Name: Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Keşfedin embriyonik farelerde damar gelişimini incelemek için yüz venine floresan boya enjeksiyonu yöntemini. Bu teknik, üç boyutlu damar yapısını görselleştirerek genetik mutasyonların etkilerini analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser hibe numaraları R01AI055001 ve NIAID gelen UYM ve JLB için SREB Tezi Bursu Ödülü R01AI082127 tarafından desteklenmiştir.

1. Flöresein dekstran ve GSL I-isolectin B 4 yüz ven enjeksiyonlar embriyonik damar etiketlemek için etiketlenmiş <ol><li> Fosfat içinde FITC-dekstran (50ug/mL) hazırlayın Tamponlu Tuz (PBS) veya GSL 1 - isolectin B, bir 1,5 mL Eppendorf tüpü içinde PBS içinde 4 (20ug/200uL) ve 37 ° C'de sıcak Yeşil / PBS GSL 1. Yeşil / PBS FITC-Dekstran solüsyonunun (toplam hacmi 1 ml) ve stok 1.25mm Fast 180uL stok 1.25mm Fast 100ul Ekle - isolectin çözümdür böylece B 4 (toplam hacim 200ul), gözle görülür mavi. </li><li> Allantoik sapı (umblikal arter ve ven) zedelemeden, birlikte E14.5-E18.5 embriyo ve yolk kesesi teşrih. </li><li> Yeni bir Petrie tabak (60 X 15 mm) kadar embriyo transferi ve oda sıcaklığında PBS içinde sokmaktan. </li><li> Baş / yüzün sagittal bir görünüm sağlamak için embriyo yerleştirin. Yavaşça başında embriyo kavramak için mikro diseksiyon forseps kullanın. </li><li> Bir 30G iğne kullanarak, 50uL FITC-dekstran (50ug/mL) veya GSL enjekte1 - isolectin başın arkasına doğru iğne işaret fasiyal vene B 4 (200ul PBS 20ug). </li><li> Boya umbilikal ven görünür olduğunda, iğne kaldırmak ve allantoik sapı (umbilikal arter ve ven) gelen embriyo ayırın. </li><li> Enjeksiyonu takiben, embriyo boya dolaşır embriyo böylece 2-3 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde kalmasını sağlamaktadır. </li></ol> 2. Deri vaskülatürü Tüm montaj analizi <ol><li> Boya embriyo boyunca dolaşmaya izin verdikten sonra, sırt, bacakların bölgelerinden alınan deri örnekleri kaldırmak ve mide, vb 8,9. </li><li> Soğuk PBS içinde deri örneği yıkayın ve 2 saat 8,9 için% 4 PFA / PBS düzeltin. 10 dakika 2mL soğuk PBS ile 4 mL berrak flakonda her biri için 3 kere yıkayın. </li><li> Bir mikroskop yerleştirin deri örneği her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul kaydırın ve ekleyin. </li><li> Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin. </li><li> P2 'Image Acquisition' bölümüne Adım roceed. </li></ol> 3. Timus ve kalp damar ve cryosections için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam) <ol><li> Sıvı azot 'Flaş don' bütün embriyo. Embriyolar olması ve -80 ° C'de analize kadar saklanır olabilir. </li><li> Alternatif olarak, timus dışarı incelemek 4 ° C'de PBS ile yıkanır ve 2 saat boyunca 2mL% 4 paraformaldehit (PFA) / PBS içinde çözmek. -80 Kullanıma kadar soğuk PBS, OCT yer thymi ve dondurma ve mağaza ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın ° C </li><li> Cryosectioning için bir bölüm 'blok' üzerinde Ekim yaymak ve kesit için embriyo veya disseke organ / dokuların monte. </li><li> 10 mikron kalınlığında kesitler halinde dondurulmuş doku Kes ve slaytlar üzerinde toplamak. </li><li> 5-10 dakika aseton bölümler düzeltildi. Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında bir nem odası içinde% 10 eşek serum / TBS içinde engelleme. </li><li> Primer 100 ul ile 1 saatlik gecede için bölümler inkübe4 bir nem odası antikorlar ° C: Bu örnekte, biz etiket endotele Sıçan anti-fare CD31 (1:100) ve keçi anti-fare perivasküler hücreler etiketlemek için PDGFR-β (1:100) kullanın. Bu antikor düzgün bölümüne yayılmış olduğundan emin olmak için ayrı ayrı kesilmiş Parafilm şeritler ile slaytlar karşılamak için yararlıdır. </li><li> Primer antikor ile inkübasyondan sonra, soğuk TBS bölümler 3 kere yıkayın. En az 30 dakika için uygun sekonder antikor 100 ul ile inkübe edin. </li><li> Soğuk TBS içinde 3 kere yıkayın. Her slayt ve kapak cam montaj medya 100 ul ekleyin. </li><li> Slaytlar karanlık bir depolama alanında kurumasını bekleyin. </li><li> 'Image Acquisition' bölümüne geçin. </li></ol> 4. Timus ve damarsal vibratome bölümleri için perivasküler hücrelerin Çok renkli etiketleme (Bölüm 1, Adım 7 Devam) <ol><li> Embriyodan timus lobları dışarı inceleyin ve soğuk PBS içinde yıkayın. </li><li> 2 saat için oda sıcaklığında% 4 PFA / PBS içinde timus saptamaks. </li><li> PBS-Triton X (0.15%) 3 kez, 10 dakika ve erime düşük 4% küçük bir plastik kartuş ve batığın yerini thymi yıkayın agaroz / PBS (~ 4 ° C). Timus kartuşun dibi ile temas halinde olmalıdır. </li><li> Agaroz buz (3-5 dakika) katılaşmaya bırakın. Aşırı agaroz kesmek için jilet kullanın. Vibratome blok tutkal ekleyin ve blok numune uygun. </li><li> Örnek ve bıçak batırılır kadar vibratome su banyosuna soğuk PBS ekleyin. </li><li> Hız ve genlik (yüksek genlikli ve düşük-orta hızda yumuşak timus bölümleri için idealdir) ayarlayın. Bölümlerde aşırı ajitasyon nedeniyle break up genliği azaltılmalıdır. </li><li> 50 um bölümleri kesiniz. </li><li> Bir fırça kullanarak, soğuk PBS içinde 24-kuyu mikroplak bölümler toplamak. </li><li> 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum ve 500 ul içinde blok bölümleri. </li><li> Bu tür anti-CD31 ve anti-PDGFR-β gibi birincil antikor ile bir gece 8 saat için bölümler için, inkübe, Kapalı bir 24-çukurlu bir mikrolevhadaki. </li><li> 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın </li><li> 30 dakika boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde% 10 eşek serum içinde blok bölümleri. </li><li> 8 saat bölümler inkübe 4 gecede ° C uygun ikincil antikor ile. </li><li> 4 ° C'de 8 saatlik bir toplam boyunca PBS-Triton X (% 0.15) içinde 3 kere yıkayın </li><li> Re-fix örneklerinde% 4 PFA / buz üzerinde 30 dakika süreyle PBS. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika PBS-Triton X (0.15%) 3 kez yıkayın. </li><li> % 25 MeOH,% 50 MeOH,% 75 MeOH, ve her adım için 10 dakika sonra% 100 MeOH: bir aşamalı MeOH / PBS-Triton X dizi örnekleri kurutmak. 10 dakika sonra taze MeOH ile% 100 MeOH değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edilir. </li><li> Bir cam kapta, mix Babb (Benzil Alkol: Benzil Benzoat) 1:2 oranında. Babb% 50 ve% 50 MeOH bir nihai konsantrasyon için MeOH ile Babb birleştirin. 10-15 dakika MeOH: Babb örnek inkübe edin. </li><li> Transferi sa10-15 dakika için% 100 Babb ve inkübe ile bir cam kap için mple veya kadar oda sıcaklığında, temizlenir. </li><li> Tarafı taze% 100 Babb ve transfer örneği ile depresyon slayt (0.7mm derinlik) doldurun. Cam (No 1.5) kapak ve oje 2-3 kat ile mühür ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta sertleşmesine oje bırakın ve daha sonra 4 ° C'de örnek saklamak Not: Slaytlar tamamen konfokal görüntü alımı öncesinde kapatılmalıdır. Floresan boyalar Babb fade gibi Görüntüler, 12-24 saat içinde satın alınmalıdır. </li><li> 'Image Acquisition' bölümüne geçin. </li></ol> 5. Görüntü edinimi <ol><li> Görüntü 10 488 ile Plan-Apochromat 20X/0.8 nesnel (512 X 512 piksel) kullanarak bir konfokal mikroskop ile mikron frozen - (FITC-dextran/GSL 1 - B 4 isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler. </li><li> Plan-Apochroma kullanarak bütün montaj cilt ve 50 mikron agaroz-gömülü kesitlerin konfokal z bölümler Edinme t 10X/0.4 488 ile nesnel (512 X 512 piksel) - (FITC-dextran/GSL 1 - B 4 isolectin), 543 - ve 633-nm lazer çizgiler. Seri Z bölümleri ilgili her kanal için 1 mikron sıralı olarak toplanmalıdır. </li><li> Seri Yeniden İnşa Zeiss Axiovision 4.6 ya da diğer görüntü analiz yazılımı kullanılarak Z-bölümler. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Embriyonik damar Verimli etiketleme embriyonik farelerde kan damarı kusurları değerlendirmek için önemlidir. Şekil 1, sırasıyla sağ ve sol ventrikül (1E-F) arasında boyama ek olarak, özel E16.5 timüs kan damarlarının etiketleme (1A-B) ve CD31 (1B) ile birlikte etiketleme, göstermektedir. Gibi bölümlere 1, 3 içinde belirtilen cryosections ve 5 için GSL I-isolectin B 4 protokol bu deneylerde kullanılmıştır. Bütün monte edilir, E16.5 fareler üzerinde cilt kan damar ağının bölümleri etiketleme 1, 2 içerisinde tarif edilen protokoller kullanılarak, ve 5, şekil 1C-B 'de gösterilmiştir. ntent "&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> 1. Legend Şekil. FITC GSL I - E16.5 fare embriyolarına isolectin B 4 yüz ven enjeksiyonlar. embriyonik kalp e enjeksiyonu takiben embriyonik Timus bir. Cryosection. b. isolectin B 4 CD31 ko-etiketleme Birleştirme. c. ve d. embriyonik deri vaskülatürü aşağıdaki enjeksiyon Tüm montaj. e. ve f. Cryosection. (sağ ventrikül) f. (sol ventrikül) aşağıdaki enjeksiyon.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bölümlerde Tüm-mount ve PECAM-1 (CD31) boyama embriyonik farelerde damar etiketleme için geleneksel yöntemler vardır. Bu yöntemler doğrudan ve / veya dolaylı immunfloresan ve deterjan kullanımı fare doku geçirgenliği gerektirir. Bu oldukça zamanında süreç olduğunu kanıtlıyor. Burada, FITC-dekstran ya isolectin B 4 yüz damar enjeksiyonu doğrudan böylece antikor etiketleme adımlar için ihtiyacı ortadan kaldırarak, embriyonik damar etiketlemek için istihdam var. &#39;Sızdıran&#39; fenotipleri bu yöntemle ancak k...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> FITC-dekstran </td><td> Sigma </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> Flöresein GSL 1 etiketli - B 4 isolectin </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biyolojik </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Optimal Kesme Sıcaklık Bileşik (OCT </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> JT Baker </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> Eşek Serum </td><td> Jackson </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> Sıçan anti-fare CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> keçi anti-fare PDGFR-β </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> eşek anti-fare CD31 Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> eşek anti-keçi Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> Triton X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> Düşük erime agaroz / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> Benzil Alkol </td><td> Acros Bilimsel </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> Benzil Benzoat </td><td> Acros Bilimsel </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> Depresyon slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> Cam (22x22) -1.5 Kapak </td><td> Termo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 Meta Konfokal Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Mikro diseksiyon forseps </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm No OM992 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 ve 24 de mikroplaklar </td><td> Evergreen Bilimsel </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / Artı Mikroskop Slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4 mL berrak şişeleri </td><td> Ulusal Bilimsel </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

embriyonik farelerde damarları etiketleme bir yöntem

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Fonksiyonel bir damar ağının kurulması organogenez önemli bir parçası olduğunu ve optimal organ fonksiyonları için gereklidir. Örneğin, timüs uygun damar oluşumu ve dokusunda organ ve çevre için olgun T-hücresi çıkışında içine timosit giriş için gereklidir. Timus kan damarlarının mekansal düzenleme yerel mikroçevrede, yani timik epitel hücreleri (TEC) gelen sinyalleri bağlıdır. Birkaç yeni raporlar timus damar kusurları 1,2 bu sinyallerin sonuçları bu bozulma göstermektedir. Önceki çalışmalarda yenidoğan ve yetişkin timus damar 1,2 etiketlemek için kullanılan teknikler tarif var. Biz burada embriyonik timus kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir tekniği göstermek. Yüz damar enjeksiyonu ve CD31 antikor boyama timüs va tespit etmek - bu yöntem simplicifolia lektin I (isolectin B 4 GSL 1) FITC-dekstran ya da Griffonia (Bandeiraea) kullanılması birleştirirscular yapıları ve PDGFR-β timik perivasküler mezenşimi 3-5 etiketlemek için. Cryosections veya vibratome bölümleri kullanma seçeneği de sağlanır. Bu protokol, timüs kan damarı oluşumuna TEC-türetilen molekülleri rollerin tanımlanması için kritik olan timus damar bozuklukları, belirlemek için kullanılabilir. Yöntemi, tüm damar etiket olarak, aynı zamanda deri ve kalp 6-10 içeren embriyo boyunca birden fazla organ ve dokularda damar ağları analiz etmek için de kullanılabilir.

Bu makale, embriyonik deri ve timüs kan damarlarının etiketlenmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Fonksiyonel bir kan damarı ağının oluşturulması, organogenezin temel bir parçasıdır ve optimal organ fonksiyonu için gereklidir. Örneğin, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, belirli genetik mutasyonların vasküler gelişim ve yapı üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu, enjeksiyon için uygun bir örnek sağlamak amacıyla embriyonun ve embriyo dışı dokuların birlikte diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, sağlam vaskülatürü işaretlemek için fasiyal vene floresan bir boya enjekte edilir.Ardından embriyo analiz için hazırlanır. Son olarak, işaretlenmiş damar sisteminin bütünsel montajları (hole mount) veya kesitleri, bütünsel montaj veya doku kesitlerinin immunofloresan mikroskobisi temelinde normal damar sisteminin üç boyutlu yapısını göstermek için görüntülenir. Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, periferik damar sisteminin anjiyogenez yoluyla timuse bağlandığı gelişimsel zaman noktasını belirlemekle ilgilendiğimde edindim.Başlamak için, 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpü içerisinde PBS içinde FXI dekstran veya GS L one I selectin B four hazırlayın; FXI dekstrana 100 µL stok 1,25 mM fast green PBS, GS L one I selectin B four'e ise 180 µL ekleyerek çözeltilerin görünür şekilde mavi olmasını sağlayın. Ardından, tüpü 37 °C'ye kadar ısıtın.E 14.5 ile E 18.5 embriyolarını ve vitellus keselerini, Allantoic sapıye dokunmadan birlikte disseke edin. Embriyoları yeni bir Petri kabına aktarın ve oda sıcaklığındaki PBS içine daldırın. Ardından, yüzün sagital görünümünü elde etmek için bir embriyoyu konumlandırın.Ardından, mikro diseksiyon pensi ile embriyoyu baş kısmından nazikçe kavrayın. 30 gauge bir iğne kullanarak, iğneyi başın arka kısmına doğru yönlendirerek fasial vene 50 µL FXI dekstran veya GS L one I selectin B four enjekte edin. Boya umbilical vende görünür olduğunda, iğneyi çıkarın ve embriyoyu lan'dan ayırın.Boyama işlemi. Boyanın embriyo boyunca dolaşması için embriyoyu oda sıcaklığındaki PBS içinde iki ila üç dakika bekletin. Boyanın embriyo boyunca dolaşmasına izin verdikten sonra; ekstremiteler, sırt ve karın bölgelerinden deri örnekleri alın.Deri örneklerini soğuk PBS ile yıkayın ve iki saat boyunca %4 paraldehit PBS içinde sabitleyin. Ardından, iki mililitre soğuk PBS içeren dört mililitrelik şeffaf tüplerde, her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın. Deri örneklerini mikroskop lamlarına yerleştirin ve her lama 100 mikrolitre kapatma medyumu ekleyip üzerini lameliyle kapatın.Cilt vaskülatürünün daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri için BABB ile şeffaflaştırma ve ardından konfokal görüntüleme yapılmadan önce lamların karanlıkta kurumasına izin verin. Dokuları kriyoseksiyonlama için hazırlamak amacıyla, bütün embriyoları kriyoseksiyonlama için sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Bir kesit bloğunun üzerine OCT sürün ve embriyoyu yerleştirin.Dondurulmuş dokuyu 10 mikron kalınlığında kesitler halinde kesin ve lamlar üzerine toplayın. Kesitleri beş ila 10 dakika boyunca asetonda fikse edin, ardından bir nem odası içerisinde soğuk TBS blokunda üç kez yıkayın ve TBS içinde %10 Donkey serum ile inkübe edin. Oda sıcaklığında, her bir kesite 100 mikrolitre primer antikor ekleyin.Bu örnekte, antikorun kesit boyunca homojen bir şekilde yayılmasını sağlamak için endotelyumu işaretlemek amacıyla sıçan anti-US CD 31 ve perivasküler hücreleri işaretlemek amacıyla keçi anti-US P-D-G-F-R beta kullanıyoruz. Lamları tek tek kesilmiş parafilm şeritleriyle kapatın. Lamları dört derece santigrat sıcaklıkta, bir nem odasında bir saatten bir geceye kadar inkübe edin.Ardından, kesitleri soğuk TBS ile üç kez yıkayın. Uygun sekonder antikorların 100 µL'si ile en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, soğuk TBS ile üç kez yıkayın. Her lama 100 µL mounting medium ve bir lamel ekleyin.Lamların karanlıkta kurumasına izin verin. Vibratom ile kesit alma işlemi için, embriyolardan timus loblarını diseke edin ve soğuk PBS ile durulayın. Dokuyu oda sıcaklığında iki saat boyunca %4 paraldehit PBS içinde fikse edin.Numuneler PBS Triton X ile yıkandıktan sonra, küçük bir plastik kartuşu %4'lük düşük erime noktalı agar PBS ile doldurun. Numuneleri, dokunun kartuşun tabanıyla temas ettiğinden emin olarak agar PBS'ye daldırın. Agarın buz üzerinde katılaşmasını bekleyin.Ardından, fazla agros kısmını kesmek için bir jilet kullanın. VIBRAM bloğuna yapıştırıcı sürün ve örneği bloğa yapıştırın. Örnek ve bıçak tamamen suya gömülene kadar Vibram su banyosuna soğuk PBS dökün.Hızı ve genliği ayarlayın. Genlik azaltılmalıdır. Aşırı çalkalanma nedeniyle kesitler parçalanırsa, dokudan 50 kesit alın.Ardından, pens kullanarak kesitleri 24 kuyucuklu bir mikroplaka içerisindeki soğuk PBS'ye aktarın; kesitleri, PBS Triton X içinde %10'luk eşek serumunun 500 microliters miktarında bloklayın. Anti CD 31 ve anti P-D-G-F-R beta gibi primer antikorları ekledikten sonra, kapalı bir mikroplaka içerisinde dört degrees Celsius sıcaklıkta sekiz saat veya gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, dört degrees Celsius sıcaklıkta toplam sekiz saat boyunca PBS Triton X ile üç kez yıkayın.Kesitleri tekrar bloke edip sekonder antikorlarla inkübe ettikten sonra, numuneleri dört santigrat derecede toplam sekiz saat boyunca PBS Triton X ile üç kez yıkayın. Ardından numuneleri buz üzerinde 4%paraldehyde PBS ile 30 dakika boyunca yeniden fikse edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca PBS Triton X ile üç kez daha yıkayın. Numuneleri, her adımda 10 dakika olacak şekilde dereceli bir metanol PBS Triton X serisi ileye dehidre edin.Ardından %100 methanolu taze methanol ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Numuneyi cam bir çukur lam üzerine yerleştirin ve numuneyi BABB ile methanolun bire bir çözeltisiyle kaplayın. Numuneleri 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, solüsyonu %100 BABB ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika veya şeffaflaşana kadar inkübe edin. Bir lamel ekleyin ve iki ila üç kat oje ile mühürleyin. Ojenin oda sıcaklığında, karanlıkta sertleşmesini bekleyin.Numune dört derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir, ancak görüntüleme 12 ila 24 saat içerisinde yapılmalıdır. 10 mikron kalınlığındaki dondurulmuş kesitleri, plan A per chromat 20x 0,8 objektifi ile 488, 543 ve 633 nanometre lazer hatlarını kullanan bir konfokal mikroskop ile görüntüleyin. Plan A per chromat 10x 0,4 objektifini 488, 543 ve 633 nanometre lazer hatları ile kullanarak, 50 mikron kalınlığındaki agar gömülü kesitlerin bir mikronluk konfokal Z kesitlerini elde edin. Seri Z kesitlerini Zeiss AIA vision 4.6 veya benzeri bir görüntü analiz yazılımı kullanarak yeniden yapılandırın. Embriyonik vaskülatürün etkili bir şekilde işaretlenmesi, embriyonik farelerdeki kan damarı kusurlarının değerlendirilmesi açısından kritiktir. Bu şekiller, E 16.5 timus kan damarlarının spesifik işaretlenmesini ve a GS L one I selectin'in birlikte işaretlenmesini göstermektedir.CD 31 ile enjekte edilmiş B four embriyosu ile sağ ve sol ventriküllerin boyanması. Bu deneylerde, kriyoseksiyonlar için GSL one I selectin B four protokolü kullanılmıştır. Bu prosedürün ardından, E 16.5 farelerdeki deri kan damarı ağının bütün monte etme (whole mount) etiketlemesi burada gösterilmiştir.Stromal hücrelerin ve kan hücrelerinin damarsal yapı ile birlikte eş etiketlenmesi gibi diğer yöntemler, hem normal hem de patolojik koşullar altında fare embriyosundaki kan hücrelerinin ve stromal hücrelerin damarsal yapı ile nasıl etkileşime girdiğine dair ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

a-method-for-labeling-vasculature-in-embryonic-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz bir bütün montaj immünohistokimya tanıtmak ve lazer fare embriyonik ekstremite cilt karmaşık damar ağı oluşumunu analiz etmek için birden fazla etiketleme ile konfokal mikroskopi tarama.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Bu protokol, farelerde hamilelik sırasında maternal vaskülatürdeki değişiklikleri değerlendirmek için bir tekniği tanımlar. Stereolojik yöntemler kullanılarak, desidual spiral arterlerin yeniden şekillenmesi kantitatif olarak değerlendirildi ve sonuçlar immünohistokimya kullanılarak kalitatif olarak doğrulandı.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.

Kardiyak Morfoloji Ekokardiyografik ve histolojik muayene fare

Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Vasküler demans ve Alzheimer hastalığı modellemesi için kullanılabilecek serebrovasküler disfonksiyonu araştırmak için bir model olarak farelerde kimyasal olarak indüklenen büyük kan damarı dilatasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca, silikon kauçuk bileşiği enjekte ederek ve kan damarı boyutundaki değişiklikleri ölçmek için net bir görsel rehberlik sağlayarak damar sistemini görselleştirmeyi de gösteriyoruz.

Büyük Damar Aracılı Serebrovasküler Disfonksiyonu Modellemek için Farelerde Dolichoectaziyi İndüklemek İçin Görsel Bir Yaklaşım

Bu protokol, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak kantitatif tam montajlı üç boyutlu vasküler görüntüleme için hızlı bir yöntem sunar. Yöntemin etkinliği, civciv embriyo modelinin faringeal ark arter sistemi kullanılarak, hesaplamalı akışkanlar dinamiği yoluyla ölçülen hemodinamik kuvvetler ile gösterilmiştir.

Kantitatif Çalışmalar için Küçük Hayvan Damar Sisteminin Hızlı Tam Montajlı Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Keşfedin embriyonik farelerde damar gelişimini incelemek için yüz venine floresan boya enjeksiyonu yöntemini. Bu teknik, üç boyutlu damar yapısını görselleştirerek genetik mutasyonların etkilerini analiz etmenizi sağlar.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet