Name: Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, kültür nöronların elektrofizyolojik aktivitesini planer patch-klemp çipleri kullanarak nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem iyon kanalı fonksiyonlarını ve sinaptik iletişimi in vivo çalışmalar için optimize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar imalat montaj ile yardım için yama klemp Rütbeni fişleri ve Hue Tran, Ping Zhao ve Matthew Shiu, Alexei Bogdanov dolayı teşekkür etmek istiyoruz. Naweed Syed Sağlık Araştırması (CIHR) hibe Kanada Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Collin Luk NSERC ve Tıbbi Araştırma Enstitüsü (AHFMR) studentships Alberta Heritage Vakfı alıcı.

1. Chip imalat 3 mikron kalınlığında kendi başına durabilen bir film, düşük 1 Mohm erişim direnci ve hücre 9 ile samimi bir mühür kolaylaştıran bir düz yüzeyli huni şekilli diyafram 6 sonuç açıklanan süreç, şekil 2'ye bakınız. Cips çipi bir yeraltı kanalına bağlayan bir delik karşı karşıya diyafram ile singulated ve pleksiglas paketleri yapıştırılmalıdır. Yapıştırma nominal 17 pF, şant kapasitans en aza indirir bir şekilde dağıtılır. Paketleri iki adet 1.5 mm çapında ve akışkan limanlar olarak 6 mm uzunluğunda cam tüpler (Şekil 3) ile donatılmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2."> Şekil 2 yama klemp bir NRCC çip odaklı iyon demeti bölümünde elektron mikroskobu Tarama yumuşak bir silikon dioksit yüzey ve samimi hücre bağlantıları yana huni şekli ve sığ bir delik düşük bir erişim dayanımı hesapları olduğunu gösterire. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2."> Şekil 3,, yeraltı akışkansal ve cam tüpler ile donatılmış bir Pleksiglas paketi, bir çip içinde, kültür flakonun dibinde yapıştırılır. 2. Sterilizasyon, doldurma ve test Aşağıdaki adımları, diyafram kirlenme veya tıkanmayı önlemek için bir biyoloji güvenlik kabini yapılmalıdır. <ul type="disc"><li> 18 W. Diğer hava plazma sistemleri maksimum güçte 15 dakika için 0.1-0.3 mbar artık hava basıncı ile harrick temel plazma temizleyici (www.harrickplasma.com) cips sterilize karşılaştırılabilir güç yoğunluğu (24 mW ile kullanılabilir / cm 3) ve güç yoğunluğu ve ürünün sabit tutmak. Plazma tedavisi de astar kolaylaştıran, cips hidrofilik vermektedir. </li><li> Steril silastik Laboratuvar silikon tüp, 1mm ID x 2mm OD (Cole Parmer cam tüpler FitCat. # 96115-08) bir tarafında, 3 inç, diğer tarafta 1 inç. </li><li> Hiçbir kabarcık tutulur emin olun, steril filtre standart Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ile tüpler aracılığıyla akışkansal doldurun. </li><li> 1 atm kısa kenarı PBS basınçlandırma ise uzun silikon tüp Clip. Delikten sızan, PBS bir havuz, flakon görünür olabilir. PBS basınçlı kaynağı Klip ve bu kaynağı kısa bir silikon tüp ayırmak. </li><li> Flakon, PBS bir şırınga kullanılarak filtrelendiğini ile doldurun. </li><li> Cl kısa tüp elektrot ve bir şişe içinde bir karşı elektrot ve Ag / Ag bırakın. 10pF ve 25pF arasında 300kohm ve 3Mohm ve şant kapasitans arasındaki empedans metre erişim direnci olduğunu onaylamak için kullanılır. Düşük bir dirence sahip bir çip, bir kaçak olması muhtemeldir ve bu hücrenin elektrofizyoloji 6 hızlı dinamikleri yakalamak olmayabilir gibi yüksek bir kapasitans kullanım için uygunsuz olarak kabul edilir. Daha düşük bir kapasitans ile bir yongaveya daha yüksek bir direnç, bir kabarcık delik içinde sıkışıp basitçe olabilir rağmen, takılı olarak kabul edilir. Bazı yonga, 1H sonra yeniden test edilmiş ve doğru elektrokimyasal empedans sahip bulundu. </li><li> Akışkan kanalı steril deiyonize su ile yıkayın; üst flakonun boşaltılması ve aynı iki kez durulayın. </li><li> Steril deiyonize su ile dolu steril bir kapta diğer çipleri ile yüklemek taze steril deiyonize su tüpleri ile paketlenmiş yonga sonra 30 dakika bırakın. Bu çipleri hidrofilik ve kirlenmeye karşı korunuyor kalmasını sağlar. </li></ul> 3. Hücre biyolojisi laboratuvarı cips hazırlama Aşağıdaki adımları aseptik teknikler kullanarak bir HEPA filtreli laminer akış kaputu yapılmaktadır, bu yordamı kullanılan tüm çözümler 0.22μm bir filtre kullanarak kullanmadan önce sterilize filtre edilmesi gerekir. <ul type="disc"><li> HEPA filtreli bir laminer akış kaputun altında bir çip kutuyu açın ve conta fişleri kaldırmakasimtotik üst şişeye mümkün yüzen kirletici karıştırıyordu önlemek için yüz aşağı. </li><li> Çip yüzeyde herhangi bir kalıntı enkaz kaldırmak için taze filtre steril deiyonize su ile çip 2x flakon üst durulayın. </li><li> Üst flakon kapalı steril deiyonize su aspire edin. </li><li> Silastik hortumu arasında akışkan kanalı steril süzülmüş deiyonize su içeren basınçlı bir şırınga ekli bir ucunu. Sistemimizde, solüsyonuyla doldurulmuş şırıngalar 20psi üzere ayarlanmış bir sıkıştırılmış hava tankı için bir bağlantı ile basınçlı hale gelirler. Sterilite sağlamak için, hava şırınga girmesinden önce (0.22 mikron filtre) filtre edilmiş ve bizim sistemi de gerektiğinde bize baskı durdurmak veya uygulamak için izin veren bir açma / kapama vanası vardır. </li><li> Hortumu arasında çıkış ucu kullanarak, bir hemostat kelepçe. </li><li> Çözüm basınç / vanaları kapatın açın. </li><li> Taze steril deiyonize su ile çip subterranen akışkan durulama, boru çıkış çözülme. </li><li> Için içindiyafram aracılığıyla ce su, bir hemostat ile boru çıkış sonunda kelepçe. </li><li> Suyu drenajı önlemek için bir hemostat birlikte, boru giriş ve çıkış uçları kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. </li><li> Şırıngadan boru giriş sonuna ayırın. </li><li> Hortumun her iki ucunda cam fişleri takın ve hemostat çıkarın. </li><li> Üst flakon, filtre steriled deiyonize su ile doldurun. </li><li> 35 mm steril çanak kapağı 100 mm steril çanak üssü haline getirin </li><li> 100 mm çanak kapağı ile 35 mm kapak ve kapağın üstünde yer çip. </li><li> Görüntü cips cips membran ve diyafram enkaz ve / veya hava kabarcıkları serbest olmasını sağlamak için laboratuarımızda biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. </li><li> Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa, akışkan kanalı ve üst flakon tekrar tekrar yıkayın. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları kaldırıldı edilemezse çip atılır. </li><li> Cips kezlaminer akış kapağı, görüntülü dönmek ve hortumun her iki ucunda çıkarın. </li><li> Tek bir borudan ucunu fizyolojiksel ortam içeren basınçlı bir şırınga. </li><li> , Bir hemostat ile hortumun çıkış ucunda Kıskaç </li><li> Basınç vanasını açın, hemostat akışkansal çıkış ucundan kaldırmak ve, fizyolojik medya ile Mikroakışkan kanal yıkayın </li><li> Yeraltı akışkan fizyolojik medya ile durulayın / vanaları kapalı, açık ve Hortumun çıkış hemostatı kaldırın. </li><li> Fizyolojiksel ortam delikten zorlamak için, bir hemostat ile hortumun çıkış ucu kelepçe. </li><li> Hemostat ile boru giriş sonuna Kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. </li><li> Hortumu plug şırınga ve her iki ucunda hortumu glas fişli giriş ucu çıkarın. </li><li> Hemostat çıkarın. </li><li> Üst şişeden su çıkarın. </li><li> Filtre steril fizyolojik medya ile üst flakon doldurun. </li><li>100 mm petri içine çip geri yerleştirin. </li><li> 35 mm çanak taban 100 mm kabına yerleştirin ve nem zenginleştirmek için filtre steril deiyonize su ile doldurun. </li><li> Kaplama için zamanı gelene kadar çanak Kapak </li></ul> 4. Salyangoz nöronlarının hücre kaplama Yama-kelepçe yongaları, çeşitli preparatları için uygun olabilir. Şu anda memeli Primer kortikal nöron dökülmesinin test ve sterilizasyon protokolü yeterli olduğunu gösterir ve cips, uzun vadeli kültürlerinde sitotoksik olmadığı 14 gün 7, kültüre hücreleri ile elde edilen ilk sonuçlar. Onlar, nöronal elektrofizyoloji 11 okumak için basit ama köklü bir modeli temsil eder, çünkü bu bizim için en önemli sonuçları tarihi 10 edindiğiniz bu hücreler ile, bu protokolün amacı doğrultusunda, salyangoz nöronlarının seçilmiştir. Ayrıntılı hücre izolasyonu ve kültürü prosedürleri varÖnceden 12, 13 tarif edilmiştir. <ul type="disc"><li> Çıkarın, Listerine içeren% 10 Lymnaea tuzlu künt forseps ve uyutmak hayvanlar ile 2-3 aylık Lymnaea stagnalis dış kabuk. Tüm sonraki basamaklar oda sıcaklığında sterilize diseksiyonu ekipman ve çözümleri ile bir laminer hava akımı kaput içinde aseptik yapıldı. </li><li> Eppendorf pipet kullanarak uygun kayıt çözümü ile akışkansal fizyolojik ortam değiştirin. Durumda Lymnaea nöronların çözüm içerir (mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etilenbis (oxyethylenenitrilo) tetraasetik asit (EGTA) ve 5. 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES, pH 7.4. 130 mOsm) 14 </li><li> Pin Lymnaea tuzlu su ile dolu bir Sylgard kabına salyangoz ve daha önce 13 olarak açıklanan tüm beyin kaldırmak </li><li> Isolat tedavi18 dakika 15 dakika tedavi için DM ve tripsin inhibitörü (Sigma, Soya, Katalog # T-9003) takip ed tripsin enzimi ile tanımlanan medya beyinleri (DM) (% 0.2 'Çözüm, Sigma, Katalog # T-9201). </li><li> (-; 1M glukoz çözeltisi 20 mL DM 750 uL glukoz eklendi DM HODM) medya tanımlanan yüksek ozmolarite dolu küçük Sylgard, çanak beyinleri Pin. </li><li> Ince forseps ve diseksiyon makas kullanarak, nöronlar açığa ilgi gangliyonların dış ve iç kılıf çıkarın. </li><li> , Ilgi (sol pedalı dorsal 1) hücre yakınındaki nazik emme uygulamak,, nöron beyin ayrılır ve, pipet içinde süspanse edilmekte kadar bir yangın cilalı cam pipet ile doldurulur HODM ve Mikroşırınga iliştirilir. </li><li> Cam pipet sonra taşındı ve yumuşak sınırdışı mikroenjektör, nöronlar pipetle yavaşça dışarı itti ve fiş tek tek yama deliklerin üstüne yerleştirilir üzere sağlar bireysel neurochips daldırılır.</li><li> Hücreleri, diyafram çevreleyen çip yüzeyine bağlılıklarını teşvik etmek için oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca rahatsız edilmeden oturup bekleyin. </li></ul> 5. Elektrofizyolojik kayıtlar (Bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) amplifikatöre yongaları bağlamak için <ul type="disc"><li> Çözüm, yeraltı Mikroakışkan ve uygun kayıt çözümleri ile çip şişe içinde değiştirin. , HEPES ile pH 7.9,, Lymnaea nöronların durumda üst kültürü odalarına (mM: 51,3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCI2 ve 1.5 MgCİ2) Lymnaea tuzlu su ile doldurulmuştur tamponlu 14 </li><li> Kararlılık için, yapıştırıcı bir cam slayt üzerine çip ve mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Amplifikatör (bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) çip bağlamak için, hortumun bir ucunu kesti ve Silve eklemekr tel hangi kafa-sahne bağlanmıştır. </li><li> Üste çipi şişe içinde referans elektrotu yerleştirin. </li><li> Çip şimdi kayıt için hazırdır. </li><li> Tüm hücreli (Rt = 50-100 M artı kapasitif geçişlerini, hücre ekli (R t&gt; 1 GΩ) gösterge niteliğinde: toplam direncini ölçmek (Rt) ve nöronların yapılandırması belirlemek için amplifikatör ile bir 5 mV adım uygulayın ya da hiç mühür (M R t &lt;5), membran diyafram üzerinde rüptürü). Son deneyler 10 hücreleri,% 58 oranında yüksek direnç contalar vardı ve bu hücreler,% 80 uyarılabilen yanıtları gösterdi. </li></ul> 6. Temsilcisi Sonuçlar <ul type="disc"><li> Depolarizan akım darbeleri (20 pA artış), nöron (Bu durumda LPeD1 yılında) uygulayın. </li><li> Vm yakın dinlenme potansiyeli (- 60 mV ~) nöron tutun. </li><li> Depolarizan bakliyat tepkileri gözlemleyin. Overshooting aksiyon potansiyellerinöron uygulanabilir olup olmadığını görülebilir. </li><li> Şekil 4, 14, 15 'de ayrıntılı olarak ele alınmaktadır temsili bir sonucunu göstermektedir. </li></ul><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4,"> Şekil 4. Gerilim yanıtları intrasellüler akım darbeleri (aşağıda), kademeli dizi LPeD1 nöron (üstte). 60mV - akım darbeleri Vm = uygulanmıştır. Sorun Giderme <ul type="disc"><li> Membran ve diyafram enkaz ücretsiz ve kaplama için uygun olup olmadığını kaplama önce, görüntü yongaları belirlemek için. Biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. Bizim son deneyler 1, cips% 67 oranında başarıyla bu şekilde astarlanmalıdır. </li><li> Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa fiş atmak ve başka bir tane deneyin. </li><li> Çeşitli yüzey işlemleri (plazma) veya kaplamalar (PDL, PEI vb.) Denenebilir, ancak başarı hücre tipine son derece bağlı olabilirkullanılmıştır. </li><li> Kritik bir mühür giga-ve, bütün-hücre formasyonu için akışkan çözeltisi ("pipet") bileşimi. Osmolarite, pH ve iyonik makyaj dikkat, çözüm ayarlayın. </li><li> Uzun vadede kültür için, sonra nazik yerçekimi beslemeli perfüzyon (~ 0.5 ml / dak) üzerinden kayıt önce çözüm Pipeti geçiş, mikroakışkan kanalı medya ile başlar. </li></ul>

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yama-klemp yonga NRCC sorgulama platformu, yüksek bilgi içeriği ilaç deneyleri için potansiyel olarak güçlü bir araçtır ve hastalığın in vitro modeller araştırmak için. Büyük hücreler yoklamak bir avantajı, bir düşük erişim direnci, cam pipet ile karşılaştırıldığında avantajları vardır, ve biraz daha büyük bir kapasitans rağmen küçük hücreler karşılaştırılabilir dinamiği neden olur. Rutin diyafram mühürler spontan hücre elde edilmiştir ve bütün hücreye girişi spontan 14 olduğu saptanmıştır. Probun, hücre kültürü çanağı parçasıdır ve elle, hücre membranı ile temas getirilen gerçeğine arasında açık bir fark, cips ve cam pipet yöntemi olup. Hücreleri kültür, muhtemelen fonksiyonel ağları parçası, hastalık modelleri olarak daha fazla biyolojik olarak amaca uygun modeller sonuçları ve mühürler 16 yoklamak için yüksek hücre güvenliğini sağlamak için farklı bir mekanizma. Ancak, hücre süspansiyonları ile kontrast, aspirasyon bulaşmıyort, prob bir hücre konumlandırmak için kullanılacaktır. Salyangoz nöronlar, diğer büyük hücreler olarak, probun üstüne manuel konumlandırma uygundurlar. Hücrelere artık kültür kez gerektiren küçük hücreler için, biz herhangi bir manipülasyon için ihtiyacı ortadan kalktığı ve prob üst hücrelere yerleştirmek için problar üstüne, desenlendirme adezyon polipeptidlerin tarafından bir mühür elde etme olasılığı yüksek tutmak ve göstermiştir yerleştirme prob 17,18. NRCC aynı zamanda gelişmekte olan bir cam pipet ile karşılaştırılabilir bir kapasitans mikroakışkan yama kelepçe çip 19 poliimid. Bu projenin nihai hedefi, bireysel iyon kanalları 14 çözünürlükte ağ davranışı yapan birkaç nöronlarının elektrofizyolojik aktivitenin eş zamanlı izleme sağlar. Çoklu problar patch-klemp yonga Bu yöntem, yüksek çözünürlükte bir çoklu-elektrot dizilerin 20 tamamlayıcı bir yöntemdir.

hücreler nrcc patch-klemp chips kültür ve elektrofizyoloji

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Onun zarif duyarlılık ve iyon kanallarının düzeyinde tek tek hücrelerin izlenmesi ve kontrol etme yeteneği sayesinde, yama-klemp Elektrofizyolojinin altın standart hem 1 hastalık modelleri ve ilaç ekranlar uygulanır. Bu yöntem, geleneksel bir cam pipet ile bir hücre tarafından doldurulacak bir yama membran, doruğuna 2 altında izole etmek için bir fizyolojik çözelti yavaşça başvurmadan içerir. Pipet takılı bir elektrot, membran rüptürü yama veya tüm hücre içinde iyon kanal aktivitesini yakalar. Son on yıl içinde, patch-klemp cips, 3, 4 alternatif olarak ileri sürülmüştür: bir asma film kültür ortamından fizyolojik orta ayırır ve, film microfabricated bir diyafram pipet apeks değiştirir. Patch-klemp çipleri otomasyon sistemleri entegre ve yüksek throughput tarama 5 için satışa sunulmuştur. Incrhacmi kolaylığı, hücre-probe mühürler algılamak ve tüm hücre moduna girmek için akışkan süspansiyon hücreleri teslimat, emme diyafram üzerinde konumlarını ve otomatik rutinleri içerir. Biz optimize empedans ve aksiyon potansiyelleri 6 kültürlü salyangoz nöronlar yüksek kaliteli kayıt izin delik şekli patch-klemp bir silikon çip üretim bildirdin; son zamanlarda, biz de memeli nöronlar 7 sorguya doğru ilerleme var. Patch-klemp cips Kanada Fotonik Üretim Merkezi 8, ticari bir döküm imal ve büyük seriler mevcuttur. Biz, farklı modellerde NRCC teknoloji kullanımı doğrulamak için electrophysiologists ile işbirliği yapmaya istekli. Şekil 1'de temsil genel şemasına göre yongaları kullanılır: silikon çip bir pleksiglas kültür şişe ve diyafram arka alt bir yeraltı chann için bağlıEl paketinin iki ucunda tüpleri ile donatılmıştır. Hücreler flakon kültüre ve sonda üst hücre ölçüm elektrodu, akışkan portları hücreye az düzeyde rahatsızlık vererek çözüm alışverişini kolaylaştırmak dışında iki channel.The takılı bir tarafından izlenir; intrasellüler için cam pipetler göre bu bir avantaj perfüzyon. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1."> Şekil 1. yama klemp NRCC çip kullanan ölçüm prensibi Biz burada detay sterilize ve asal cips, onlara yük hücreleri ile orta, plaka, ve nihayet elektrofizyolojik kayıtlar için bunları kullanmak için protokolleri.

Biz hücreler ile kaplanmış orta yüklenen astarlanmalıdır Kanada Ulusal Araştırma Konseyi, sterilize edilir,, fabrikasyon ve elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan düzlemsel patch-klemp cips göstermektedir.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Üstün hassasiyeti ve iyon kanalları düzeyinde tekil hücreleri izleme ve kontrol edebilme yeteneği sayesinde patch-clamp yöntemi, altın standarttır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenmiş hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesini düzlemsel bir patch clamp çipi aracılığıyla kaydetmektir. Bu işlem, hücre kültürünün büyümesine ve ardından elektrofizyolojik aktivitesinin izlenmesine olanak sağlamak için patch clamp çiplerinin sterilize edilmesi, hazırlanması ve test edilmesiyle gerçekleştirilir. Test edildikten sonra çipler, bir hücre biyolojisi laboratuvarında yeniden hazırlanana kadar saklanabilir.Bir sonraki adım olarak, uzuvlardan ve stauslardan nöronlar ekstrakte edilir ve çipler üzerinde kültüre edilir. Son olarak, hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesini izlemek amacıyla çipler bir patch clamp amplifikatörüne bağlanır. Bu teknolojinin mevcut planner patch clamp çiplerine göre temel avantajı, kültür oluşturan nöronlarla kullanıma uygun olması ve böylece sinaptik olarak iletişim kuran nöronlar arasındaki etkileşimin sorgulanmasına olanak tanımasıdır.Bu yöntem ve yaklaşım, hem normal hem de patolojik koşullar altında bir nöronal ağ içine yerleştirilmiş uyarılabilir hücrelerin iyon kanalı fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Bu yöntemin etkileri, iyon kanalları ve reseptör proteinleri için orta ölçekli verim ve yüksek bilgi içerikli ilaç taramaları yapmak amacıyla kullanılabileceği farmakoloji alanına kadar uzanmaktadır. Bu nöronların kolayca konumlandırılabilmesi ve kültüre edilebilmesi nedeniyle, bu yöntemi göstermek için salyangoz nöronlarını seçtik.Ayrıca, bu nöronlar kültür ortamında ağı yeniden oluşturabildikleri için dönüşüm çalışmalarında mükemmel modeller oluştururlar. Daha da önemlisi, bu çipler kardiyak ve kanser hücreleri gibi diğer hücre sistemlerinde de kullanılabilir. Planar patch clamp çiplerini kullanırken karşılaşılan temel zorluk; temiz açıklıklara sahip çipler elde etmek, hücreleri ekmek ve kültüre etmektir.Bağlantısı olmayan çipler verimsiz olacaktır, bu nedenle tüm çipler kullanılmadan önce test edilir. Elektrofizyolojik değerlendirmenin en kritik noktası, hücreler kültürlendikten sonra ortaya çıkar. Bu nokta, hücre membranı ile çipin üst iki kenarı arasında giga sızdırmazlığın (giga seal) oluşturulmasından ibarettir.Üretilen tüm plantar patch clamp chipleri, süspansiyondaki izole hücreleri kullanır ve hücreleri, giga seal oluşturmak amacıyla açıklığa çekmek için vakuma dayanır. GigE oluşumu, bizim chiplerimizle kendiliğinden gerçekleşir.Nöronlar kültürlenirken ve vakuma ihtiyaç duyulmazken, çip sterilizasyonu ve tarama adımını göstereceğim. Tanya, hücre biyolojisi laboratuvarındaki yükleme işlemini açıklayacak, Colin ise hücre hazırlama ve ekimini örneklendirecek. Son olarak, Marcia kayıtların nasıl alındığını gösterecek. Bu prosedüre başlamak için, çipleri heric temel plazma temizleyicide, 0,1 ile 0,3 millibar arası kalıntı hava basıncıyla, 18 watt maksimum güçte 15 dakika boyunca sterilize edin.Plazma işlemi ayrıca çipi hidrofilik hale getirerek ön hazırlığı (priming) kolaylaştırır. Ardından, cam tüpleri bir ucunda üç inç ve diğer ucunda bir inç uzunluğunda olan steril cel elastik laboratuvar silikon tüpleriyle donatın. Daha sonra, içinde hiç hava kabarcığı kalmadığından emin olarak tüpleri steril standart fosfat tampon çözeltisi ile doldurun.PBS'yi kısa uçtan bir atmosfer basınçla basınçlandırırken uzun silikon tüpü kıstırın. Ardından akışkan kanaldaki basıncı tahliye edin. Bundan sonra, bir şırınga kullanarak flakonu PBS ile doldurun.Bir gümüş, gümüş klorür elektrodu flakona, bir karşı elektrodu ise kısa tüpe daldırın. Erişim direncinin 300 kilo ohm ile üç mega ohm arasında ve şönt kapasitansın 10 pico ferriday ile 25 pico ferriday arasında olduğunu onaylamak için bir empedans ölçer kullanın. Ardından, akış kanalını steril deiyonize su ile yıkayın.Üstteki şişeyi boşaltın ve durulama işlemini iki kez tekrarlayın. Ardından, tüplerle birlikte çip paketini 30 dakika boyunca taze, steril deiyonize suyun içine daldırın. Sonrasında, diğer çipleri steril deiyonize su ile doldurulmuş steril bir kaba yerleştirin.Bu, çiplerin hidrofilik kalmasını sağlar ve kontaminasyona karşı korur. Ambalaj kalıntılarının su yüzeyinde yüzerek kontaminasyona yol açmasını önlemek için, bir çip kutusunu HEPA filtreli laminer akış kabininde açın ve üst viyali aşağı bakacak şekilde çipleri çıkarın. Çip yüzeyindeki kalıntıları gidermek için üst viyali filtreli steril deiyonize su ile iki kez durulayın. Akışkan kanalına bağlı elastik tüpün bir ucunu, steril filtreli deiyonize su içeren basınçlı bir şırıngaya bağlayın.Bu sistemde, şırıngadaki su, steriliteyi sağlamak amacıyla şırıngaya girmeden önce filtrelenen ve bir atmosfere ayarlanmış bir basınçlı hava tankı tarafından basınçlandırılır. Sistem ayrıca, gerektiğinde basınç kontrolüne olanak tanıyan iki adet açma-kapama valfi ile donatılmıştır. Akışkanlar sisteminin çıkış ucunu bir hemostat ile sıkıştırın.Ardından, çözeltiyi basınçlandırmak için sıkıştırılmış hava tankı vanasını açın. Daha sonra, çipi taze steril deiyonize su ile yıkamak için akışkanlar sisteminin çıkış ucundaki hemostatı açın. Suyun açıklıktan yukarı doğru çıkmasını sağlamak için akışkanlar sisteminin çıkış ucunu bir hemostat ile sıkıştırın.Su drenajını önlemek için, akışkanlar sisteminin girişini hemostat ile sıkıştırın ve açma-kapama valflerini kapatın. Ardından, boru hattının giriş ucunu şırıngadan ayırın. Boru hattının her iki ucunu da tıkayın ve hemostatları çıkarın.Üstteki şişeyi filtrelenmiş steril deiyonize su ile doldurun. Ardından, 35 milimetrelik steril bir petri kabının kapağını, 100 milimetrelik steril bir petri kabının tabanının üzerine yerleştirin. Sonrasında, 35 milimetrelik kapağın üzerine bir çip yerleştirin ve 100 milimetrelik bir petri kabı kapağı ile kapatın.Çiplerin membranının ve açıklığının kalıntılardan veya hava kabarcıklarından arınmış olduğundan emin olmak için çiplerin görüntülemesi yapılır. Kalıntı veya hava kabarcıkları mevcutsa, akışkan kanalı ve üst şişe steril su ile defalarca yıkanır.Kalıntılar veya hava kabarcıkları giderilemiyorsa, çip atılır. Çiplerin görüntülemesi tamamlandıktan sonra, çipleri tekrar laminar akışlı kabine geri getirin. Tüpün her iki ucundaki bağlantıları sökün.Hortumun bir ucunu fizyolojik ortam içeren basınçlı bir şırıngaya takın ve yer altı akışkan yolunu fizyolojik ortamla durulamak için hortumun çıkış ucunu hemostat ile sıkıştırın. Fizyolojik ortamın açıklıktan yukarı doğru itilmesini sağlamak için açma-kapama vanalarını açın ve hortumun çıkış ucundaki hemostatı kaldırın; ardından hortumun çıkış ucunu hemostat ile, giriş ucunu hemostat ile sıkıştırın ve açma-kapama vanalarını kapatın. Daha sonra, hortumun giriş ucunu şırıngadan çıkarın ve hortumun her iki ucunu cam tıpalarla kapatın.Ardından hemostatları çıkarın. Sonrasında, üst tüpteki suyu boşaltın. Üst tüpü filtrelenmiş steril besiyeri ile doldurun.Çipi 100 milimetrelik petri kabına geri yerleştirin. Ardından, nemi artırmak için 35 milimetrelik petri kabının tabanını 100 milimetrelik petri kabının içine yerleştirin ve içini filtrelenmiş steril deiyonize su ile doldurun. Son olarak, ekim zamanına kadar kabın kapağını kapatın.Bu prosedüre başlamak için, iki ila üç aylık limasagların dış kabuğunu küt uçlu bir pens yardımıyla çıkarın. Ardından hayvanları, laminer hava akışlı bir kabinde %10 Listerine içeren limba salin içerisinde anesteziye alın. Salyangozları limba salin ile doldurulmuş bir hücre koruma kabına iğneleyin ve beynin tamamını çıkarın.Ardından, izole edilen beyinleri tanımlı besiyerinde trypsin enzimi ile 18 dakika boyunca işleme tabi tutun. Bundan sonra, tanımlı besiyeri ve trypsin inhibitörü ile işleyin. İnce uçlu bir pens ve bir diseksiyon makası kullanarak, beyinleri yüksek ozmolariteli tanımlı besiyeri ile doldurulmuş küçük bir hücre koruma kabına 15 dakika boyunca sabitleyin.İlgilenilen ganglionların dış ve iç kılıflarını kaldırarak nöronları açığa çıkarın. Ardından, yüksek osmolaliteye sahip tanımlı medya ile doldurulmuş, ucu ateşle cilalanmış bir cam pipeti mikro şırıngaya takın ve nöron beyinden ayrılarak pipet içinde asılı kalana kadar ilgili hücrenin yakınına nazikçe vakum uygulayın. Nöroçipin akışkanlık sistemindeki medyayı uygun bir kayıt çözeltisiyle değiştirdikten sonra, cam pipeti bir kültür tüpüne eğin ve nöronu çip açıklığının üzerine nazikçe yerleştirin.Hücrelerin açıklığı çevreleyen çip yüzeyine tutunmalarını sağlamak için oda sıcaklığında en az iki saat boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Stabiliteyi sağlamak amacıyla kültür kabındaki solüsyonu uygun kayıt solüsyonu ile değiştirin. Çipi bir lam üzerine yapıştırın ve çipleri amplifikatöre bağlamak için mikroskop altına yerleştirin.Tüplerin uzun ucunu kesin ve kafa aşamasına bağlı gümüş teli yerleştirin. Ardından referans elektrodu çip kültür kabına yerleştirin. Çip artık kayıt için hazırdır.Burada, sol pedal dorsal bir nöronun kademeli intrasellüler akım darbelerine verdiği voltaj yanıtlarına bir örnek gösterilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kültürlenmiş hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesinin planar patch clamp çipi ile nasıl kaydedileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İlk adımda, hücre ekimi için kullanılmayanların tıkalı olmadığını doğrulamak amacıyla çipleri taradığımızı unutmayın; Ture biology kullanıcıları yükleme adımından başlar ve genellikle her grup için hala birkaç tıkanmış çiple karşılaşırlar.Bu yeni yöntem, in vitro nöral ağların benzeri görülmemiş bir çözünürlük düzeyinde sorgulanmasını sağlayan ucuz bir teknolojinin geliştirilmesinde önemli bir atılımı temsil etmektedir. Bu teknoloji; terapötik hedef tanımlama, ilaç geliştirme ve tanısal değerlendirme için gelişmiş analizlere yol açabilir. Bu teknolojinin daha da geliştirilmesi, sağlık araştırmacılarının nörolojik hastalıklar veya bozukluklar için yeni tedaviler keşfetmeleri adına yeni araçlar sağlayacaktır.Potansiyeli; kalp hücreleri, kanser ve elektrogenik özelliklere sahip diğer hücreleri kapsamaktadır.

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, bir floresan raportör ile kaynaşmış ışığa bağımlı iyon kanalı proteinlerini ifade eden embriyonik böbrek hücresi kültürleri, ışığın iyon hareketi üzerindeki etkisini göstermektedir. Tüm hücre yama kelepçesi, iyonların hareketini izlemek için kullanılır.

Işığa Bağımlı İyon Kanallı Hücrelerin Optogenetik Elektrofizyoloji Kaydı

Biz deniz deniz tavşan sinir sisteminin diseksiyonu...

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

Afferent duyusal nöronlar, duyusal bilgileri çevreden merkezi sinir sistemine gönderir. Spesifik afferent nöronların tanımlanması, fizyolojilerinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Afferent nöronları tanımlamak için bir retrograd etiketleme yöntemi tanımladık ve bu nöronlardaki voltaj kapılı iyon kanallarını yama kelepçesi elektrofizyolojisi ve immünositokimya kullanarak inceledik.

Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

İn vitro hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesinin görünür ışıkla uyarılması için organik yarı iletken polimerlerin kullanımına dayalı bir yöntem tarif edilmiştir.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Öğrenin, kültür nöronların elektrofizyolojik aktivitesini planer patch-klemp çipleri kullanarak nasıl kaydedeceğinizi. Bu yöntem iyon kanalı fonksiyonlarını ve sinaptik iletişimi in vivo çalışmalar için optimize eder.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Daha fazla video keşfet