Name: MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin, Target ID Kütüphanesi ile miRNA hedeflerini tespit etmek için yüksek verimli genomik tarama yöntemini. Ganciclovir seçimi ve derin dizileme analizi kullanılarak stabil hücre hatları oluşturulur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz ona destek ve sorun giderme verimli tartışmalara katılım için tüm Sigma Hayat Bilgisi Misyon Hedef Kimliği Kütüphane geliştirme ekibi, özellikle teknoloji bulmak ve lisans koşullarını müzakere Kevin Gutshall ve Heather Holemon teşekkür ederiz. Biz de özgürce klonlanmış almak büyük bir cDNA parti ve onun kalıcılığını hazırlamak için yayımlanmamış sonuçlar ve öneriler ve RxBiosciences ve Gazi Hamid paylaşımı için King College London Dr Joop Gäken teşekkür ederim. Biz cDNA dizileri ve veri analizi gerçekleştirmek için SAFC gelen Nan Lin ve Scott Bahr kabul etmek istiyorum. MİSYON Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar gönderilen eser bir ilgi ticari kuruluşlar ile mali ilişkileri beyan ederim.

microRNA inhibe mRNA çeviri post-transkripsiyonel gen ekspresyonu düzenleyen ve sık sık, hedeflenen mRNA ([6] Yorumlar) istikrarsızlaştırma 20-24 nükleotid RNA&#39;lar vardır. Tek miRNA gelişimsel ve çevresel sinyallere bir hücre tepkisi kontrol etmek için birçok yüz mRNA&#39;ların düzenleyebilir. Belirlenmesi ve hedef mRNA doğrulayarak bu yolları bir miRNA rolü ve fonksiyonu belirlemede önemlidir. Hayvanlarda, miRNA&#39;lar ve hedef siteler tamamen tamamlayıcı değildir, çünkü Ancak, hedef tespit kolay değildir. &quot;Tohum&quot; bölge, miRNA ve 5&#39;-ucundan 2 ile 7 arasındaki dayandırır, genelde hedeflerini tamamlayıcısı oluyor. Ancak, tohum kuralın pek çok istisnası vardır ve taban-eşleştirme aşağı bir kusurlu tohum maçı telafi edebilir. Bilgisayar algoritmaları Bir çok tohum eşleştirme ve mansap tazminat, hedef yapısına dayalı miRNA hedefleri tahmin etmek geliştirilmiştird konumu, sıra korunması ve deneysel olarak doğrulanmış hedefler ([7] Yorumlar) için gözlenmiştir diğer çeşitli parametreler. Öngörüleri uygun olan ve tanımlamaya pek çok geçerli miRNA hedefleri do silico iken, en genler deneysel doğrulama testleri başarısız ve birçok gerçek hedefleri tahmin edilmiyor öngördü. Bilgisayar algoritmaları önceden belirlenmiş hedef özelliklere dayalı Dahası, bunlar zaten bilinen sapan hedeflerin keşfi izin vermez. Deneysel sistem bir dizi canlı hücrelerin işlevsel miRNA hedefleri belirlemek veya keşfetmek için başarıyla kullanılmaktadır. Bu küresel tarama yöntemleri mikroarrayler ve RNA sıralama, RNA co-immünopresipitasyon (RIP), ve Hücre kültüründe Amino asitler ile Kararlı İzotop Etiketleme (SILAC), bir proteomik yöntemi ([7] &#39;de gözden) içerir. Her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Hedefleme miRNA genellikle mRNA oynattığını ve onun bozulması, kaybolması o yol açar yanaBir miRNA sırasıyla, taklit ya da inhibitör tanıttıktan sonra mRNA düzeyinde r kazanç, miRNA hedefler belirleyebilir. MRNA Bu kaybı veya kazancı kolaylıkla mikroarray veya derin sekanslama tarafından tespit edilir. MRNA algılama yöntemleri basit ve protein tespit yöntemleri daha duyarlı iken, mRNA algılama bozulmuş olmayan herhangi bir miRNA hedefleri özleyeceğim. SILAC gelenler RNA algılamayı miRNA hedef sonuçlarını karşılaştırarak Bartell laboratuvar gelen son haberler [8] veya ribozom profilleme [9] memeli miRNA&#39;lar ağırlıklı hedef mRNA düzeylerini azaltarak etki gösterir. Ancak, bireysel miRNA hedefleri ile çalışan diğer birçok laboratuvarlarında protein değişir ama mRNA düzeyinde herhangi bir değişiklik tespit ettik. Saptanabilir mRNA kaybı ile translasyonel düzenlemesi için ne görünür Raporları şunlardır: miR-10b HOXD10 [10] p27kip1 üzerine, miR221/222 [11] Pdcd4 üzerine, miR-21 [12], miR-126 p85β üzerinde [13] , SIRT1 üzerine miR-34 [14] PTEN [15], miR-302d Arid4b [16], miR-200C JAG1 [17], ve miR-299, 297, 567, bir üzerine, miR-21VEGFA üzerine nd 609 [18]. Ayrıca, Clancy ve ark [19] yakın let-7 hedef sitesi içeren bireysel mRNA izoformları seçici tespit edildiğinde let-7 tarafından translasyonal yönetmelik sadece tespit edildiğini bildirdi. Tüm mRNA izoformları bir mRNA olarak tespit edildiğinde yani, - - kadar mikroarray ve sekans analizi ile elde edilen ikinci en azından bazı durumlarda, translasyon düzenlemesi, bir kompozit profili göz ardı edilebilir, göstermektedir. Argonaute (genellikle ago2) veya başka bir ilişkili protein (RNA immünopresipitasyon veya RIP) ile miRNA-mRNA komplekslerinin Co-immünopresipitasyon bağımsız regülasyon mekanizması miRNA hedefleri izole olacaktır. Ayrıca, RIP, etkileşimleri endojen ve muhtemelen biyolojik ilgili algılar. Ancak, tüm miRNA-mRNA etkileşimleri fonksiyonel olup, RIP, yalnızca geçici ilişkilendirmek veya hızla bozulmuş olan herhangi bir mRNA hedefleri kaçıracağı olup olmadığı bilinmemektedir. Ayrıca, özel miRNA-mRNA ortakları bioinformati varılabilir gerekirTüm miRNA-mRNA çiftleri birlikte co-çöktürülmüş Cally çünkü. Son olarak, SILAC doğrudan miRNA düzenlemesi, protein kendisinin son ürün tanımlar, fakat duyarsız olduğunu ve bu nedenle nadir proteinler ve protein düzeyleri küçük değişiklikler kat bahsi. Mevcut miRNA hedef belirleme yöntemleri ile sınırlamalar ışığında, biz alternatif bir mekanizma ile fonksiyonel miRNA hedefleri belirlemek için ek bir küresel analiz ihtiyaç hissettim. Bu ihtiyacı karşılamak üzere, Joop Gaken ve King s College London Azim Mohamedali tarafından icat edilmiş bir teknoloji lisanslı. Bunların buluş, bir çift seçimi füzyon proteini olup, özellikle, bir timidin kinaz-zeocin füzyon, onun 3&#39;UTR potansiyel miRNA hedef dizilerinin bir cDNA kütüphanesi düzenlenir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, stabil bir şekilde TKzeo-yapıları cDNA ile transfekte edilmiş ve eksprese eden hücreler, zeocin seçilebilir. Bir ilgi miRNA ifade ettikten sonra, bu miRNA hedefleri wi seçilebilirth gansiklovir, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Gansiklovir, herhangi bir hücre ilgi miRNA için bir hedef yoksun TKzeo-cDNA ifade edilir timidin kinaz, Salgılayan hücrelerin öldürür. Hedeflenen cDNA kanadını cDNA ve PCR ürünleri hedefleri tespit etmek için diziliş edilebilir gansiklovir kullanılarak hayatta primerler hücrelerinden DNA&#39;nın PCR amplifikasyonu ile izole edilebilir. MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane - Fonksiyonel insan miRNA hedeflerinin küresel kimlik ve keşif için yeni bir araç haline King &#39;s College teknolojisi geliştirdi. Hedef Kimliği Kütüphane ile kullanıcılar, memeli hücre kültürü transfeksiyon ve ilaç seçimi bir dizi adım tarafından miRNA hedefleri ayırabilirsiniz. Kütüphane kapsamlı olduğunu ve insan genlerinin% 66-79 içerir. İlk sonuçlar, hem daha önce keşfedilen yanı sıra yeni hedefler MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane izole edilebileceğini göstermektedir. Protokolü, bazı uzunluğunun olmasına rağmenmemeli hücre kültürü, transfeksiyon, ilaç seçimi, PCR ve sıralama - - Hedef Kimliği Kütüphane kullanımı standart moleküler laboratuvar teknikleri gerektirir ve bu yüzden biyologların çoğu, araçlarının içinde de olmalıdır. Biz yeterince ilgi kültür koşullarının optimize, uygun deneysel tasarım için para ve en önemlisi, Hedef Kimliği Kütüphanesi ile başarı sağlamak için seçim adımları (kill-eğrileri) için optimum ilaç düzeylerini belirlemek için her yeni hücre tipi ön test edilmesini önerme. Tüm miRNA hedef tanımlama yöntemleri olduğu gibi, son derece Hedef Kimliği Kütüphane eleme tarafından belirlenen hedefler gibi mikroarray, QRT-PCR, reporter assay (yani, lusiferaz) veya Batı analizi gibi ikinci bir yöntem ile doğrulanması önerilir.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Gansiklovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> Memeli Genomik DNA Miniprep Takımı GenElute </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Hücre Özgül Nucleofection ko </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Hedef Kimliği Kütüphane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

mİsyon hedef kimliği kütüphane kullanımı mirna hedefler için genom ekran

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Hedef Kimliği Kütüphane mikroRNA keşif ve kimlik (miRNA) hedeflerine yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Hedef Kimliği Kütüphane çift seçimi füzyon proteini, timidin kinaz-zeocin (TKzeo) den 3&#39;UTR aşağı klonlanmış bir plazmid tabanlı, genom cDNA kütüphanesi olduğunu. Seçimin ilk turunda, istikrarlı transformantlar için bir ilgi miRNA tanıtımı ile takip, ve nihayet, miRNA hedefi içeren cDNAlarının için seçimi olduğunu. Seçilen cDNAlarının sıralama (Hedef Kimliği Kütüphane İş Akışı ve ayrıntılar için bkz. Şekil 1-3) ile tanımlanır. Insan transcriptome geniş kapsama sağlamak için, Hedef Kimliği Kütüphane cDNAlarının birden fazla insan doku ve hücre hatları hazırlanan toplam RNA havuzu kullanarak oligo-dT astar ile oluşturulmuştur. 1.2 kb arasında bir ortalama boyutu olan, 0.5 ile 4 kb için cDNA aralığı çıkan ve (plazmid haritası için bakınız Şekil 4) p3TKzeo ikili seçme plasmid içine klonlandı. Li temsil gen hedefleribrary Sigma-Aldrich web sayfasında bulunabilir. Illumina sekanslama (Tablo 3), elde edilen sonuçlar, kütüphanesi UCSC RefGene içinde 21.518 eşsiz genlerin 16.922 (% 79), ya da 10 ya da daha fazla okur (% 66) ile 14.000 genler dahil olduğunu göstermektedir.

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Target ID Kütüphanesi, mikroRNA (miRNA) hedeflerinin keşfine ve tanımlanmasına yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Target ID Kütüphanesi, plazmit tabanlı...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef ID kütüphanesini kullanarak mikro RNA hedeflerinin yüksek kapasiteli, genom çapında bir taramasını gerçekleştirmektir. Bu, kütüphane plazmidi ile hücre transfeksiyonu yoluyla sağlanır. Klonlanmış cDNA'ların genom çapındaki bir koleksiyonunun transfeksiyonunu, stabil hücre hatları için seçim süreci takip eder.Ardından, mikro RNA hedefinin ve timidin kinazın birlikte ekspres edilmesini sağlamak amacıyla, oluşturulmuş kütüphane hücreleri mikro RNA ekspresyon konstrüktü ile transfekte edilir. Bu noktada, timidin kinaz ekspresyonuna karşı seçilim yaparak, spesifik mikro RNA hedeflerini eksprese eden hücreleri seçmek için gansiklovir kullanılır. Mikro RNA hedef bölgelerini içeren CD NA'lar, mikro RNA kütüphane hedeflerini dizilemek ve tanımlamak amacıyla hedef ID amplifikasyon primerleri kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.Sonuç olarak, derin sekanslama analizine dayalı olarak hücrelerdeki spesifik mikro RNA hedeflerini belirleyen sonuçlar elde edilir. Görev hedef kimliği kütüphanesi, mikro RNA için gen hedeflerinin keşfedilmesine ve tanımlanmasına yardımcı olmak üzere tasarlanmıştır. Burada, bu kütüphanenin kullanımını ve uygulamasını gösteriyoruz.Bu protokole başlamadan önce, ilgilenilen IRA'yı eksprese etmeyen veya düşük seviyelerde eksprese eden bir hücre hattı seçin ve hücreleri yaklaşık %80 konfluensle 2 × 10⁷ hücre elde edecek şekilde genişletin. Tripsinizasyon sonrası hücreleri 15 mL'lik steril, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve tripsinize edilmiş hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin. Besiyerini uzaklaştırdıktan sonra hücre pelletini yeniden süspanse edin; yıkamak için hücreleri tekrar santrifüjleyin ve yıkama işlemini ikinci kez tekrarlayın.Bu sırada, her tüpe iki mikrogram hedef ID kütüphanesi ekleyerek, transfekte edilecek sayı kadar 0,5 mililitrelik tüp hazırlayın. Şimdi, her bir transfeksiyon için 600 mikrolitre maxim Nucle affection çözeltisi kullanarak 15 mililitrelik tüp içindeki hücre peletini yeniden süspanse edin. İşlemi her seferinde tek bir reaksiyon için gerçekleştirin.Alikota 100 µL hücre ve 2 µg plazmid ekleyip pipet ucuyla karıştırın. Her karışımı bir nükleer efektör vete'ye aktarın. Bir vete'yi nükleer efektör cihazına yerleştirin ve hücre hattı için uygun, optimize edilmiş programı çalıştırın.Ardından, bir transfer pipetini önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurun. Transfekte edilmiş hücreleri aynı pipetle çekin ve önceden hazırlanmış altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bu işlemi, her bir NU nükleer etkileşimi için NU nükleer etkileşimini takip ederek tekrarlayın.Hücreleri ertesi gün gece boyu inkübasyon için büyüme odasına geri koyun. Besiyerini değiştirin ve hücrelerin üç ila beş gün boyunca toparlanmasına izin verin. Hücreler toparlandıktan sonra, besiyerini uzaklaştırın ve TKZO füzyon proteininin stabil entegrasyonu ve ekspresyonu için seçim yapmak amacıyla uygun düzeyde eosin içeren tam besiyeri ekleyin.Eozin konsantrasyonu, metinde açıklandığı şekilde önceden belirlenebilir. Hücre canlılığı üzerinden eozin seleksiyonu için hücreleri izleyin. Besiyerini her iki ila üç günde bir taze eozin içeren besiyeri ile değiştirin.Altı kuyucuklu plaka içindeki hücreler konfluens olduğunda, hücreleri daha büyük flasklara pasajlayın ve genişletin. Çalışmada kullanılan seleksiyon reaktifleri için minimum letal dozu belirlemek amacıyla bir öldürme eğrisi (kill curve) analizi gerçekleştirilir. İstenmeyen fenotipik yanıtları önlemek için, öldürme eğrilerini uygulamadan önce hücreleri ilk olarak, her bir kuyucuğunda 120 µL taze besiyeri bulunan 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin ve işlemi ertesi gün gerçekleştirin.Seçilen kuyucuklara ilaç ekleyin. miRNA ekspresyon konstrüktünün entegrasyonunu seçmek için Antibiotics G four 18 veya pure mycin kullanılır; timidin kinaz ekspresyonuna karşı seçim yapmak için ise asiklovir kullanılır. İnkübasyon sırasında, her iki günde bir her ilaç konsantrasyonu için hücre canlılığını inceleyin. Seçim reaktifi içeren besiyerini her üç günde bir yenileyin.İlaç konsantrasyonları belirlendikten sonra, söz konusu hücre tipi ve deney için, hedeflenen süre sonunda tam hücre ölümüne neden olan minimum seleksiyon reaktifi konsantrasyonu kullanılmalıdır. Hedef ID Kütüphanesi hücrelerini 2 x 10⁷ hücreye ulaşacak şekilde büyüterek ve genişleterek MI için bir transfeksiyona hazırlayın. Hücreler %80'in üzerinde konfluense ulaştığında tripsinize edin.Hücreleri 15 mililitrelik steril vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve 200 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Besiyerini uzaklaştırın ve hücre peletini daha önce yapıldığı gibi iki kez yıkayın. Ardından, her bir transfeksiyon için 0,5 mililitrelik bir tüpe iki mikrogram MIRA ekspresyon plazmidi ekleyin.mRNA'nın kütüphane hücrelerine NU nükleer transfeksiyona benzer şekilde, hedef ID kütüphanesinin transfeksiyonu için kullanılan yöntemle gerçekleştirin. Hücreler üç ila beş gün boyuncale toparlandıktan sonra, besiyerini öldürme eğrisi testinden belirlenen uygun seviyedeki antibiyotiği içeren tam besiyeri ile değiştirin.Antibiyotik seçimi için hücreleri izleyin ve her iki ila üç günde bir besiyerini antibiyotik içeren besiyeri ile değiştirin. Altı kuyuklu plakada konfluens sağlandığında, hücre havuzunu pasajlayın ve daha büyük flasklara genişletin. Daha önce olduğu gibi, besiyerini uygun seviyelerde GCV ve antibiyotik içeren taze besiyeri ile değiştirin.Hücrelerin timidin kinaz ekspresyonunu ve mRNA ekspresyonunu hücre canlılığı aracılığıyla izleyin ve hayatta kalan hücreleri GCV ve antibiyotik varlığında çoğaltın. Ardından, GCV ile seçilen hücrelerden genomik DNA hazırlayın. Seçilen kütüphane insertlerini kit primerleri ile PCR ile amplifiye edin ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde subklonlayın.Ardından amplifikasyon primerleri ile sekanslama reaksiyonları gerçekleştirilebilir. Son adım olarak, bilinen transkriptler için insan transkriptomuyla ve yeni transkriptler için insan genomuyla sekansların blast hizalaması yapılarak gen hedefleri belirlenir. Mere 3 73 eksprese eden bir konstrükt, MC yedi kütüphanesine stabil olarak transfekte edilmiş ve mere 3 73 hedeflerini eksprese eden hücreleri zenginleştirmek için gansiklovir içeren ortamda seçilmiştir.Kütüphane içermeyen MCF seven hücreleri, timidine kinaz eksprese etmedikleri için GCV'den etkilenmezler. Öte yandan, C seven kütüphane hücreleri timidine kinaz eksprese ederler ancak parlak mavi boyayı alan canlı hücrelerin gösterdiği üzere, 8 veya 16 µM gansiklovir ile tamamen öldürülmezler. Buna rağmen, ortamlarındaki fenol kırmızısı boyasının renginden anlaşıldığı üzere, kütüphane hücreleri GCV varlığında büyümeyi durdururlar.Durdurulmuş hücreler ortamlarını asitleştirmezler ve renk kırmızımsı kalır. Turuncuya dönmek yerine, hayatta kalan hücrelerden sarı hedef diziler izole edilmiştir. PCR ile çoğaltılmış ve dizilenmiştir.Yaklaşık 12.000 benzersiz gene eşleşen yaklaşık 12 milyon cDNA okuması elde edildi. Bu benzersiz genlerden 234 tanesi, vuruş sıklığı nedeniyle güvenilir vuruşlar olarak kabul edildi ve yalnızca mere 3 73'e özgüydü. Başlangıçtaki bir karşılaştırma, hedef ID kütüphanesi ile tanımlanan benzersiz genlerin 10 tanesinin tar base'deki daha önce tanımlanmış mere 3 73 hedefleri listesinde de yer aldığını ortaya koydu.Bu nedenle, bu 10 hedefin büyük olasılıkla mere 3 73'ün geçerli hedefleri olduğu düşünülmektedir ve seçilen başarılı sonuçların deneysel olarak doğrulanması için şu anda karakterizasyonları yapılmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, mikro RNA gen hedefleri için yüksek kapasiteli genom çapında bir tarama gerçekleştirmek amacıyla mission target ID kütüphanesinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

3' çevrilmemiş bölgelerdeki fonksiyonel elementlerin ışıldayan tanımlaması (3'UTR'ler) (3'LIFE), miRNA'lar veya diğer düzenleyici faktörler tarafından 3'UTR'lerdeki fonksiyonel düzenlemeyi tanımlamak için kullanılan bir tekniktir. Bu protokol, fonksiyonel baskılama için yüzlerce varsayılan etkileşimi taramak için 96 oyuklu transfeksiyon ve lusiferaz tahlilleri gibi yüksek verimli metodolojiyi kullanır.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Burada, 1) bilinen ve yeni miRNA'ları daha doğru bir şekilde tanımlayabilen ve 2) tam otomatik ve serbestçe kullanılabilen yeni ve tam otomatik bir miRNA boru hattı olan mirMachine'i sunuyoruz. Kullanıcılar artık tam otomatik mirMachine işlem hattını çalıştırmak için kısa bir gönderme komut dosyası yürütebilir.

mirMachine: Tesis miRNA Ek Açıklaması için Tek Noktadan Çalışan Bir Dükkan

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, Target ID Kütüphanesi ile miRNA hedeflerini tespit etmek için yüksek verimli genomik tarama yöntemini. Ganciclovir seçimi ve derin dizileme analizi kullanılarak stabil hücre hatları oluşturulur.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Daha fazla video keşfet