MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef ID kütüphanesini kullanarak mikro RNA hedeflerinin yüksek kapasiteli, genom çapında bir taramasını gerçekleştirmektir. Bu, kütüphane plazmidi ile hücre transfeksiyonu yoluyla sağlanır. Klonlanmış cDNA'ların genom çapındaki bir koleksiyonunun transfeksiyonunu, stabil hücre hatları için seçim süreci takip eder.

Ardından, mikro RNA hedefinin ve timidin kinazın birlikte ekspres edilmesini sağlamak amacıyla, oluşturulmuş kütüphane hücreleri mikro RNA ekspresyon konstrüktü ile transfekte edilir. Bu noktada, timidin kinaz ekspresyonuna karşı seçilim yaparak, spesifik mikro RNA hedeflerini eksprese eden hücreleri seçmek için gansiklovir kullanılır. Mikro RNA hedef bölgelerini içeren CD NA'lar, mikro RNA kütüphane hedeflerini dizilemek ve tanımlamak amacıyla hedef ID amplifikasyon primerleri kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.

Sonuç olarak, derin sekanslama analizine dayalı olarak hücrelerdeki spesifik mikro RNA hedeflerini belirleyen sonuçlar elde edilir. Görev hedef kimliği kütüphanesi, mikro RNA için gen hedeflerinin keşfedilmesine ve tanımlanmasına yardımcı olmak üzere tasarlanmıştır. Burada, bu kütüphanenin kullanımını ve uygulamasını gösteriyoruz.

Bu protokole başlamadan önce, ilgilenilen IRA'yı eksprese etmeyen veya düşük seviyelerde eksprese eden bir hücre hattı seçin ve hücreleri yaklaşık %80 konfluensle 2 × 10⁷ hücre elde edecek şekilde genişletin. Tripsinizasyon sonrası hücreleri 15 mL'lik steril, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve tripsinize edilmiş hücreleri 200 ×g'de beş dakika boyunca pelletleyin. Besiyerini uzaklaştırdıktan sonra hücre pelletini yeniden süspanse edin; yıkamak için hücreleri tekrar santrifüjleyin ve yıkama işlemini ikinci kez tekrarlayın.

Bu sırada, her tüpe iki mikrogram hedef ID kütüphanesi ekleyerek, transfekte edilecek sayı kadar 0,5 mililitrelik tüp hazırlayın. Şimdi, her bir transfeksiyon için 600 mikrolitre maxim Nucle affection çözeltisi kullanarak 15 mililitrelik tüp içindeki hücre peletini yeniden süspanse edin. İşlemi her seferinde tek bir reaksiyon için gerçekleştirin.

Alikota 100 µL hücre ve 2 µg plazmid ekleyip pipet ucuyla karıştırın. Her karışımı bir nükleer efektör vete'ye aktarın. Bir vete'yi nükleer efektör cihazına yerleştirin ve hücre hattı için uygun, optimize edilmiş programı çalıştırın.

Ardından, bir transfer pipetini önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurun. Transfekte edilmiş hücreleri aynı pipetle çekin ve önceden hazırlanmış altı kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bu işlemi, her bir NU nükleer etkileşimi için NU nükleer etkileşimini takip ederek tekrarlayın.

Hücreleri ertesi gün gece boyu inkübasyon için büyüme odasına geri koyun. Besiyerini değiştirin ve hücrelerin üç ila beş gün boyunca toparlanmasına izin verin. Hücreler toparlandıktan sonra, besiyerini uzaklaştırın ve TKZO füzyon proteininin stabil entegrasyonu ve ekspresyonu için seçim yapmak amacıyla uygun düzeyde eosin içeren tam besiyeri ekleyin.

Eozin konsantrasyonu, metinde açıklandığı şekilde önceden belirlenebilir. Hücre canlılığı üzerinden eozin seleksiyonu için hücreleri izleyin. Besiyerini her iki ila üç günde bir taze eozin içeren besiyeri ile değiştirin.

Altı kuyucuklu plaka içindeki hücreler konfluens olduğunda, hücreleri daha büyük flasklara pasajlayın ve genişletin. Çalışmada kullanılan seleksiyon reaktifleri için minimum letal dozu belirlemek amacıyla bir öldürme eğrisi (kill curve) analizi gerçekleştirilir. İstenmeyen fenotipik yanıtları önlemek için, öldürme eğrilerini uygulamadan önce hücreleri ilk olarak, her bir kuyucuğunda 120 µL taze besiyeri bulunan 96 kuyucuklu bir plakaya ekleyin ve işlemi ertesi gün gerçekleştirin.

Seçilen kuyucuklara ilaç ekleyin. miRNA ekspresyon konstrüktünün entegrasyonunu seçmek için Antibiotics G four 18 veya pure mycin kullanılır; timidin kinaz ekspresyonuna karşı seçim yapmak için ise asiklovir kullanılır. İnkübasyon sırasında, her iki günde bir her ilaç konsantrasyonu için hücre canlılığını inceleyin. Seçim reaktifi içeren besiyerini her üç günde bir yenileyin.

İlaç konsantrasyonları belirlendikten sonra, söz konusu hücre tipi ve deney için, hedeflenen süre sonunda tam hücre ölümüne neden olan minimum seleksiyon reaktifi konsantrasyonu kullanılmalıdır. Hedef ID Kütüphanesi hücrelerini 2 x 10⁷ hücreye ulaşacak şekilde büyüterek ve genişleterek MI için bir transfeksiyona hazırlayın. Hücreler %80'in üzerinde konfluense ulaştığında tripsinize edin.

Hücreleri 15 mililitrelik steril vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve 200 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Besiyerini uzaklaştırın ve hücre peletini daha önce yapıldığı gibi iki kez yıkayın. Ardından, her bir transfeksiyon için 0,5 mililitrelik bir tüpe iki mikrogram MIRA ekspresyon plazmidi ekleyin.

mRNA'nın kütüphane hücrelerine NU nükleer transfeksiyona benzer şekilde, hedef ID kütüphanesinin transfeksiyonu için kullanılan yöntemle gerçekleştirin. Hücreler üç ila beş gün boyuncale toparlandıktan sonra, besiyerini öldürme eğrisi testinden belirlenen uygun seviyedeki antibiyotiği içeren tam besiyeri ile değiştirin.

Antibiyotik seçimi için hücreleri izleyin ve her iki ila üç günde bir besiyerini antibiyotik içeren besiyeri ile değiştirin. Altı kuyuklu plakada konfluens sağlandığında, hücre havuzunu pasajlayın ve daha büyük flasklara genişletin. Daha önce olduğu gibi, besiyerini uygun seviyelerde GCV ve antibiyotik içeren taze besiyeri ile değiştirin.

Hücrelerin timidin kinaz ekspresyonunu ve mRNA ekspresyonunu hücre canlılığı aracılığıyla izleyin ve hayatta kalan hücreleri GCV ve antibiyotik varlığında çoğaltın. Ardından, GCV ile seçilen hücrelerden genomik DNA hazırlayın. Seçilen kütüphane insertlerini kit primerleri ile PCR ile amplifiye edin ve yazılı protokolde açıklandığı şekilde subklonlayın.

Ardından amplifikasyon primerleri ile sekanslama reaksiyonları gerçekleştirilebilir. Son adım olarak, bilinen transkriptler için insan transkriptomuyla ve yeni transkriptler için insan genomuyla sekansların blast hizalaması yapılarak gen hedefleri belirlenir. Mere 3 73 eksprese eden bir konstrükt, MC yedi kütüphanesine stabil olarak transfekte edilmiş ve mere 3 73 hedeflerini eksprese eden hücreleri zenginleştirmek için gansiklovir içeren ortamda seçilmiştir.

Kütüphane içermeyen MCF seven hücreleri, timidine kinaz eksprese etmedikleri için GCV'den etkilenmezler. Öte yandan, C seven kütüphane hücreleri timidine kinaz eksprese ederler ancak parlak mavi boyayı alan canlı hücrelerin gösterdiği üzere, 8 veya 16 µM gansiklovir ile tamamen öldürülmezler. Buna rağmen, ortamlarındaki fenol kırmızısı boyasının renginden anlaşıldığı üzere, kütüphane hücreleri GCV varlığında büyümeyi durdururlar.

Durdurulmuş hücreler ortamlarını asitleştirmezler ve renk kırmızımsı kalır. Turuncuya dönmek yerine, hayatta kalan hücrelerden sarı hedef diziler izole edilmiştir. PCR ile çoğaltılmış ve dizilenmiştir.

Yaklaşık 12.000 benzersiz gene eşleşen yaklaşık 12 milyon cDNA okuması elde edildi. Bu benzersiz genlerden 234 tanesi, vuruş sıklığı nedeniyle güvenilir vuruşlar olarak kabul edildi ve yalnızca mere 3 73'e özgüydü. Başlangıçtaki bir karşılaştırma, hedef ID kütüphanesi ile tanımlanan benzersiz genlerin 10 tanesinin tar base'deki daha önce tanımlanmış mere 3 73 hedefleri listesinde de yer aldığını ortaya koydu.

Bu nedenle, bu 10 hedefin büyük olasılıkla mere 3 73'ün geçerli hedefleri olduğu düşünülmektedir ve seçilen başarılı sonuçların deneysel olarak doğrulanması için şu anda karakterizasyonları yapılmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, mikro RNA gen hedefleri için yüksek kapasiteli genom çapında bir tarama gerçekleştirmek amacıyla mission target ID kütüphanesinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.