Sitokrom kullanarak Mitokondriyal Solunum Fonksiyon Görselleştirme C Oksidaz / Succinat Dehidrogenaz (COX / SDH) Çift-etiketleme Histokimya

Bu prosedürün genel amacı, taze dondurulmuş doku kesitlerinde mitokondriyal solunum enzim eksikliklerinin doğrudan görüntülenmesini sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili organdan kriyostat kesitleri alınarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı Cox histokimyasının uygulanmasıdır ve bunu SDH histokimyası takip eder.

Son olarak, doku kesitleriyye suyun uzaklaştırılır (dehidre edilir), lam üzerine yerleştirilir ve lamelle kapatılır. Nihayetinde sonuçlar, hücresel mavi boyanma miktarı üzerinden mitokondriyal disfonksiyon miktarını gösterebilir. Merhaba. Bugün Cox SCH çift etiketleme HISTOKİMYASAL tekniği hakkında konuşacağız.

Bu yöntem mitokondri hastalıklarını incelemek için uygulanabildiği gibi, yaşlanma ve yaşa bağlı bozukluklar hakkında da bilgi sağlayabilir. Etik izin uyarınca sakrifiye edilen bir hayvandan beyni çıkardıktan sonra, kuru buz üzerinde hızla dondurun. Dondurulmuş doku, kesit alma aşamasına gelene kadar alüminyum folyoya sarılı halde -80 °C'de saklanabilir.

Beyni bir kriyostat tablasına yerleştirip etrafını gömme bileşiği ile çevreleyerek dokuyu kriyoseksiyon için hazırlayın. Tablayı hızla kriyostatın içine yerleştirin ve -21 °C'de 14 mikronluk kesitler alın. Kesitleri bir ısıtma bloğu kullanarak lamlar üzerine çözdürün ve ardından lamların oda sıcaklığında bir saat boyunca kurumasını bekleyin.

Slaytları, ıslak kağıt şeritleri bulunan bir slayt boyama haznesine yerleştirin. Bu analizde reaksiyon süreleri önemli olduğundan, bir kimyasal çeker ocak altında deney başına en fazla 10 slaytın işlenmesi önerilir. PBS içinde dab ve sitokrom C içeren inkübasyon besiyerini hazırlayın ve vorteksleyin.

Besiyerine hızlıca iki mikrogram bovine CDE ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. Halen steril kabin altında çalışırken, CDE granüllerinin tamamını dağıtmak için her slayta 150 ila 200 mikrolitre inkübasyon besiyeri uygulayın ve pipet ucuyla tüm bölümlere eşit şekilde yayın. Slaytları 37 derece Celsius'ta 40 dakika boyunca inkübe edin.

40 dakika sonra, inkübasyon ortamı lamlardan uzaklaştırılır. Lamlar, her biri 10 dakika sürecek şekilde dört kez PBS ile yıkanır. Yıkama işleminden sonra lamlar, kimyasal çeker ocak altında çalışılarak, ıslak kağıt şeritlerin bulunduğu lam boyama haznesine geri yerleştirilir.

PMS'yi ışıktan korumaya dikkat ederek NBT çözeltisini PBS içinde hazırlayın ve çözeltiyi hızlıca vorteksleyin. Pipet ucunu kullanarak, NBT çözeltisinden her slayta 150 ila 200 µL uygulayın ve tüm kesitlere eşit şekilde yayın. Slaytları 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin; 40 dakika sonra, slaytlardaki fazla çözeltiyi uzaklaştırın. Slaytları, her biri 10 dakika sürecek şekilde dört kez PBS ile yıkayın.

Lamları sırasıyla aşağıdaki etanol konsantrasyonlarında ikişer dakika boyuncayedehidre edin: 70%, 70%, 95%, 95% ve 99.5%. Son olarak, ek bir 99.5% adımında 10 dakika bekletin. Lamları 10 dakika boyunca ksilen içinde tutun, LAN ile monte edin ve lamel uygulayın.

Lamların burada, havalandırmalı bir alanda gece boyunca veya en az bir ila iki saat kurumaya bırakın. Vahşi tip ve erken yaşlanan MT.DNA Mutator farelerin beyin kesitleri, sırasıyla COX ve SDH aktiviteleri için işaretlendi.

Yabani tip farelerin hipokampusunda, koyu kahverengi boyanma ile belirtilen normal Cox aktivitesi görülmektedir. 12 ve 46 haftalık MT DNA mutator farelerin hipokampusunda, mavi boyanma ile belirtilen Cox eksiklikleri ortaya çıkmıştır. M-T-D-N-A mutator farelerde 46 haftalık yaşa gelindiğinde Cox aktivitesinde görülen daha belirgin azalma, solunum zinciri disfonksiyonunun yaygın bir şekilde şiddetlendiğini göstermektedir.

10 ve 25 dakikalık yetersiz inkübasyon süreleri, kahverengi DAB reaksiyon ürününün çökelmesinde azalmaya neden olmuştur. Kısa inkübasyon süreleri, SDH inkübasyonu sırasında mavi Foran uç ürününün oluşmasına izin vererek, yanıltıcı bir şekilde COX eksikliği olan hücrelerin varlığını düşündürmüştür. COX inkübasyonu sırasındaki lamlar da DAB reaksiyon ürününün hatalı oluşumuna ve çökelmesine yol açmıştır.

Cox ve SDH aktiviteleri burada gösterildiği gibi ayrı ayrı etiketlenebilse de, ardışık etiketlemenin mitokondriyal disfonksiyona sahip hücrelerin konumlandırılmasında avantajlı olduğu kanıtlanmıştır. Yabani tip bir farenin beynindeki COX ve SDH aktiviteleri için bir özgüllük kontrolü örneği negatif etiketleme göstermektedir. Dolayısıyla, Cox SCH çift etiketlemesindeki kimyasallarla çalışmanın ve kimyasal protokolün son derece tehlikeli olduğunu; uygun laboratuvar kıyafetleri ve maske giyilmesi, kimyasal çeker ocak altında çalışılması ve inkübasyon ortamının bertaraf edilmesi gibi önlemlerin bu testi her gerçekleştirdiğinizde uygulanması gerektiğini unutmayın.