Name: CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin CompoZr özel çinko parmak nükleazlar ile genom düzenleme yöntemini. Bu teknik, araştırmacıların çeşitli hücre hatlarında spesifik gen knock-out'ları oluşturmasını sağlar ve gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için güçlü bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Özel ZFN Tasarım Süreci <ol><li> ZFN tasarım sürecini hızlandırmak için, bir araştırmacı vermelidir: </li><ul><li> Bu tür gen adı, tür ve gen açıklama / kimlik numarası olarak hedef geni hakkında bilgi. </li><li> Deney A açıkça ifade üzerinde tüm nesnel (örneğin, Knockout veya Knockin) </li><li> Atipik gen yapısı, genetik odağına karışmış özel biyolojisi veya başka herhangi bir genomu homolog bölgeleri içerir geninin hedef herhangi bir spesifik faktörler. </li><li> Çinko parmak için DNA sırası aralığını hedef nükleazlar. </li></ul><li> Sigma biyoinformatik ekibi ilk çinko parmak hedef siteleri geliştirmek için siliko ZFN tasarım yapar. </li><li> İlk ZFN hedef siteleri ZFN bilimsel, teknik danışman verilmektedir. Teknik açıdan daha karmaşık projeler için bu Sigma bilim Proje stratejisi geliştirmek için araştırmacılar ile çalışır. </li><li sigma biyoinformatik ekibi silico zfn tasar i algoritmalar ile bir analizini yapar. bu her potansiyel hedef site b off-hedef siteler genom arama tekrar maskeleme ve snp analizleri><li> Biyoinformatik inceleme için araştırmacı için üst ZFN hedef siteleri sağlar. Potansiyel ZFN hedef siteleri onayı üzerine, bu bilgiler ZFN imalat işlemine başlamak için ZFN Üretim ekibimiz sağlanır. </li></ol> 2. Özel ZFN Üretim <ol><li> Çinko parmak modüllerinin Sigma arşiv onaylanmış ZFN tasarımlar monte etmek için kullanılır. </li><li> Her ZFN tasarım ve montajı dizisi yüksek kapasite klonlama platformda doğrulanır. </li><li> Tüm ZFN tasarımları üretimi her ZFN tamamlandıktan sonra doğrulama gönderilir. </li></ol> 3. Özel ZFNs Geçerliliği <ol><li> Içinde ZFN projelerinsan, fare, sıçan veya CHO türlerin her bir tür için iyi karakterize hücresi hatlarında doğrulanır, bir maya bazlı analiz diğer organizmalara veya hücre tipleri kullanılır. </li><li> ZFN yapıları nucleofection tarafından uygun bir hücre çizgisi içine dağıtılır ve ZFNs ifade edilir. </li><li> DNA ZFN Transfekte hücre havuzu hasat ve faiz bölge PCR amplifiye olduğu edilir. </li><li> Cel-1 deney daha sonra, PCR ürünleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Jel elektroforez valide ZFN aktiviteye Cel-1 testi çalıştırın. </li><li> Cel-1 testi ile doğruladı, en yüksek aktivite ZFN tasarım daha sonra müşteriye sunulmaktadır. ZFNs bir pozitif kontrol olarak Cel-1 deneyi ve genomik DNA için PCR primerleri ile birlikte mRNA ve plazmid DNA ile temin edilir. </li></ol> 4. Nucleofection tarafından geçerliliği ZFNs teslim <ol><li> 2x10 5 hücre / ml nucleofection bir gün önce bir yoğunlukta tohum hücreleri. </li><li> Nucleofection gününde,Hücre Hattı Nucleofector Takımı V çıkarıp oda sıcaklığına getirin sağlar. </li><li> Üreticinin protokolüne göre Nucleofection Çözelti V takviyesi ekleyin. </li><li> Hücreleri hesaplama. Hücre yoğunluğu 2,5-5x10 5 hücre / ml arasında olmalıdır. </li><li> Önceden nucleofection için en azından 20 dakika süreyle 37 ° C 'de bir CO2 inkübatöründe her oyuğa ve pre-ılık orta 2ml sahip bir 6-kuyucuklu plak doldurun. </li><li> 5 dakika 200xg az transfeksiyon başına 2x10 6 hücre (8x10 6 toplam) santrifüjleyin. </li><li> Hank'in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 20 ml ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> Deney tüpleri hazırlayın: (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız) </li><li> Inkübatör gelen adım (6.5) medya içeren 6-iyi plaka çıkarın. </li><li> Nucleofection Çözüm 400 ul (100 ul / reaksiyon) hücreleri yeniden süspanse edin V. </li><li> Her seferinde bir reaksiyon, her bir DNA veya RNA içeren tüp hücreleri 100 ul ilave edin. Transfuygun bir program içeren bir Nucleofector bir küvet 2 mm ve elektroporasyon nucleofect için er karışımı. </li><li> Hemen her numunenin nucleofection sonra küvetine adımda 6-iyi plaka (6.9) den önceden ısıtılmış orta ~ 500 ul eklemek için bir transfer pipet kullanın. Sonra, 6-kuyucuklu plak içinde kalan önceden ısıtılmış orta küvet hücreleri dikkatli bir şekilde transfer. </li><li> Bütün reaksiyonlar bitirmesini ve 37 ° C'de 2 CO inkübatöre 6-kuyulu plakalı dönmek </li></ol> 5.. ZFNs teslimi sonrası Genomik DNA Hasat <ol><li> 6-iyi plakası - toplanmış bütün hücre hasat yoktur. Bu size Cel-1 sindirim ürünlerinin olduğunu onayladıktan sonra tek hücre seyreltme klon hücreleri olması için kültürü korumak için önemlidir. Bir ila üç gün sonra nucleofection GenElute Memeli Genomik DNA kit'i kullanılarak Miniprep kromozomal DNA hazırlamak için hücreler toplanır. </li></ol> 6. Cel-1 Testi <li> PCR primerleri kullanılarak sağlanan, ZFN transfekte örnekleri ve kiti içinde sağlanan pozitif kontrol genomik DNA'dan genomik DNA'yı çoğaltmak. (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız): PCR reaksiyonu aşağıdaki koşullar ile kurulur. </li><li> PCR homoduplexes gelen heteroduplexes oluşturmak için her ZFN tedavi numune artı kontrolünden PCR reaksiyonu 10 ul almak ve bir termalcycler aşağıdaki programı kullanabilirsiniz: 95 ° C'de, 10 dakika 95 ° C ila 85 ° C, -2 ° C / dakika 85 ° C ila 25 ° C, -0.1 ° C / dakika 4 ° C, süresiz </li><li> 42 her bir reaksiyon ve inkübe ° C'de 20-40 dakika için artırıcı madde 1 ul ve Nükleaz S 1 ul (Katalog No: 706.025 Transgenomic gelen) eklenir. </li><li> Böyle DirectLoad widerange DNA Ladder (Katalog No: D7058) gibi uygun belirteçler, (Özel ZFN teknik bülteninde sonuçları görmek) ile% 10 SAYFA-TBE jel sindirimler çalıştırın. </li><li> Üzerindece pozitif sinyal cel-I testi ile ZFN tedavi edilen nüfus tespit edilmiş, klonal izolasyonu ve karakterizasyonu geçin. </li> 7. Klonal İzolasyonu ve Karakterizasyonu <ol><li> FACS ve seyreltme klonlama gibi standart yöntemlerle Tek hücreli klon ZFN tedavi örnekleri. </li><li> Klonlar öbekli malzemesi olarak geri kalanı dondurma, genomik DNA hasat için bazı hücrelerin oranı bölmek, sonra yeterince genişletmek için izin verin. </li><li> Cel-I primerler kullanılarak klonlar genomik DNA'yı çoğaltmak ve Cel-I assay (in çivili WT DNA olan ve olmayan) tarafından amplikon analiz, veya alternatif genotipleme doğrudan devam etmek için bu amplikon kullanın. </li><li> Genotipine aday klonlar tercih edilen bir yöntemine göre düzenlenmiş allelleri sahip olarak tanımlanır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Tüm CompoZr ZFN akışı için bir örnek, Şekil 2'de verilmiştir. ZFNs teslim edilirbunlar, çift-damarlı sonu (DSB) oluşturur uygun bir DNA sekansı ve bağlama çatlatma hücrelere. Doğal onarım sürecini, homolog olmayan (NHEJ), onarım DSB katılmadan bitirmek. Silme, ekleme veya nükleotidlerin yerine bazı durumlarda anormal NHEJ sonuçlarında. Denatürasyon / PCR reaksiyon tavlama aşamasından sonra vahşi tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex oluşumu hasat genomik DNA sonuçlarının PCR amplifikasyonu. Herhangi bir heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 enzim sonuçlar eklenmesi. Cel-1 sonuçları ZFN bölünme onaylamak için PAGE analizi ile çözümlenir. Şekil 3 Cel-1 testi ile beklenen sonuçlar şematik sağlar. Temsilci Cel-1 sonuçları Şekil 4 ve 5'te bulunur Şekil 4 K562 hücrelerinin ZFNs çok aktif bir çift (21%) elde edilen sonuçlar içerir;. Şekil 5'te ZFNs daha az aktif bir çift (% 2.4) elde edilen sonuçlar içerirK562 hücrelerinde. ZFN aktivitesi ebeveyn PCR fragmanı aşağıdaki iki PCR parçaları varlığı ile iki şekil ile teyit edilir. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. Bağlı çinko parmak nükleazlar gösterimi. ZFNs FokI restriksiyon endonükleaz arasında bölünme etki kaynaşmış DNA bağlayan bir çinko parmak oluşan proteinler tasarlanmıştır. Heterodimerleri olarak bağlandığında, ZFNs bir kullanıcı belirtilen DNA dizisinin bir çift sarmallı sonu yaratmak. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Özel ZFN Hizmet İş Akışı şematik. CompoZr ZFNs kullanarak genetiği değiştirilmiş hücre dizisi oluşturmak için iş akışı grafik gösterimi. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Cel-1 testi ve sonuçların şematik. A) ZFN plazmid o r mRNA hücreleri teslim edilir. B) ZFNs bind ifade ve hücrelerin bir kısmı bir çift sarmallı sonu (DSB) oluşturarak hedef sahnelerini kestiler. C) homolog olmayan bazı DSBs aberran onarım nükleotid ekleme veya silme sonuçları katılmadan bitirmek. D) Genomik DNA hücrelerin transfekte havuzundan hasat ve ilgi odağı olarak yükseltilir. EF) PCR ürünü denatüre olduğu ve yabani tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex formasyonu oluşturarak yeniden tavlanır. G) heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 uyumsuzluğu endonükleazlar deneyi sonuçları. H) Cel-1 enzimi digests SAYFA çözümlenir. ImageJ yazılım tarafından belirlenir parenteral bandına ayrışma ürünü oranı gözlemlenmiş, fraksiyon kesilmiş ve ZFNs etkinliğini gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. % 21 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur.:_blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5,"> Şekil 5. % 2.4 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022(2010).</li>
<li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433(2009).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li>
<li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li>
<li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

Araştırmacılar standart Araştırma Lisans Sözleşmesi kapsamında işbirlikçilerine ZFN değiştirilmiş hücreler veya hayvan sağlayabilir. Bu durumda Sigma bir materyal transfer anlaşması Sigma, ZFN müşteri ve onların işbirlikçisi arasında yerine koymak olduğunu sorar. : Araştırma license adresinde görülebilir <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . ZFN modifiye hücreleri Sigma kullanarak bir ticari uygulama için potansiyel varsa daha sonra bir ticari lisans yerine koymak olduğunu sorar. Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Sigma, Inc tarafından desteklenmektedir

Bir kez ZFN modifiye hücreleri bunlar kalıcı olması ve DNA değişiklikler kalıtsal izole edilmiştir. Araştırma yapmak için istenilen genetik değişiklikler ile stabil bir şekilde değiştirilmiş hücre hatları veya ırk hayvanlar oluşturma yeteneği ile sonuçlanır. CompoZr Özel ZFNs genom hücre tipleri çok çeşitli düzenleme için sağlam bir yöntem sağlar. ZFNs ile düzenleme başarılı genomunun Yayın oluşturmak için yeteneği vardır ama insan hücre hatları, fare, sıçan, Zebra balığı, kurbağa, domuz ve CHO araştırma modelleri ile sınırlı değildir. 3,4,5,6,7,8,9 ZFNs düzgün bir hücreye ulaştığında Belirtilen hücre tipinde istenen hedef yerinde çift sarmallı mola sağlanır. Bir hücrenin içinde birden fazla genetik modifikasyon sahip olmak için bir hücreye sıralı çinko parmak değişiklikler yapmak da mümkün. 10 belirli bir hedef sırası seçin ve yalnızca o belirli odağı birden yaratma yeteneği için birincil nedenidir değiştirme yeteneği modifikatyonlar. Analiz CompoZr Özel ZFN belgesi böylece kiti tüm bileşenleri iyice müşteri başarı için onaylanmıştır güvence altına kiti sağlanan çok reaktifleri ile oluşturulur. Başından sonuna kadar, iş akışının önemli adımlar aşağıda sunulmuştur: Hücre klonlama Belirli bir hücre hattı izole etmek ve genişletmek için yeteneği herhangi bir ZFN deneyler başlamadan önce test edilmelidir. Tek hücreleri izole edilmiş ve bir klon-türevi nüfusu mümkün olduğundan emin olmak için genişletilmiş edilmelidir. Bazı hücre hatları bu konuda inatçı, ve bu şartlı medya ile düzenlenmiş klonlar için zenginleştirme, ya da kültür gibi hileler bu zorlukları aşmak için yardımcı olabilir. Uygulama randımanına Teslimat verimlilik Optimizasyonu ZFNs tesliminden önce bir zorunluluktur. Pek çok yöntem lipid bazlı transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofecti dahil olmak üzere kullanılabileceküzerinde. İdeal dağıtım yöntemi uygulama randımanına ve hücre canlılığı en optimal bir karışım elde edildi oluşur. Bu verimlilikler miktarlarının görsel denetim veya FACS 24-48hrs teslimat sonrası bir GFP kontrolü plazmid ve miktarlarının sunarak tahmin edilebilir. Cel-I testi Bu Cel-I PCR testi, sindirim ve elektroforezi parametreleri ZFN deneyi yorumlanması engel olmayacak emin olmak için uygun kontrollerin paralel olarak yapılır şarttır. Her kit analiz sertifikası Cel-I görüntü oluşturmak için kullanılan kontrolü genomik DNA içerir. Cel-I testi ile takip sağlanan primer ile kontrol DNA Amplifikasyon kullanıcı Analiz Sertifikası (CofA) görüntü kaydıyla birlikte sonuçları karşılaştırmak için, izin ve bir deneme bu açıdan herhangi bir potansiyel verimsizlik izole olacaktır. Böyle bir sahte veya GFP gibi uygun bir negatif kontrol hücre muameleÖrnek aynı zamanda herhangi bir spesifik olmayan parçalanma ürünleri ile aydınlatılması izin verilmelidir. Tek hücreli klon Nicel / nitel analizi ZFN tedavisi ve tek bir hücre Klonlamadan sonra, hücrelerin popülasyonlarının bir dizi yöntem ile, ilgilenilen loküsündeki düzenleme bakımından uygun şekilde taranabilmektedir. Cel-I tayini daha genotipleme için aday klonlar belirlenmesi amacıyla klonlar genomik DNA üzerinde yapılabilir. Bu, bir uygulamadan önce 1:01 oranında Örnek amplikonlar içine spike WT PCR amplikon önemlidir Cel-I homozigot mutant molekülleri klonlar homojen içerecek şekilde sindirilmesi, ve böylece bir negatif Cel-I test sonucu iletir. Bu aday klonlar taranması için alternatif bir yöntem doğrudan ZFN hedef site üzerinde bir PCR primer iniş tasarlamaktır. Kontrol primerler biri ile birlikte kullanılan bir negatif assay sonucu WT sekansı kaybına göstermektedir. En az bir WT alel içeren bir heterozigot klonu y olacaktırield PCR sinyali, fakat SYBR qPCR bağlamında PCR yapılarak tamamen WT klonlar ayrılacaktır olabilir. Aday klonlar yukarıdaki yöntemleri ile tespit edilmiş olan bir kez, standart pyrosequencing, derin sekans, ya da diğer yöntemler ile sekans genotyped edilebilir. Tüm sekanslama için yöntemlerle, klonal genomik DNA oluşturulan bir amplikon oluşturulan edilmelidir. Geleneksel pyrosequencing allelleri için TA-klonlama PCR ürünü ile ayrı ve tek tek koloniler sıralama olabilir. Derin bu adımı sıralama gibi yöntemler için gerekli değildir. Homoloji Yönetmen Onarım (HDR) Bu protokol, NHEJ yoluyla ZFN aracılı gen boşaltma için bir yöntem sağlar. Transgenlerin entegrasyonu da kanadında bir kesim ZFN sitesi. 11. Bu senaryoda, ZFN çift sarmallı mola HDR yerine NHEJ ile tamir edilir oluşturduğunuz homoloji silah ile plazmid bir donör tanıtımı tarafından yapılabilir. HDR i yönettitransgenlerin of ntegration bu protokol içinde yer alan prosedürlere benzer yöntemlerle teyit edilebilir. Sorun Giderme ZFNs teslim ZFN teslimat ve ifade teslim bir GFP veya diğer görselleştirme ve / veya kantitatif için plazmid gibi. Teslimi ile de kontrol edilebilir Ilgi ile hücre tipi organizatörü uyumsuzluğu nedeniyle Düşük ifade mRNA formatında ZFNs teslimi ile çözmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, soğuk şok yöntem ayrıca hücreleri ZFNs etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. 12 mRNA kullanılması durumunda bu hücreler her serum kaynaklı Rnases çıkarıldı sağlamak için gerçekleştirilmesinden önce yıkanıp şarttır. Bu buz üzerinde mRNA çözülme ve bozulmanın için herhangi bir şansı en aza indirmek için son anda hücrelere eklemek için de isabetli olmuştur. Cel-I testi Cel-I assa temeliy ilgi odağı belirli ve geniş amplifikasyon olduğunu. Non-spesifik amplifikasyon ürünleri gözlenmesi halinde bu şablonu miktarı optimizasyonu, astar konsantrasyon, ve bisiklet parametre olarak özgüllüğü artırmak için standart PCR sorun giderme yordamları kullanın. Ikinci yöntemi yeterli çözünürlük ve hassasiyet sağlamaz gibi standart agaroz elektroforez aksine PAGE analizi yapın. Herhangi sindirilmiş ürünü ya da aşırı bulaşması görülmektedir halinde Cel-I özeti koşulları da optimize edilebilir. Cel-1 nükleaz ve / veya sindirim süresi yeterli uzunluktaki bir miktarının titrasyonu bu yönleri iyileştirmek için titre edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Nükleaz S (Cel-1 enzim) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Yüksek Sadakat PCR Sistemi genişlet </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Hücre Hattı Nucleofector Takımı V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP Endotoksin-Free Plazmid Maxiprep Kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

compozr Özel Çinko parmak nükleazlar ile genom düzenleme (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genom düzenleme gen fonksiyonu ve hastalığın genetik temeli aydınlatmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. DNA dizilerinin kimyasal tabanlı mutajenez veya rasgele entegrasyonu gibi düzenleme yöntemleri Geleneksel gen genel verimsiz biçimde gelişigüzel genetik değişiklikler görüşmek ve istenmeyen sentetik dizilerinin kuruluş gerektiren veya potansiyel biyolojik çalışmada kafa karıştırıcı, sapkın kültür koşullarının kullanın. Buna karşılık, bir hücreye geçici ZFN ifadesi, hassas kolaylaştırabilir transgenlerin sentetik kimyasalların veya entegrasyon yönetimi için gerek kalmadan çok etkili bir şekilde gen düzenleme kalıtsal. Çinko parmak nükleazlar (ZFNs) çift iplikli DNA (dsDNA), belirgin dizileri bağlanır ve kesilir enzimlerdir. Fonksiyonel bir CompoZr ZFN ünitesi yaklaşık 15-18 nükleotidlerin bir DNA &quot;yarı-site&quot; bağlamak iki ayrı monomerik proteinleri (bkz. Şekil 1) oluşur. Ne zaman iki ZFN monoDNA bölünme etki dimerize ve DNA çift iplikli sonu (DSB). genomunda ZFN aracılı DSBs 1 Giriş yüksek verimli genom düzenleme için bir temel atar oluşturmak onların bitişik hedef sitelerine mers &quot;ev&quot;. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) DNA tamir yolu ile bir hücrede DSBs kusurlu onarım küçük eklemeler ve silmeler (indellerin) neden olabilir. Bu protokolün bir gen eleme oluşturmak için ZFNs kullanımı, transgenlerin entegrasyonu tarif ederken, bir hücrenin geninin kodlayıcı dizisinin içinde indellerin yaratılması da vasıtasıyla yapılabilir frameshift ve yüksek verimle bir gen yerinin. 2 müteakip işlevsel eleme sonuçlanabilir ZFN kesim yerinde homoloji-yönettiği onarım. CompoZr Özel ZFN Servis ZFN teknoloji ile bilimsel topluluk için hedeflenen gen düzenleme için, sistematik, kapsamlı ve iyi karakterize bir yaklaşımı temsil ediyor. Sigma bilim adamları) 1 araştırmacılar ile yakın çalışmak perfoproje hedefleri, 2 uyarınca ilgili gen yapısı, biyoloji ve model sistem analizi) dahil olmak üzere rm özeni analizi daha sonra tasarım, inşa ve işlevsel ilgili bir faaliyet için ZFNs doğrulamak) bir ses hedeflemesi, 3 geliştirmek için bu bilgiyi uygulama hücre hattı. Araştırmacı pozitif kontrol genomik DNA ve astar alır ve plazmid DNA hem de hem de in-vitro transkripsiyon mRNA formatında verilen ZFN reaktifler hazır kullanın. Bu reaktifler sonra araştırıcı hücre hattı veya tercih hücre tipi geçici ifadesi için teslim edilebilir. Örnekler daha sonra, PCR, enzimatik özet ve elektroforez gibi standart moleküler biyoloji teknikleri ile ilgi odağı az gen düzenleme için test edilmektedir. Gen düzenleme için olumlu bir sinyal ilk nüfus tespit edildikten sonra, hücreler klonlanmış tek hücreli ve mutant klonlar / alel belirlenmesi için genotipleme vardır.

CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Genom düzenleme, gen işlevini ve hastalıkların genetik temelini aydınlatmak için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir. ... gibi geleneksel gen düzenleme yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir lokusta bozucu bir mutasyon oluşturmak ve nihayetinde bir nakavt hücre hattı yaratmak için özel olarak tasarlanmış bir çinko parmak nükleaz (ZFN) kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle hedef genin DNA dizisinin composer algoritmasıyla analiz edilip in silico ZFN tasarımlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. ZFN'ler birleştirilir, nükleer transfeksiyon yoluyla hücrelere aktarılır ve nakavt hücre hattı oluşturmak amacıyla ilgili gen hedef bölgelerindeki aktiviteleri açısından taranır.İlgilenilen hücre tipi öncelikle aktif bir ZFN ile işleme tabi tutulur. Ardından bu popülasyon tek hücrelere ayrıştırılır. Son olarak, bu klonal popülasyonlar ek genotipik karakterizasyon için genişletilir. Hedef bölgede bozucu non-homolog uç birleşme olayları gösteren klonlar, fonksiyonel gen nakavtı bağlamında daha ayrıntılı olarak incelenebilir.Nihayetinde, ZFN aracılı genetik modifikasyon sonucunda hücresel fenotipte gözlemlenen değişiklikleri doğrulamak için hücre bazlı analiz ve DNA dizileme dahil olmak üzere genetik karakterizasyon gereklidir. Çinko parmak nükleazların, geleneksel homolog rekombinasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ZFN ile etkinleştirilen gen düzenlemenin, araştırmacıların seçilim yapmadan spesifik ve öngörülebilir genetik modifikasyonlar oluşturmasına olanak tanımasıdır.Buna gen nakavtları, gen modifikasyonları ve gen entegrasyonları dahildir. ZFN tasarım süreci, gen nakavtının gerçekleştirilmesine elverişli, yeterli sayıda ve kalitede çinko parmak bağlanma motifleri içeren benzersiz dizi bölgelerinin belirlenmesine odaklanan basitleştirilmiş biyoinformatik çalışmalarla başlar. Açıkça belirtilmiş bir deneysel stratejinin yanı sıra; atipik gen yapısı, genetik lokusla ilişkili özel biyoloji ve genomun başka yerlerindeki herhangi bir homolog bölge gibi hedef gene dair bilgiler bu süreci büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.Daha karmaşık projeler için, bir sigma bilim insanı araştırmacılarla yakın iş birliği içinde çalışacaktır. ZFN'ler in silico olarak tasarlanır ve tüm genomdaki hedef dışı bölgeler öngörülür. Her potansiyel ZFN hedef bölgesi için tekrarlayan dizi maskeleme ve snip analizi de gerçekleştirilir.ZFN üretimi öncesinde en iyi ZFN hedef bölgeleri gözden geçirilir. Araştırmacılar sık sık, ZF N'ler benim projem için işe yarar mı diye sorarlar. Bu soruyu en iyi şekilde yanıtlamak için birkaç temel hususu dikkate almalıyız.İlgilendiğiniz hücre tipinde tipik bir ekspresyon kasetini verimli bir şekilde aktarabiliyor ve ifade ettirebiliyor musunuz? Tek hücreli klonları izole edip ardından çoğaltabiliyor musunuz? Ve son olarak, hedef geninizin nakavt edilmesi sonucunda hücre büyümesi veya hücre canlılığı üzerinde zararlı bir etki oluşuyor mu?Bu soruların cevapları, bir projenin fizibilitesini kesin olarak belirleyebilir veya belirlemeyebilir. Bununla birlikte, bu cevaplar belirli bir projenin ne kadar kolay veya zor olabileceğini ölçmemize olanak tanır veya iş akışının başarı için kritik olan belirli yönlerine ışık tutabilir. Sigma, onaylanmış ZFN tasarımlarını oluşturmak için çinko parmak modülleri arşivini kullanır.Her bir ZFN tasarımı, yüksek verimli bir klonlama platformunda birleştirilir ve dizilimi doğrulanır. Ardından ZF NS'ler, plazmid DNA formatında ilgili, iyi karakterize edilmiş hücre hattına aktarılır ve 24 ila 48 saat içinde yeterince eksprese edilir. Daha sonra ZFN ile işlem görmüş hücrelerin her bir havuzundan genomik DNA hasat edilir ve ardından ZFN hedef bölgesinin PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir.PCR ürünleri üzerinde bir hücre tekli analizi gerçekleştirilir ve ZFN aktiviteleri jel elektroforezi ile değerlendirilir. En yüksek aktiviteye sahip ZFN tasarımı teslim edilir. Ayrıca, analiz sertifikasında gösterilen sonuçların tekrarlanabilmesi için PCR primerleri ile birlikte pozitif kontrol genomik DNA sağlanır.ZFN deneyinize başlamak için, nükleer transfeksiyondan bir gün önce hücreleri mililitre başına 200,000 hücre yoğunluğunda ekerek başlayın. Ertesi gün hücreleri sayın ve işleme devam edin. Hücre yoğunluğu mililitre başına 250 ile 500,000 hücre arasındaysa, çalıştığınız hücre hattı için üretici protokolüne uygun olarak nükleer transfeksiyon çözeltisi V'yi hazırlayın.Şimdi, altı kuyucuklu bir plakayı kuyucuk başına iki mililitre besiyeri ile doldurun ve plakayı bir inkübatörde en az 20 dakika boyunca ısıtın. Nükleofeksiyon başına 2 milyon hücreyi santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri 10 mililitre HBSS içerisinde nazikçe yeniden süspande edin. Ardından yıkama prosedürünü bir veya iki kez daha tekrarlayın. mRNA formatında iletilen ZFN'ler, tipik olarak plazmid DNA formatında iletilen aynı ZFN'lere göre daha yüksek gen düzenleme frekansları sağlar.Bununla birlikte, ZF NS'nin mRNA formatında iletilmesi, degradasyonu önlemek için birkaç ek önlem almamızı gerektirir. Öncelikle, serum kaynaklı RNA'ları uzaklaştırmak için hücrelerinizi iki ila üç büyük hacim PBS veya HBSS ile yıkayın. Ayrıca, deney süresince mRNA'nızı daima buz üzerinde tutun.Son olarak, degradasyonu önlemek için mRNA'yı hücrelerinize mümkün olan en son anda eklediğinizden emin olun. Ardından, özel ZFN teknik bültenindeki tabloya göre deney tüplerini hazırlayın. Her transfeksiyon için hücreleri 100 µL nükleer affeksiyon çözeltisi V içinde yeniden süspanse edin. Her seferinde tek bir reaksiyon hazırlayın.DNA veya mRNA içeren her tüpe 100 µL hücre ekleyin. Ardından, her karışımı iki milimetrelik bir elektroporasyon küvetine aktarın. Her örneğin nukleofeksiyon işleminin hemen ardından, hücreleri uygun programla nukleofekte edin.Hazırlanmış altı kuyucuklu plakadaki bir kuyucuktan bir buçuk mililitre ısıtılmış besiyeri eklemek için bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri dikkatlice qve'den kalan besiyerine aktarın. Tüm reaksiyonları o kuyucukta tamamlayın ve plakayı bir ila üç gün boyunca inkübatöre geri yerleştirin.Nükleofeksiyon sonrası, havuzlanmış hücrelerin tamamını toplamanıza gerek kalmadan, genal loop memeli genomik DNA mini prep kiti kullanarak genomik DNA'yı izole edin. Ardından, ZFN transfekte edilmiş örneklerden ve kit içerisinde sağlanan pozitif kontrol genomik DNA'sından genomik DNA'yı PCR ile çoğaltmak için verilen primerleri kullanın.Her bir PCR ürününü bir mikrolitre enhancer ve bir mikrolitre nükleaz S ile sindirin. Bunları 42 °C'de 20 ila 40 dakika inkübe edin. Ardından, ZFN ile işlem görmüş örneklerin tek hücre klonlamasını yapıp klonların yeterince genişlemesine izin verdikten sonra, sindirim ürünlerini direct load wide range DNA ladder gibi uygun markörler kullanarak %10'luk TBE jelinde yürütün.Genomik DNA için hücrelerin bir kısmını hasat edin, kalan hücrelerin kültürüne devam edin veya yedek materyal olarak dondurun. Genomik DNA'yı cell one primerlerini kullanarak amplifiye edin ve ürünü, bir bire bir oranda yabanıl tip amplikon eklenmiş ve eklenmemiş halleriyle cell one analizi ile inceleyin. Alternatif olarak, dizileme veya tercih edilen diğer yöntemlerle aday klonların genotiplendirilmesine doğrudan geçmek için bu amplikonu kullanın.Bu örnekte, bir çift ZF NS ve K 5 62 hücresinin aktivitesini tahmin etmek için hücre bir deneyi kullanılmıştır. Glan pozitif kontrolü temsil eder ve Z şeridi, hatalı eşleşmiş PCR fragmanlarının frekansının bu verilerden tahmin edildiği kesim ürünlerini göstermektedir; ZF N aktivitesi tahmini %21 olarak bulunmuştur ki bu oldukça yüksek bir değerdir. Burada farklı bir ZF ns çiftinin aktivitesini gösteriyoruz.Bu ZFN çifti diğerine göre önemli ölçüde daha az aktif olsa da hala etkiliydi. Hücre popülasyonunun %2.4'ünde indel oluşturduğu tahmin edilmektedir. ZF X ile çalışmaya ilişkin daha kritik parametrelerden bazıları, kullandığınız hücre tipinde iletimin ve ekspresyonun optimizasyonudur.Bu parametreler optimize edilerek, gen nakavtının izole edilmesi için gereken zaman ve çaba önemli ölçüde azaltılabilir. Clone Z fns, doğru şekilde ve uygun bağlamda kullanıldığında, hedeflenmiş genom düzenleme için oldukça hassas bir araç sunar. Bu araç, bilim insanlarına hemen hemen her gen ürünü veya yolağının biyolojisini incelemek için çok hızlı ve etkili bir yöntem sağlayabilir.

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Örneğin çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlara (TALENS) olarak tasarımcı nükleazlar homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ile homolog yeniden birleştirmeye (HR) yolaklar tetikleyerek fare preimplantasyon embriyoların genomunu değiştirmek için kullanılabilir. Bu gelişmeler kesin genetik değişiklikler farelerde hızlı üretimini sağlar.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Muhabir hücre çizgileri, görselleştirmek etiket ve heterojen popülasyonlar ilgi hücreleri izole etmek için bir araç sunmaktadır. Bununla birlikte, hedef gen, insan embriyonik kök hücreleri alışılmış homolog rekombinasyon kullanılarak son derece verimsizdir. Bu yazıda, çinko-parmak nukleaz gelişmiş homolog rekombinasyon kullanarak EGFP ile CNS Ortabeyin özel transkripsiyon faktörü PITX3 odağı hedefleme açıklar.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Hedeflenen genom modeli sistemi Danio rerio (zebra balığı) düzenleme büyük ölçüde CRISPR tabanlı yaklaşımlar ortaya çıkması tarafından kolaylaştırdı. Burada, akıcı, sağlam bir iletişim kuralı üretimi ve heteroduplex hareketlilik tahlil birleştirmek CRISPR elde edilen saçma allelleri tanımlaması ve yeni nesil sıralama kullanarak mutasyonlar tanımlaması için açıklar.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Keşfedin CompoZr özel çinko parmak nükleazlar ile genom düzenleme yöntemini. Bu teknik, araştırmacıların çeşitli hücre hatlarında spesifik gen knock-out'ları oluşturmasını sağlar ve gen fonksiyonlarını in vivo çalışmalar için güçlü bir platform sunar.

CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Daha fazla video keşfet