Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, belirli genetik mutasyonların vasküler gelişim ve yapı üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu, enjeksiyon için uygun bir örnek sağlamak amacıyla embriyonun ve embriyo dışı dokuların birlikte diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sağlam vaskülatürü işaretlemek için fasiyal vene floresan bir boya enjekte edilir.

Ardından embriyo analiz için hazırlanır. Son olarak, işaretlenmiş damar sisteminin bütünsel montajları (hole mount) veya kesitleri, bütünsel montaj veya doku kesitlerinin immunofloresan mikroskobisi temelinde normal damar sisteminin üç boyutlu yapısını göstermek için görüntülenir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, periferik damar sisteminin anjiyogenez yoluyla timuse bağlandığı gelişimsel zaman noktasını belirlemekle ilgilendiğimde edindim.

Başlamak için, 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpü içerisinde PBS içinde FXI dekstran veya GS L one I selectin B four hazırlayın; FXI dekstrana 100 µL stok 1,25 mM fast green PBS, GS L one I selectin B four'e ise 180 µL ekleyerek çözeltilerin görünür şekilde mavi olmasını sağlayın. Ardından, tüpü 37 °C'ye kadar ısıtın.

E 14.5 ile E 18.5 embriyolarını ve vitellus keselerini, Allantoic sapıye dokunmadan birlikte disseke edin. Embriyoları yeni bir Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığındaki PBS içine daldırın. Ardından, yüzün sagital görünümünü elde etmek için bir embriyoyu konumlandırın.

Ardından, mikro diseksiyon pensi ile embriyoyu baş kısmından nazikçe kavrayın. 30 gauge bir iğne kullanarak, iğneyi başın arka kısmına doğru yönlendirerek fasial vene 50 µL FXI dekstran veya GS L one I selectin B four enjekte edin. Boya umbilical vende görünür olduğunda, iğneyi çıkarın ve embriyoyu lan'dan ayırın.

Boyama işlemi. Boyanın embriyo boyunca dolaşması için embriyoyu oda sıcaklığındaki PBS içinde iki ila üç dakika bekletin. Boyanın embriyo boyunca dolaşmasına izin verdikten sonra; ekstremiteler, sırt ve karın bölgelerinden deri örnekleri alın.

Deri örneklerini soğuk PBS ile yıkayın ve iki saat boyunca %4 paraldehit PBS içinde sabitleyin. Ardından, iki mililitre soğuk PBS içeren dört mililitrelik şeffaf tüplerde, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın. Deri örneklerini mikroskop lamlarına yerleştirin ve her lama 100 mikrolitre kapatma medyumu ekleyip üzerini lameliyle kapatın.

Cilt vaskülatürünün daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri için BABB ile şeffaflaştırma ve ardından konfokal görüntüleme yapılmadan önce lamların karanlıkta kurumasına izin verin. Dokuları kriyoseksiyonlama için hazırlamak amacıyla, bütün embriyoları kriyoseksiyonlama için sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Bir kesit bloğunun üzerine OCT sürün ve embriyoyu yerleştirin.

Dondurulmuş dokuyu 10 mikron kalınlığında kesitler halinde kesin ve lamlar üzerine toplayın. Kesitleri beş ila 10 dakika boyunca asetonda fikse edin, ardından bir nem odası içerisinde soğuk TBS blokunda üç kez yıkayın ve TBS içinde %10 Donkey serum ile inkübe edin. Oda sıcaklığında, her bir kesite 100 mikrolitre primer antikor ekleyin.

Bu örnekte, antikorun kesit boyunca homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için endotelyumu işaretlemek amacıyla sıçan anti-US CD 31 ve perivasküler hücreleri işaretlemek amacıyla keçi anti-US P-D-G-F-R beta kullanıyoruz. Lamları tek tek kesilmiş parafilm şeritleriyle kapatın. Lamları dört derece santigrat sıcaklıkta, bir nem odasında bir saatten bir geceye kadar inkübe edin.

Ardından, kesitleri soğuk TBS ile üç kez yıkayın. Uygun sekonder antikorların 100 µL'si ile en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, soğuk TBS ile üç kez yıkayın. Her lama 100 µL mounting medium ve bir lamel ekleyin.

Lamların karanlıkta kurumasına izin verin. Vibratom ile kesit alma işlemi için, embriyolardan timus loblarını diseke edin ve soğuk PBS ile durulayın. Dokuyu oda sıcaklığında iki saat boyunca %4 paraldehit PBS içinde fikse edin.

Numuneler PBS Triton X ile yıkandıktan sonra, küçük bir plastik kartuşu %4'lük düşük erime noktalı agar PBS ile doldurun. Numuneleri, dokunun kartuşun tabanıyla temas ettiğinden emin olarak agar PBS'ye daldırın. Agarın buz üzerinde katılaşmasını bekleyin.

Ardından, fazla agros kısmını kesmek için bir jilet kullanın. VIBRAM bloğuna yapıştırıcı sürün ve örneği bloğa yapıştırın. Örnek ve bıçak tamamen suya gömülene kadar Vibram su banyosuna soğuk PBS dökün.

Hızı ve genliği ayarlayın. Genlik azaltılmalıdır. Aşırı çalkalanma nedeniyle kesitler parçalanırsa, dokudan 50 kesit alın.

Ardından, pens kullanarak kesitleri 24 kuyucuklu bir mikroplaka içerisindeki soğuk PBS'ye aktarın; kesitleri, PBS Triton X içinde %10'luk eşek serumunun 500 microliters miktarında bloklayın. Anti CD 31 ve anti P-D-G-F-R beta gibi primer antikorları ekledikten sonra, kapalı bir mikroplaka içerisinde dört degrees Celsius sıcaklıkta sekiz saat veya gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, dört degrees Celsius sıcaklıkta toplam sekiz saat boyunca PBS Triton X ile üç kez yıkayın.

Kesitleri tekrar bloke edip sekonder antikorlarla inkübe ettikten sonra, numuneleri dört santigrat derecede toplam sekiz saat boyunca PBS Triton X ile üç kez yıkayın. Ardından numuneleri buz üzerinde 4%paraldehyde PBS ile 30 dakika boyunca yeniden fikse edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca PBS Triton X ile üç kez daha yıkayın. Numuneleri, her adımda 10 dakika olacak şekilde dereceli bir metanol PBS Triton X serisi ileye dehidre edin.

Ardından %100 methanolu taze methanol ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Numuneyi cam bir çukur lam üzerine yerleştirin ve numuneyi BABB ile methanolun bire bir çözeltisiyle kaplayın. Numuneleri 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, solüsyonu %100 BABB ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika veya şeffaflaşana kadar inkübe edin. Bir lamel ekleyin ve iki ila üç kat oje ile mühürleyin. Ojenin oda sıcaklığında, karanlıkta sertleşmesini bekleyin.

Numune dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir, ancak görüntüleme 12 ila 24 saat içerisinde yapılmalıdır. 10 mikron kalınlığındaki dondurulmuş kesitleri, plan A per chromat 20x 0,8 objektifi ile 488, 543 ve 633 nanometre lazer hatlarını kullanan bir konfokal mikroskop ile görüntüleyin. Plan A per chromat 10x 0,4 objektifini 488, 543 ve 633 nanometre lazer hatları ile kullanarak, 50 mikron kalınlığındaki agar gömülü kesitlerin bir mikronluk konfokal Z kesitlerini elde edin. Seri Z kesitlerini Zeiss AIA vision 4.6 veya benzeri bir görüntü analiz yazılımı kullanarak yeniden yapılandırın. Embriyonik vaskülatürün etkili bir şekilde işaretlenmesi, embriyonik farelerdeki kan damarı kusurlarının değerlendirilmesi açısından kritiktir. Bu şekiller, E 16.5 timus kan damarlarının spesifik işaretlenmesini ve a GS L one I selectin'in birlikte işaretlenmesini göstermektedir.

CD 31 ile enjekte edilmiş B four embriyosu ile sağ ve sol ventriküllerin boyanması. Bu deneylerde, kriyoseksiyonlar için GSL one I selectin B four protokolü kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, E 16.5 farelerdeki deri kan damarı ağının bütün monte etme (whole mount) etiketlemesi burada gösterilmiştir.

Stromal hücrelerin ve kan hücrelerinin damarsal yapı ile birlikte eş etiketlenmesi gibi diğer yöntemler, hem normal hem de patolojik koşullar altında fare embriyosundaki kan hücrelerinin ve stromal hücrelerin damarsal yapı ile nasıl etkileşime girdiğine dair ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.