hava yolu inflamasyonu ve pulmoner patofizyolojisi yöneten ölçüm faktörleri için uygundur.

Alerjen Bağlı Astım murin Modeli

Bu videoda, bazofil degranülasyonunu indüklemek için bir antijenin alerjik potansiyelini değerlendirmek için bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. β-hekzosaminidaz, kimyasal aracı salınımının bir indeksi olarak kullanılır ve β-heksosaminidazın enzim aktivitesi, florojenik bir substrat kullanılarak ölçülür.

İnsanlaştırılmış Mediatör Enzim Salınım Testi: İn Vitro Bazofil Degranülasyon Yanıtını İzleyerek Test Antijeninin Alerjik Potansiyelini Taramak İçin İmmünokimyasal Bir Yöntem

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak bir test alerjeninin varlığında bazofil aktivasyonunu değerlendirmek için testi gösteriyoruz.

Flow Sitometri Kullanarak Bir Test Alerjeni Varlığında Bazofil Aktivasyonunun Analiz Edilmesi

Bu videoda, mikroakışkan kartuş tabanlı kemilüminesans sistemi kullanılarak seruma özgü immünoglobulin E'yi tespit etmek için bir protokol gösterilmektedir. Serum IgE'leri, kartuşun reaksiyon bölgesinde hareketsiz hale getirilen farklı alerjenlerle etkileşime girer ve bunlar daha sonra peroksidaz konjuge anti-IgE antikorları ve bir kemilüminesan substrat ile tespit edilir ve çoklu alerjene özgü IgE'lerin aynı anda saptanmasına izin verir.

Alerjene özgü immünoglobulin E için mikroakışkan kartuş tabanlı bir tespit sistemi

Mast hücreleri ve bazofillerin aktivasyonuyla karakterize alerjik tepkiler, IgE çapraz bağlanması ve proenflamatuar aracıların salınması ile tahrik edilmektedir. Alerjik tepkilerin bir kantitatif olarak değerlendirilmesi allerjen vasküler geçirgenlikte değişiklikleri izlemek için Evans mavisinin kullanılması sureti ile elde edilebilir.

Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur.  Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

Bu çalışma, Güney Çin'den allerjik rinit ve / veya astımlı bir hasta grubunda ot polen allerjenlerine duyarlılığı araştırmak için bileşen çözümü yaklaşımını kullanan bir protokolü açıklamaktadır.

Allerjik Rinit ve / veya Astımı olan Çinlilerin Çimen Poleni Allerjenleri Üzerine Bir Çalışma İçin Bileşen ile Çözümlenmiş Bir Teşhis Yaklaşımı

Bu kağıt bir mikrosıvısal kartuş tabanlı Kemiluminesan sistemi ve kullanışlılığı değerlendirilmesi ile serum özel immünglobulin E Anti tanılar algılamak için bir protokol sunar.

Biochip mikrosıvısal teknolojisi uygulama algılamak Serum alerjen özgü immünglobulin e (sIgE)

Bazofil aktivasyon testi, akım sitometrisi ile aktivasyon belirteçlerinin ölçülmesi yoluyla spesifik bir uyaran varlığında bazofil aktivasyonunun saptanmasına dayanan IgE aracılı alerjik reaksiyonların değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir in vitro tanı testidir.

Alerji Tanısı için Bazofil Aktivasyon Testi

Burada, tipik olarak tip 1 alerjik reaksiyonlarda gözlenen efektör hücrelerin degranülasyonunu simüle etmek için insan IgE reseptörü ile transfected bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattı kullanarak mediatör salınım testini sunuyoruz. Bu yöntem, alerjenlerin biyolojik aktivitesini son derece hassas, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir şekilde araştırır.

Alerjen Gücü için Okuma Olarak İnsanlaştırılmış Arabulucu Sürümü Tahlil

Öğrenin bazofil aktivasyon testi ile IgE aracılı ilaç aşırı duyarlılığını tespit etme yöntemini. İlaç-protein konjugatları üreterek alerji mekanizmalarını araştırabilirsiniz.

İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test

Daha fazla video keşfet