Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Bu prosedürün genel amacı, taze donmuş doku kesitlerinde mitokondriyal solunum enzimi eksikliklerinin doğrudan görüntülenmesine izin vermektir. Bu, önce ilgilenilen organdan kriyostat kesitlerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, Cox Histo Kimya'yı gerçekleştirmek ve ardından SDH Histo kimyasını yapmaktır.

Son olarak, doku bölümleri kurutulur, monte edilir ve kapak kaydırılır. Sonuç olarak, sonuçlar hücresel mavi boyama miktarı yoluyla mitokondriyal disfonksiyon miktarını gösterebilir. Hi.Today Cox SCH çift etiketleme HISTOKIMYASAL tekniği hakkında konuşacağız.

Bu yöntem mitokondri hastalıklarını incelemek için uygulanabilirken, yaşlanma ve yaşa bağlı bozukluklar hakkında da fikir verebilir. Etik izne uygun olarak kurban edilen bir hayvanın beynini çıkardıktan sonra, kuru buz üzerinde hızla dondurun. Donmuş doku eksi 80 santigrat derecede tutulabilir, bölünmeye hazır olana kadar alüminyum folyoya sarılabilir.

Beyni bir kriyostat aynasına yerleştirerek ve onu gömülü bileşikle çevreleyerek dokuyu kriyoseksiyon için hazırlayın. Mandreni hızlı bir şekilde kriyostata yerleştirin ve eksi 21 santigrat derecede 14 mikronluk bölümleri toplayın. Bölümleri bir ısıtma bloğu kullanarak slaytların üzerine çözün ve ardından slaytların oda sıcaklığında bir saat kurumasını bekleyin.

Slaytları ıslak kağıt şeritler içeren bir slayt boyama odasına yerleştirin. Bu tahlilde reaksiyon süreleri önemli olduğundan, kimyasal bir başlık altında deney başına en fazla 10 slaytın işlenmesi önerilir. PBS ve vortekste dab ve sitokrom C içeren inkübasyon hazırlayın.

Ortama hızlı bir şekilde iki mikrogram sığır CDE'si ekleyin ve girdaplama ile iyice karıştırın. Kaputun altında hala çalışan CDE'lerin tüm tanelerini parçalamak için, tüm bölümlere eşit şekilde yaymak için pipet ucunu kullanarak her slayta 150 ila 200 mikrolitre inkübasyon ortamı uygulayın. Slaytları 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin.

40 dakika sonra, inkübasyon ortamını slaytlardan çıkarın. Slaytları PBS'de her seferinde 10 dakika boyunca dört kez yıkayın. Slaytları yıkadıktan sonra, kimyasal bir başlık altında çalışan ıslak kağıt şeritleri ile slayt boyama odasına geri koyun.

NBT çözeltisini PBS'de hazırlayın, PMS'yi ışık girdabından korumaya özen göstererek, çözeltiyi tüm bölümlere eşit şekilde yaymak için pipet ucunu kullanarak her slayta hızlı bir şekilde 150 ila 200 mikrolitre NBT çözeltisi uygulayın. Slaytları 40 dakika sonra 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin, fazla çözeltiyi slaytlardan çıkarın. Slaytları PBS'de her seferinde 10 dakika boyunca dört kez yıkayın.

Aşağıdaki sıralı etanol konsantrasyonlarında slaytları her biri iki dakika boyunca kurutun. %70 %70 %95 %95 ve %99.5 Son olarak, %99,5'lik ek bir adımda 10 dakika bekleyin. Slaytları 10 dakika boyunca ksilen içine yerleştirin, LAN ile monte edin ve kapak fişlerini uygulayın.

Slaytların gece boyunca veya burada havalandırılan bir alanda en az bir ila iki saat kurumasına izin verin. Vahşi tip ve erken yaşlanmadan beyin bölümleri. MT. DNA Mutatör fareler, COX ve SDH aktiviteleri için sıralı olarak etiketlendi.

Koyu kahverengi lekelenme ile gösterilen normal Cox aktivitesi, vahşi tip farelerin hipokampusunda görülür. Mavi boyama ile gösterilen Cox eksiklikleri, 12 ve 46 haftalarda MT DNA mutasyona uğrayan farelerden alınan hipokampusta ortaya çıktı. M-T-D-N-A mutatör farelerde 46 haftalıkken Cox aktivitesinde daha fazla azalma oldu, bu da solunum zinciri disfonksiyonunun yaygın olarak alevlenmesini düşündürdü.

10 ve 25 dakikalık yetersiz inkübasyon süreleri, kahverengi dab reaksiyon ürününün birikiminin azalmasına neden oldu. Kısaltılmış inkübasyon süreleri, SDH inkübasyonu sırasında mavi Foran son ürününün oluşumuna izin verdi, bu da yanıltıcı bir şekilde COX eksikliği olan hücrelerin varlığını düşündürdü, kaymayı örtüyor. COX inkübasyonu sırasındaki slaytlar ayrıca DAB reaksiyon ürününün yanlış oluşumuna ve birikmesine neden oldu.

Cox ve SDH aktiviteleri burada gösterildiği gibi ayrı ayrı etiketlenebilse de, sıralı etiketlemenin mitokondriyal disfonksiyonu olan hücrelerin bulunmasında avantajlı olduğu kanıtlanmıştır. Vahşi tip bir fareden beyindeki COX ve SDH aktiviteleri için bir özgüllük kontrolü örneği, negatif etiketlemeyi gösterir. Bu nedenle, kimyasal protokol olan Cox SCH çift etiketlemesindeki kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olduğunu ve uygun laboratuvar kıyafetleri ve kimyasal başlığın altında çalışan bir maske giymek ve ayrıca inkübasyon ortamının atılması gibi önlemlerin bu testi her yaptığınızda yapılması gerektiğini unutmayın.