Name: MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, LentiPlex shRNA kütüphanesiyle memeli hücrelerinde pozitif seçim taraması yaparak hücre sağkalımını artıran gen hedeflerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, yüksek verimli fonksiyonel genomik araştırmalar için güçlü bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MİSYON Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır. LentiPlex Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP&#39;nin ticari markasıdır.

LentiPlex Pooled Ekranı Ilgi shRNA dizileri tanımlamak için, bu hücrelerin büyük çoğunluğu sadece bir shRNA inşa aldığınız ekran kurmak için kritik öneme sahiptir. (Enfeksiyon çokluğu) İçişleri Bakanlığı düşük kullanarak, hücre başına birden fazla integrants olasılığı büyük ölçüde azalır. Ancak, transdüksiyon verimliliği ve bu nedenle istenilen Mois, hedef hücre tipine çok bağlıdır. Bu nedenle, optimal İçişleri Bakanlığı belirlenmesi, yeni bir hücre tipi ekran başlamadan önce gerçekleştirilen olduğunu zorunludur. 1. Misyon LentiPlex hedef hücrelerin İletimi shRNA Kütüphane Pooled <ol><li> Farklı hücre tipleri için kullanılan İçişleri Bakanlığı gerçek değişecektir. Istenen çoğaltır Eğer plaka sayısı buna göre artmış olmalıdır. Buna ek olarak, genellikle farklı alt havuzlar birleştirmek için avantajlı olmaz. Alt havuzlar ayrı tutulması deconvolution sürecinde yardımcı olacaktır. Prope oluntransdüksiyon sırasında uygulanan alt havuzudur numarası ile her doku kültürü çanak r etiketleme. İçişleri düşük bir hücre başına birden fazla integrants olasılığını azaltmak için tavsiye edilir. </li><li> 1. Gün - 60 mm yemeklerin ertesi gün (toplam = 30 yemekler toplam üç nüsha olarak yapılan her 10 havuzları,) ~ 70% confluency elde etmek için yeterli hücreleri ile Tohum uygun sayıda. Çalışma için, 60 mm yemekleri önce transdüksiyon% 70 confluency ulaşmak için 6 x 105 A549 hücreleri ile ekilirler. Bu hücreleri hala üstel büyüme aşamasında olmasını sağlar. Büyüme oranları hücre tipine göre değişir ve ekran başlamadan önce tespit edilmelidir. </li><li> Hücreler 37 geceleme kuluçka ° C,% 5 CO 2 atmosferinde nemlendirilmiş bir inkübatör uyması izin verin . </li><li> (Opsiyonel), negatif kontrol shRNAs transdüksiyon için iki ek 60 mm yemekler ekleyin. Bulaşıkları Label "Kontrol" SHC001H ve "Denetim B" SHC002H için. </li><li> 2. Gün - Transduce inciLentiPlex viral parçacıkları ile e hücreleri. Iletimi gününde, buz lentiviral parçacıkları çözdürün. </li><li> Laminer akış kaputu çözülmüş parçacıkları aktarın ve kullanıldıktan hemen değilse buz üzerinde tutmak. </li><li> Hesaplayın ne kadar, tüm hücre kültürü yemekleri arasında İçişleri Bakanlığı 1 hücrelere eklemek için her bir viral alt havuzu. <ol><li> Örnek: 1 x 10 6 hücre / çanak, Viral titresi = 5 x 10 8 TU / ml; istenen İçişleri Bakanlığı 1. i.) 1 x 10 6 hücre / çanak x (İçişleri Bakanlığı 1) = 1 x 10 6 transducing birimi (TU) gerekli ii) 1 x 10 6 TU / (5.0 x 10 8 C elde TU / ml) lentiviral stok solüsyonu A = 2 mcL uygun çanak eklenmelidir. Hücre kültürü çanak virüsün daha iyi dağılımını sağlamak amacıyla tam bir medya 100-300 mcL virüs hesaplanan miktar seyreltilir. </li></ol></li><li> Öncesi numaralı seribaşı hücreleri medya çıkarın. Eksiksiz bir medya contaHer çanak ining hexadimethrine bromür çözüm. Medya hexadimethrine bromür önerilen nihai konsantrasyonu 8 mg / ml. Eğer hedef hücrelerine toksik bulursanız hexadimethrine bromür daha az kullanın. </li><li> Önceden belirlenmiş bir deney tasarımı uyarınca uygun yemekleri shRNA lentiviral parçacıkları ekleyin. Yavaşça girdap plakalar eşit hücreler boyunca virüs dağıtmak için. </li><li> 37 az 18-20 saat inkübe ° C,% 5 CO2 bir atmosfer nemlendirilmiş bir inkübatör . </li><li> (Opsiyonel) A ve Kontrol Bulaşık B. SHC002H (shRNA kontrolü şifreli) aynı deney boyunca deneysel yemekleri bu yemekleri davranın Kontrol Bulaşık (boş vektör shRNA Kontrolü) SHC001H ile İçişleri Bakanlığı aynı tekrarlayın 3-8. </li><li> 3. Gün - medya değiştirin. Aspire virüs içeren medya ve taze eksiksiz bir medya (hexadimethrine bromür olmadan) ekleyin. ° C gecede 37 hücreleri inkübe edin. </li></ol> 2. Kaplama davranınterapötik bileşen / reaktif hücreler <ol><li> 4. Gün - kuyulardan aspire medya ve optimum konsantrasyonda tedavi bileşeni içeren taze medya ekleyebilirsiniz. Kültür koşullarında olduğu gibi, tedavi değişecektir ve uygun konsantrasyonları ve süreleri önceden tespit edilmelidir. Bizim çalışmamızda, TRAIL ve 1 mcM Paklitakselin 100 ng / ml kullanılır. Hücreler 48 saat süreyle tedavi edildi. </li><li> T75 şişeler içine Surviving hücreleri yeniden numaralı seribaşı ve neredeyse% 100 konfluent kadar genişletmek için izin olmalıdır. </li><li> (İsteğe bağlı) seçim sonunda, A ve Kontrol Bulaşık B. Bulaşık A ve B Bulaşık her toplanmış kütüphane yemekleri en az biri daha az koloniler olmalıdır Bulaşık Kontrol inceleyin. Bulaşık koloniler beklenmedik şekilde yüksek bir sayı varsa, ya transdüksiyon süreci istenilen fenotip veya seçici basınç ile ilgili bir yol etkiledi daha testinin yeterince güçlü ve yeniden optimizasyon gerekli olabilir. Bulaşık B, pek çok koloniler içeriyorsaRNAi yolun shRNA ve nişan ifade ilgi fenotipi üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir. Bu etkisi SHC002H özgü olmadığından emin olmak için SHC001H durumda tekrar. </li></ol> 3. Poliklonal bir hücre popülasyonu gelen deconvolution <ol><li> Her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus Hasat ve genomik DNA izole. Çalışmada, hücreler PBS içinde kısaca yıkanmış ve GenElute Memeli Genomik Miniprep kiti ve temin protokolü (Sigma-Aldrich, G1N70) kullanılarak genomik DNA izole önce tripsinize. Alternatif olarak, şu anda piyasada bulunan herhangi bir diğer genomik arıtma kitleri DNA izolasyonu için kullanılabilir. Kültür hücrelerinin başlangıç ​​değeri için protokol tavsiyelerini takip etmek önemlidir. </li><li> PCR hedefleri. ShRNA şablonu kurtarma yordamı shRNA ekler seçilen hücre popülasyonu tüm havuzun amplifikasyon, ya da vermemek alınmasını sağlartek tek aldı ve genişletildi koloniler çift shRNA şablonları. ShRNA kontrolü ve seçilen hedef hücreleri ekler amplifikasyon sonra, PCR ürünleri sıralı olabilir. </li><li> Bu PCR adım Sigma Readymix, Katalog No P2893 kullanılarak optimize edilmiştir. Diğer reaktifler amplifikasyonu için kullanılan, ancak bisiklet koşullar ve / veya magnezyum konsantrasyonu başarılı amplifikasyon için modifiye edilmesi gerekebilir. Konsantrasyonu 20 mM Amplifikasyon primerler LentiPlex kiti ile yer almaktadır. </li><li> Tablo 1'de açıklandığı gibi PCR ayarlayın. Listelenen sırada bileşenleri ekleyin. Açıklanan tutarlar 50 mcL reaksiyon için. Daha fazla reaksiyonlar için istenen reaksiyonlar sayısına göre master miks bileşenleri ölçekli ve% 10 tutarı düşmek. Tavsiye DNA örneğinin miktarı 50-100 ng. </li><li> Bu güçlü bir reaksiyon için şablon appropr seyreltilmiş MİSYON shRNA İnsan Pozitif Kontrol Vektör oluşur tavsiye edilirkonsantrasyon iate. Bu şablonu ile başarılı amplifikasyon PCR bileşenleri ve bisiklet koşulları yeterli olduğunu gösterir. NOT: deneysel numuneler ve reaktifler kontaminasyon önlemek için, pozitif kontrol sonraki PCR reaksiyonları yerden ayrı bir yerde seyreltilmiş olması tavsiye edilir. </li><li> PCR içine Tablo 2'de listelenen PCR programı kaydedin. </li><li> Her bir örnek için, DirectLoad 5 mcL yanında boya ve electrophorese 1 mcL ile 3 mcL PCR ™ PCR 100 baz puan (bp) Düşük Merdiven, Katalog Numarası D3687% 1 agaroz jel üzerinde 309 bp Amplikon varlığını doğrulamak için birleştirir. </li><li> PCR amplikonlarının Subcloning: PCR ürünleri TOPO (Invitrogen, K4575-01), üretici protokolü takip TOPO-TA klonlama kiti kullanarak klonlanmış. Sonuç, bir PCR ürünü her vektör bulunan olmasıdır. </li><li> 250 Bireysel bakteri kolonileri izole (her bir birey PCR Amplikon içeren) ve büyümeye edildin, 100 mg / ml ampisilin ile 2 ml LB kültürlerde. Plazmid DNA GenElute Plazmid Miniprep kiti (Sigma-Aldrich, PLN70) kullanılarak elde edildi. </li><li> Saf EcoRI plazmid DNA ile sindirilir ve eklemek varlığını doğrulamak için electrophoresed. </li><li> Plazmid DNA örnekleri daha sonra sıralı ve shRNA eklemek LentiPlex kütüphanesi ile sağlanan LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. </li></ol> 4. Hedef Belirleme ve Doğrulama <ol><li> ShRNA GAAACACCGG-5'-3 'dizisini başlatır. Arama kutusuna sorgu sırası kapalı shRNA Sıra Arama Access veritabanı form üzerinde en az 10 Bundan sonraki ama en az 21 nükleotidler girin. </li><li> Toplanmış shRNA türler seçin. İsteğe bağlı olarak, alt havuzudur dizisi bulundu seçin. </li><li> Şimdi arama yapmak için "Potansiyel Hitler Bul" butonuna tıklayın. Bu th eşleşen ilgili TRC shRNA dizi (ler) tanımlamak gerekire veri sıralama. TRC shRNA dizisi hakkında daha fazla bilgi (ler) inin ve ilgili gen hedefleri Sigma-Aldrich En Gen kolayca bulunabilir: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Belirlenen hedef genler orijinal TRC klon artı 1 shRNA 1 kuyusunda formatında kullanarak aynı genin hedef en az iki ek shRNAs orijinal tarama testinin tekrar valide edilmelidir. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda aynı fenotipi gösterecektir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar LentiPlex toplanmış ekran iş akışı bir örnek Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. TRAIL ve Paklitakselin huzurunda çoğaldı ki Transduced hücreleri şişeler konfluent kadar genişletmek için izin verildi. Genomik DNA hasat ve PCR ve klonlama tabi Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıralama ve shRNA kimlik sunulmadan önce figu açıklananre 1 C. 250 klonları bu 25, sıralı birden fazla klonları tarafından temsil edildi ve geri kalan 225 sadece 1 klon tarafından temsil edildi ve şu anda takip değildi. Şekil 2'de görüldüğü gibi, TBX3, PPP2CA ve AKT2 dahil olmak üzere birçok aday genler birden fazla klonları tarafından temsil edilmiştir. T-box transkripsiyon faktörü, TBX3 toplam dört klonların ortaya çıktı ve 5 tümör göç suçlanmıştır. PPP2CA baskılanması androjen yoksunluğu ile indüklenen hücre döngüsü tutuklama giderici ve 6 apoptozis önlenmesi androjen eksikliği koşullarında kültür LNCaP hücrelerinin büyümesini sürdürmek için kanıtlanmıştır. AKT2 kanser gelişimi 7, 8 birkaç rol oynadığı gösterilmiştir RAC-beta serin / treonin protein kinaz ve varsayılan onkogen. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> * Final konsantrasyon Mg 2 + çözümü 3 mM olacak;Taq Readymix ve Magnezyum klorür solüsyonu 1.5 mM 1.5 mM katkıda bulunulmuştur. (Tablo 1). Lentiplex PCR Reaksiyon Koşullar <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tablo 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 2"> (Tablo 2). Lentiplex PCR Amplifikasyon Programı <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Şekil 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1c"> Şekil 1. (A) LentiPlex, ekran havuzlu (B) Poliklonal deconvolution iş akışı, (C) ve shRNA hedeflerin belirlenmesi. A. LentiPlex ekran toplanmış, Tohum hücreleri, daha sonra (toplam 10 havuzları, her üç nüsha olarak yapılan, toplam 30 yemekleri için), shRNA alt havuzlar ekleyin. Sonra, tedavi bileşen / reaktif (bizim durumumuzda, TRAIL ve Pa ile tedavisırasıyla clitaxel). Sonra hayatta kalan hücreler, matara kalkarlar ve genişletilmesine izin verir. Hasat her bir alt havuzudur hücreleri heterojen nüfus ve genomik DNA izole. B. Poliklonal deconvolution. ShRNA eklemek içeren DNA yükseltmek için PCR gerçekleştirin. Şablon gDNA da poliklonal beri PCR ürününün boyutu, üniforma, ama sırayla poliklonal. PCR ürünü vektör klonlanmış ve daha sonra yetkili bakteri dönüştü. C. shRNA hedeflerin belirlenmesi. Bireysel koloniler izole edilir ve plazmid DNA elde edilir. Her klon, tek PCR parçası ile klonlama vektörü içerir. Plazmid DNA ekleme ve sıralı varlığını doğrulamak için sindirilir. ShRNA eklemek LentiPlex shRNA Sıra Ara veritabanı kullanılarak belirlendi. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Can Belirlenendidate Genler 25 aday genler birden fazla isabet ettiğini tespit edildi. 225 aday genler sadece 1 isabet etti ve takip değildi. Ek Tablo 1 aday gen tek başına klonların bir arıza için bakınız. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Ek Tablo 1. Bireysel TRC Kütüphane klonlar Poliklonal Sıralama Gen ID itibaren Belirlenen Algılandı Klonlar Hits

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

Matthew J. Coussens, Courtney Corman, Ashley L. Fischer, Jack Sago, ve John Swarthout Bu makalede kullanılan alet ve reaktifler yapar Sigma-Aldrich tarafından istihdam edilmektedir.

Bu çalışmada, paklitaksel / TRAIL tedavisi aşağıdaki A549 hücreleri sitotoksisiteye ilgili genleri tanımlamak için bir genom-geniş ekran mevcut. Havuzlu bir genom-geniş ekran bir yaklaşım, zaman, maliyet ve normalde geleneksel dizilmiş ekranlar ile ilişkili ekipman yatırımı azaltır. Ekran başarısı için kritik, önceden yapılan optimizasyon deneyler. İletimi koşulları ve İçişleri Bakanlığı ampirik olarak tespit edilmelidir. Seçim yöntemi, istenilen fenotip (örneğin, hayatta kalma, yüzey protein ekspresyonu, vb.) Hücrelerinin sağlam seçimi için izin vermelidir. Bu parametrelerin optimizasyonu tespit yanlış pozitiflerin sayısını azaltacaktır. Burada, seçili hücrelerin toplu nüfus gDNA hasat edildi ve ardından TOPO bireysel shRNA ekler tanımlamak için klonlanmış. Bu deneme için olası bir iyileşme sağlamak için FACS kullanarak canlı hücreler için seçim olurdusadece canlı hücreler toplanır. Belirlenen hedeflere özel bir tarama testinin hedef shRNAs transdüksiyon tarafından doğrulandığı olacaktır. Gerçek tıklama kuyuların çoğunda fenotipi gösterecektir. LentiPlex Pooled Kütüphane uygulaması esnektir. Downstream uygulamaları geniş bir dizi ile uyumlu ve pozitif veya negatif seçim stratejileri ile birlikte kullanılabilir. ShRNA ekler deconvolution PCR / klonlama, mikroarray, ya da yeni nesil sıralama 9, 10 üzerinden gerçekleştirilir tarama koşullarına bağlı olarak, güç ve hız RNAi ekranlar deconvolute için bu tekniklerin iyi kurulmuş olmasına rağmen, bir mikroarray ile ilgi ve nesil sıralama yöntemleri biyoinformatik kaynaklarını ve bilgi deneysel sonuçlar doğru analiz etmek ve yorumlamak gerekiyordu durumu. Bu teknikleri ile ilişkili maliyetler, çoğu kez genom ekranlar girişim için bir engel olabilir. APCR / klonlama dayalı bir yaklaşım, mikroarray&#39;ler ve yeni nesil sıralama gibi while gibi güçlü değil, etkili ve düşük maliyetli bir alternatif. Agilent LentiPlex ekranlarda daha fazla yardım için TRC shRNA kütüphane dayalı özel bir dizi sunuyor. Bu seçenekler, araştırmacılar çeşitli hücresel fonksiyonların bir çalışma LentiPlex kullanmak için izin verir.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex Pooled Array</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549 Hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = tr &amp; N4 =% T5694 7CSIGMA &amp; N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paklitaksel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA Klonlama Kiti </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">HızlıBaşlangıç ​​Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute Plazmid Miniprep kiti</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine bromür</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

mİsyon lentiplex memeli hücreleri shrna kütüphane tarama pooled

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA enterferans (RNAi), içsel bir hücresel gen ekspresyonunun düzenlenmesi için mekanizmadır. Harnessing bu sistemin doğuştan gelen güç, gen fonksiyon testleri kaybı demonte gen ekspresyon düzeyleri sağlar. RNAi performans için iki ana yöntem vardır. Ilk kimyasal olarak sentezlenmiş küçük müdahale RNA&#39;lar (siRNA) kullanımı, ikincisi ise 1 plazmid içinde kodlanmış kısa saç tokası RNA&#39;lar (shRNAs) kullanır. İkincisi doğrudan hücre içine transfekte veya çoğaltma beceriksiz lentiviral parçacıklar halinde paketlenmiş olabilir. Lentiviral shRNAs kullanmanın ana avantajı hücre tipleri, stabil bir şekilde, uzun vadeli bir gen demonte ve seçim için genom entegre yeteneklerini ve fonksiyon ekranlar yüksek verimlilik kaybı yürütülmesinde etkinliği geniş bir yelpazede içine giriş kolaylığı. Bunu kolaylaştırmak için toplanmış LentiPlex shRNA kütüphane oluşturduk. MISSION LentiPlex İnsan shRNA Pooled Kütüphane özel bir işlem kullanılarak üretilen bir genom lentiviral havuzu. Kütüphane, 75.000 &#39;den fazla 15.000 hedef TRC toplama shRNA yapıları + insan genleri 2 oluşur . Her kitaplık ürün yayınlanmadan önce shRNA temsili için sağlam bir kütüphane kapsama sağlamak için test edilir. Kütüphane p24 tahlil ile en az 5 x 10 8 TU / ml titrelerinde kullanıma hazır lentiviral formatında ve öncesi bölünmüş yaklaşık 8.000 shRNA on alt havuzlar içine her oluşturur. Amplifikasyon ve sıralama primerler aynı zamanda mansap hedef tanımlama için verilmektedir. Önceki çalışmalar A549 hücreleri, bir insan akciğer kanseri hücre hattında 3, 4 paklitaksel ile kombine edildiğinde sinerjik bir antitümör aktivitesi TRAIL kurdu. Bu çalışmada, havuzlu bir LentiPlex shRNA kütüphane uygulaması hızla sitotoksisite o genler için olumlu bir seçim ekranı yapmak göstermekf A549 hücre TRAIL ve Paklitaksel maruz. Bir bariyer yüksek verimli ekranlar sıklıkla karşılaşılan maliyet ve deconvolution güçlük; biz de ayrıntılı bir maliyet-etkin poliklonal bir yaklaşım geleneksel sıralama kullanan.

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA interferansı (RNAi), gen ekspresyonunun regülasyonu için kullanılan hücre içi bir mekanizmadır. Bu sistemin doğal gücünden yararlanmak, bize ... yapma imkanı sağlar.

Aşağıdaki videonun genel amacı, pozitif seçilim taramasını hızla gerçekleştirmek için tüm genom, kısa saç tokası RNA veya S-H-R-N-A kütüphanesinin kullanımını göstermektir. Bu, hedef hücrelerin mission, lenti plex, havuzlanmış tüm genom S-H-R-N-A kütüphanesinin 10 alt havuzu ile transdüksiyonundan sonra terapötik bileşenin eklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, havuzlanmış taramanın ayrıştırılmasını sağlayan HRNA kalıp materyali geri kazanılır.Geri kazanılan S-H-R-N-A daha sonra vektöre klonlanır ve kompetan bakterilere transforme edilir. Ardından, plazmit DNA örnekleri dizilenir ve lenti PLX, HRNA dizi arama veri tabanı kullanılarak S-H-R-N-A hedefleri tanımlanır. Bu videoda gerçekleştirilen deneyin sonuçları, dizileme eşleşmelerinin sayısına dayanarak, antitümörle ilgili farmakolojik ajanlara maruz kaldığında epitelyal bir tümör hücre hattının sitotoksisitesinde rol oynayan genleri ortaya çıkarmaktadır.Lin Duplex havuzlanmış. HRNA kütüphanesi, 10 matris tüpünde RNAI konsorsiyumunu veya TRC koleksiyonunu içerir ve yüksek kapasiteli gen fonksiyon kaybı çalışmalarını hızla gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, hedef hücrelerin transduksiyonundan önce, trail ve paslitaksel maruziyetinde 5 49 hücrelerinin sitotoksisitesinde rol oynayan genler için hızlı bir pozitif seçim taraması yürütmek amacıyla kullanılmıştır.Ertesi gün yaklaşık %70 konfluens elde edecek kadar hücre içeren uygun sayıda 60 milimetrelik kap ekimi yapın. Hücreleri gece boyunca 37 degrees Celsius'da inkübe edin. Büyüme hızları hücre tipine göre değişiklik gösterecektir ve hücrelerin mission lenti plex havuzlanmış S-H-R-N-A kütüphanesi ile transduksiyonuna hazırlanmadan önce belirlemeniz gerekir; lentiviral partikülleri buz üzerinde çözdürün, çözdürülen partikülleri, hemen kullanılmayacaksa buz üzerinde tutarak laminer akışlı kabine aktarın.Tüm hücre kültürü kaplarında bir enfeksiyon çokluğu veya MOI değeri elde etmek için her bir bireysel viral alt havuzdan ne kadar ekleneceğini hesaplayın. Hücre başına birden fazla integrin olasılığını azaltmak için düşük bir MOI kullanılır; virüs hücre kültürü kabına eklendiğinde daha iyi dağılım sağladığından emin olmak için hesaplanan virüs miktarını 100 ile 300 µL tam medyada seyreltin, ardından önceki hücrelerdeki medyayı uzaklaştırın. Her bir kaba, poly brain solüsyonu içeren tam medya ekleyin.Önceden belirlenmiş deneysel tasarıma uygun olarak, uygun kaplara HRNA lentiviral partikülleri ekleyin. Virüsün hücrelere eşit şekilde dağılması için plakaları nazikçe çalkalayın. %5 karbon dioksit atmosferinde, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 degrees Celsius'ta 18 ila 20 saat boyunca inkübe edin.Ertesi gün, virüs içeren medyumu aspire edin ve poly brain içermeyen taze tamamlayıcı medyum ekleyin. Hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Dördüncü günde, hücrelerdeki medyumu aspire edin ve önceden belirlenmiş optimal konsantrasyonda terapötik bileşen içeren taze medyum ekleyin. Ardından hücreleri, bileşenle önceden belirlenmiş bir süre boyunca tedavi edin.Bu çalışmada, hücreler 100 ng/mL trail ve 1 µM paclitaxel ile 48 saat boyunca muamele edilir. Tedavinin ardından, hayatta kalan hücreler T 75 flasklarına yeniden ekilmeli ve poliklonal dekonvolüsyon gerçekleştirmek için yaklaşık %100 konfluens düzeyine ulaşana kadar genişlemelerine izin verilmelidir. Hücrelerin heterojen popülasyonu her bir alt havuzdan hasat edilir ve genomik DNA izole edilir.S-H-R-N-A şablon geri kazanım prosedürüne, yazılı protokolde açıklandığı şekilde PCR reaksiyonunun kurulumu ile başlayın. 20 millimolar konsantrasyonundaki amplifikasyon primerleri lenti plex kiti ile birlikte verilmiştir. Şablon olarak, uygun konsantrasyona seyreltilmiş mission SHRA insan pozitif kontrol vektörünü kullanarak bir pozitif kontrol hazırlayın.Bu şablonla başarılı bir amplifikasyon gerçekleşmesi, PCR testi bileşenlerinin ve döngü koşullarının yeterli olduğunu gösterir. Yazılı protokolde belirtilen PCR programını termosiklet cihazına kaydedin ve hedef amplifikasyonu gerçekleştirin. Döngü tamamlandığında, her bir PCR reaksiyonundan üç mikrolitreyi bir mikrolitre boya ile birleştirin ve 309 baz çiftlik bir amplikonun varlığını doğrulamak için %1'lik agaroz jel üzerinde 100 baz çiftlik düşük ölçekli bir ladder ile birlikte elektroforez yapın.Bu noktada, PCR amplikonları alt klonlanır; üretici protokolünü takip ederek topo ta klonlama kiti kullanılarak PCR ürünleri topo klonlanır. Sonuç olarak, her bir vektörde bir adet PCR ürünü yer alır. Alt klonlama tamamlandıktan sonra, her biri tek bir PCR amplikonu içeren 250 adet bağımsız bakteriyel koloni izole edin.Tekil kolonileri, Gen Elute plazmid mini prep kiti kullanılarak plazmid DNA'sının ekstrakte edilebileceği iki mililitrelik kültürlerde büyütün; saflaştırılmış plazmid DNA'sının echo R one ile sindirilmesinin ardından, insertin varlığı elektroforez ile doğrulanabilir. Son olarak, dizilen plazmid DNA örneklerinden, PLX kütüphanesi ile birlikte sağlanan Plex HRNA dizileme arama veri tabanı kullanılarak S-H-R-N-A inserti tanımlanabilir. Ekli S-H-R-N-A dizileme arama erişim veri tabanı formundaki arama kutusuna HRNA dizisinin başlangıcını giriniz.Sorgu dizisinin sonraki 10 ila 21 nükleotidini girin. Ardından, havuzlanmış S-H-R-N-A türünü seçin. İsteğe bağlı olarak, dizinin bulunduğu alt havuzu seçin.Şimdi, aramayı gerçekleştirmek için potansiyel hitleri bul düğmesine tıklayın. Bu işlem, sekanslama verileriyle eşleşen ilgili T-R-C-S-H-R-N-A dizilerini tanımlamalıdır. Tanımlanan TR CS HRA dizileri ve bunlara karşılık gelen gen hedefleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için favori gen web siteniz olan Sigma Aldrich kullanılabilir. Hedeflenen genler, orijinal TRC klonu ve aynı geni hedefleyen en az iki ek RNA kullanılarak, bir HRNA'ya bir 60 mm'lik petri kabı formatında orijinal tarama testi tekrarlanarak doğrulanmalıdır.Gerçek hitler, plakların çoğunda aynı fenotipi sergileyecektir. Tek bir bireysel PCR fragmanı içeren klonlama vektörüne sahip klonlar, SHRA şablon geri kazanım prosedürü kullanılarak izole edilmiş ve HRNA inserti lenti plex SHRA sekans arama veri tabanı kullanılarak tanımlanmıştır. 250 klon sekanslanmıştır.Bunlardan 25 tanesi birden fazla klonla temsil edildi ve geri kalan 225 tanesi yalnızca tek bir klonla temsil edildiği için takip edilmedi. Burada gösterildiği üzere, TBX 3, PPP 2, ca ve AKT 2 dahil olmak üzere birkaç aday gen birden fazla klonla temsil edildi. T kutusu transkripsiyon faktörü TBX 3 toplam dört klonda görüldü ve tümör migrasyonunda rol oynadığı belirtilmiştir.PPP2CA downregülasyonunun, androjen eksikliği ile indüklenen hücre döngüsü duraksamasını gidererek ve apoptozu önleyerek, androjen yetersizliği koşullarında kültüre edilen LnCap hücrelerinin büyümesini sürdürdüğü gösterilmiştir. Ayrıca, AKT2, kanser gelişiminde çeşitli roller oynadığı kanıtlanmış bir Arak Beta Syrian üç Anine protein kinaz ve olası bir onkoyendir. Bu videoyu izledikten sonra, yöntemini nasıl kullanacağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Yüksek kapasiteli gen fonksiyon kaybı çalışmalarını hızla yürütmek için Len Plex havuzlanmış SH RNA kütüphanesi.

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

Genetiği değiştirilmiş fare modellerinde ortaya çıkan tümörlerde terapötik hedefleri ve karşılık gelen insan tümör tipini belirlemek ve karşılaştırmak için genomik analizler ve fonksiyonel genomik ekranlar kullanan türler arası karşılaştırmalı bir onkogenomik yaklaşım geliştirdik.

Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümörünün Fare Modellerinde Terapötik Hedefleri Belirlemek için Genetik Profilleme ve Genom Ölçeğinde Bırakma Taraması

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Öğrenin, LentiPlex shRNA kütüphanesiyle memeli hücrelerinde pozitif seçim taraması yaparak hücre sağkalımını artıran gen hedeflerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, yüksek verimli fonksiyonel genomik araştırmalar için güçlü bir protokol sunar.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

Daha fazla video keşfet