Elektrik Bakliyat Uygulama sırasında Yön ve Elektrik Alan yönelimi değiştirme Plazmid Gen Transferi artırır In vitro
12 Eylül 2011
Darbe uygulama sırasında elektrik alanın yönü değiştiğinde elektroporasyon Gen transfeksiyon yaklaşık iki kat artar, hücre canlılığı etkilenen değildir. Gen transfeksiyon artış hücre içine DNA giriş için yetkili yapılır membran alanı artışı neden olur.
Gen elektrot transferi, kısa ve yoğun elektrik darbeleri uygulanarak genlerin hücrelere iletilmesi için kullanılan fiziksel bir yöntemdir. Başarılı bir gen elektrot transferinde birkaç adım yer alır: DNA ile hücre membranı arasında bir kompleksin oluşumu, DNA'nın geçirgenleşmiş membran boyunca translokasyonu, DNA'nın sitoplazmadan çekirdeğe transferi ve gen elektrot transferi için gen ekspresyonu. Maksimum gen transfeksiyonu sağlamak amacıyla farklı elektrik darbe protokolleri kullanılır.
Bunlardan biri, puls iletimi sırasında elektrik alan yönünün değiştirilmesidir. Bu videoda, tüm pulsların aynı yönde iletildiği durum ile pulsların yön değiştirilerek iletildiği durum arasındaki gen elektrot transfer verimliliği farkını gösteriyoruz. Elektrik alan yönü değiştirilerek gerçekleştirilen deneyler, deney için Çin hamster yumurtalık hücreleri, CHOK one üzerinde yapılmıştır.
Şu adımları izleyin: hücreleri inkübatördeki bir kültür balonunda 24 saat boyunca büyütün. Deney günü, %0,25 trips içeren EDTA çözeltisiyle tripsin kullanarak hücre süspansiyonunu hazırlayın ve hücreleri sayın; hücreleri 4 °C'de, dakikada 1000 rotasyon hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre peletlerini, mililitre başına 5 milyon hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde ISO OSM Miller sodyum fosfat tamponuna yeniden süspanse edin. Ardından örneği uygun kaba aktarın; hücreler, yüksek voltajlı bir prototip jeneratöre bağlı entegre elektrotları olan pipet ucunda elektrik alanına maruz bırakılır.
Bu elektrotlar, farklı yönlerde nispeten homojen bir elektrik alanının uygulanmasına olanak tanır. Uç ve jeneratör, Luana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi Biyosibernetik laboratuvarında geliştirilmiştir. Hücre süspansiyonuna, mililitre başına 10 µg konsantrasyonda E-G-F-P-N plazmidi ekleyin.
Elektrik darbeleri uygulamadan önce hücreleri plazmit DNA ile iyice karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. 100 µL hücre süspansiyonunu entegre elektrotlu pipet ucuna çekin. Bu deneyde, yüksek voltajlı prototip jeneratör kullanılarak sekiz adet dikdörtgen darbeden oluşan bir dizi uygulanır; ilk protokolde farklı elektrik alanı protokolleri kullanılır.
Tüm darbeler aynı yönde verilirken, ikinci protokolde darbeler elektrik alanı yönü değiştirilerek verilir. İkinci protokol, yalnızca farklı yönlerde elektrik darbelerinin uygulanmasına izin veren uygun bir darbe jeneratörü ile kullanılabilir. Darbe uygulamasının hemen ardından hücreleri pipet ucundan altı kuyucuklu plakalara aktarın ve fetal sığır serumu ekleyin.
Örnek hacminin %25'i oranında hücreleri 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin. Hücre membranının yeniden kapanmasını sağlamak için altı kuyucuklu plakadaki her örneğe 2 mL HAMF 12 ekleyin ve hücreleri inkübatörde, nemlendirilmiş %5 CO2 atmosferinde, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Gen elektrotransferi verimliliği, pulse uygulamasından 24 saat sonra GFP eksprese eden hücrelerin yüzdesi olarak belirlenir.
Hücreler, görüntüleme yazılımı kullanılarak floresan mikroskobu altında gözlemlenir. Eksitasyon dalga boyu 488 nanometreye ayarlanır ve GFP eksprese eden hücreleri tespit etmek için yeşil floresan görüntüye uygun bir bant geçiren filtre seçilir. 20x büyütmede, faz kontrast ve yeşil floresan olmak üzere en az beş görüntü alınır.
Objektif büyütmesiyle faz kontrast görüntüsündeki hücreleri ve yeşil floresan görüntüsünde GFP eksprese eden hücreleri sayın; her bir karşılık gelen görüntüdeki toplam hücre sayısına, GFP eksprese eden hücre sayısını bölerek gen elektrot transfer verimlilik yüzdesini belirleyin. Tüm darbelerin aynı yönde verildiği durum ile elektrik alan yönü değiştirilerek darbelerin verildiği durumdaki GFP eksprese eden hücre yüzdesi, elektrik alan yönünün değiştirilmesiyle sunulmuştur. GFP eksprese eden hücrelerin yüzdesi anlamlı şekilde artmaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, elektroporasyon yoluyla gen transfeksiyonunu inceleyerek elektrik alan yöneliminin transfeksiyon verimliliği üzerindeki etkisini vurgulamaktadır. Bulgular, puls uygulaması sırasında elektrik alanı yönünün değiştirilmesinin, hücre canlılığını bozmadan gen transfeksiyon oranlarını iki katına çıkarabileceğini göstermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen tedavisi
- Hücre biyolojisi
- Elektroporasyon teknikleri
Arka Plan
- Gen elektrot transferi, genlerin hücrelere iletilmesi için kullanılan bir yöntemdir.
- DNA girişini kolaylaştırmak için kısa ve şiddetli elektrik darbeleri uygulanmasını içerir.
- Başarılı bir transfeksiyon için DNA'nın hücre zarını geçmesi ve çekirdeğe girmesi gerekir.
- Farklı elektrik darbesi protokolleri, transfeksiyon verimliliğini artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Elektrik alan yöneliminin gen transfeksiyon verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Yönelimin değiştirilmesinin hücre canlılığını etkileyip etkilemediğini belirlemek.
- Süreci Çin hamster yumurtalığı (CHO) hücreleri kullanarak göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- CHO hücrelerine elektrik darbelerinin uygulanması.
- Farklı elektrik alanı yönlerine göre transfeksiyon verimliliğinin karşılaştırılması.
- Transfeksiyon sonrası hücre canlılığının değerlendirilmesi.
- DNA'nın hücrelere girişinin ve ardından gelen gen ekspresyonunun analizi.
Ana Sonuçlar
- Değiştirilen elektrik alanı yönü ile gen transfeksiyon verimliliği yaklaşık iki kat artırılmıştır.
- Hücre canlılığı üzerinde anlamlı bir etki gözlemlenmemiştir.
- Artan membran alanı, gelişmiş DNA girişine katkıda bulunmuştur.
- Farklı elektrik darbe protokollerinin etkinliği kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Darbe uygulaması sırasında elektrik alanının yönünün değiştirilmesi, gen transfeksiyonunu önemli ölçüde artırır.
- Bu yöntem, hücre sağlığından ödün vermeden optimize edilebilir.
- Gelecekteki araştırmalar, geliştirilmiş gen iletimi için ek protokolleri inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Elektroporasyon sırasında elektrik alan yönünün optimize edilmesi, plazmit gen transfer verimliliğini artırarak hedef doğrulama ve öncü bileşik belirleme iş akışlarının erken aşamalarında transfeksiyon verimlerini iyileştirmek için viral olmayan bir strateji sunar. Bu yaklaşım, hücre canlılığını tehlikeye atmadan genişletilmiş membran yetkinliği yoluyla DNA girişini artırarak mekanistik risk azaltmayı destekler ve böylece preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır. Yöntem, biyofarma Ar-Ge'sindeki assay geliştirme ve fenotipik tarama uygulamaları için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir gen iletimi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: DNA girişi için uygun olan membran alanını artırarak transfeksiyon verimliliğini iyileştirir ve rekombinant protein ekspresyon çalışmalarında fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Hücre popülasyonları genelinde tutarlı plazmid iletimi sağlayarak, erken aşama hipotez testlerinde ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerindeki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek içerikli tarama platformları ile uyumlu, gen transfer verimliliğine dair floresan tabanlı kantitatif okumalar sağlar.
- Operasyonel Değer: Entegre elektrot uçları ve programlanabilir darbe generatörleri kullanarak elektroporasyon parametrelerini standartlaştırır ve laboratuvarlar arası analiz tekrarlanabilirliğini artırır.
- Stratejik Değer: Transfekte edilmiş hücre hatlarının, sonraki hedef etkileşimi ve biyobelirteç analizleri için ölçeklenebilir şekilde hazırlanmasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Transfeksiyondan sonra hücre canlılığını koruyarak, hastalıkla ilgili sistemlerde gen ekspresyonunun ve fenotipik etkilerin boylamsal çalışmalarına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Biyolojik ürün üretimi ve yolak analizleri için yaygın olarak kullanılan bir konakçı olan CHO hücreleri kullanılarak stabil veya geçici olarak transfekte edilmiş preklinik modellerin oluşturulmasını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef fonksiyonunun değerlendirilmesi ve hücresel modellerdeki yolakların modüle edilmesi için verimli gen iletiminin gerektiği, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliği kapsamına girmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Memeli hücrelerde ilgili genlerin güvenilir şekilde aşırı eksprese edilmesini veya nakavt edilmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Genetik konstrüktların veya düzenleyici elementlerin karşılaştırılmasına olanak tanıyan standardize, kantitatif transfeksiyon çıktıları sunar.
- Analitik: Puls protokolleri arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan yüzde tabanlı verimlilik metrikleri (GFP+ hücreler/toplam hücreler) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: 3D modellerde veya ko-kültür sistemlerinde ileri doğrulama için uygun, canlı transfekte hücreler üreterek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Adherent veya süspansiyon hücre hatlarına plazmit iletimi gerektiren birden fazla projede uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir elektroporasyon kapasitesi sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Puls parametrelerinin biyofiziksel optimizasyonu yoluyla transfeksiyon verimliliğini artırarak, gen aktarımı sonuçlarındaki öngörü güvenilirliğini geliştirir.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış puls dizileri ve alan yönelimi kontrolü aracılığıyla, gen transfer prosedürlerinin tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu iyileştirir.
- Stratejik Değer: Fenotipik değerlendirme için yeterli transgen ekspresyonunu sağlayarak ve yanlış negatifleri minimize ederek, hedef doğrulamadaki biyolojik riski azaltır.
- Portföy Etkisi: Hücresel analizlerde ulaşılabilir ekspresyon seviyelerine dayalı olarak, genetik hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Transfeksiyon verimliliğinin değerlendirilmesi için memeli hücre kültürü, plazmid hazırlama ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Programlanabilir elektrik alanı yönü değişiklikleri yapabilen yüksek voltajlı darbe jeneratörlerine ve uyumlu elektrot entegreli uçlara erişime bağlıdır.
- Karşılaştırılabilirliği sağlamak için deneyler boyunca darbe parametrelerinin (voltaj, süre, sayı) ve hücre yoğunluğunun standardize edilmesini gerektirir.
- Transfeksiyon verimliliği ile hücresel stres arasındaki dengeyi kurmak için DNA-hücre oranının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonunu içerir.
- Elektroporasyonla uyumlu olan adherent veya süspansiyon hücre hatlarıyla sınırlıdır; primer veya hassas hücreler alternatif iletim yöntemleri gerektirebilir.
