Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kolorektal kanser dokusundaki yüzey antijenlerinin moleküler profilini çıkarmak için DOT tarama antikor mikro-dizisi kullanmaktır. Ayrıca, karışık popülasyon içindeki belirli profillere sahip hücre tiplerini ayırt etmek için floresan multipleksleme yöntemi uygulanmaktadır. Diferansiyasyon kümeleri veya CD antijenleri, kolorektal kanserde potansiyel prognostik veya metastatik biyobelirteçler olarak tanımlanmıştır.

Bu antijenler, ekspresyonları genellikle tümör progresyonuyla veya diğer hücre tipleriyle etkileşimle değiştiği için ideal biyobelirteçler oluşturur. Bu videoda, eksprese edilen yüzey antijenleri aracılığıyla canlı hücreleri yakalamak için DOT scan antikor mikro dizisini kullanıyoruz. DOT scan antikor mikro dizisi, nitrocelluloz tabakasına sahip bir lamdan oluşur.

DOT tarama antikor mikro-dizi paneli, CD 29 ve CD 44'ten oluşan hizalama noktalarıyla çevrelenmiştir. Dizinin her iki yanına aynı zamanda kopya diziler noktalanmıştır. İlk panel, DOT tarama lösemi mikro-dizisinin orijinal 82 antikorundan oluşur ve kolorektal kanser uydu mikro-dizisi olarak prognostik potansiyele dayalı olarak ek 40 antikor seçilmiştir.

Son panel ise izotip kontrol antikorlarından oluşmaktadır. Burada, kolorektal kanser dokusu ve normal intestinal mukoza, canlı tek hücreli süspansiyon elde etmek için sindirilir ve filtrelenir. Süspansiyon, daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir veya saklanabilir.

Hücre süspansiyonu, bir DOT tarama antikor mikro-dizisi üzerinde hücre yakalama işlemi için kullanılır; farklı hücre alt tiplerinde eksprese edilen antijenler floresan multipleksleme ile profillenir. Elde edilen ekspresyon profilleri, kolorektal kanser hücreleri ile normal intestinal mukoza arasında antijen ekspresyonunda anlamlı bir değişiklik olduğunu göstermektedir. Bu fark, tümörle ilişkili lökosit popülasyonuna da yansımaktadır.

Çeşitli tümör profillerinin hiyerarşik kümelenmesi, hastalık imzalarının kolorektal kanser evreleri ile kümelendiğini göstermektedir. Merhaba, ben Avustralya'daki Sidney Üniversitesi Moleküler Biyobilim Okulu'ndan Jerry; bugün size kolorektal kanser dokusundaki yüzey antijenlerinin profillenmesine yönelik bir deney göstereceğim. Dot scan antikor mikroarray ve floresan multipleksleme kullanan Dot scan mikroarray'ler, canlı kanser hücreleri ve ilişkili inflamatuar lökositler üzerindeki yaklaşık 140 yüzey antijeninin profillenmesini sağlar.

Mikrodizilerde yakalanan hücre alt kümeleri, ilgilenilen hücreler üzerinde yüksek düzeyde eksprese edilen bir marker antijene bağlanan floresan işaretli antikorlar kullanılarak ayırt edilebilir. Üç farklı spesifiteye sahip antikorlar üzerinde uygun floresan etiketler kullanılarak, tek bir mikrodizide üç farklı hücre alt kümesine kadar profil çıkarma işlemi gerçekleştirilebilir. DOT tarama mikrodizi testi nispeten basit bir yöntemdir ve halihazırda birçok kanser türünün hücre yüzey profillemesi için kullanılmıştır.

DOT taramanın temel özelliği, canlı hücreleri yüzey antijenleri aracılığıyla yakalayabilme yeteneğidir; dolayısıyla elde ettiğimiz bağlanma paterni, hücrenin yüzey profilinin bir yansımasıdır. Yüzey antijenleri, tümör gelişimi ve metastazda ve kanserle mücadele eden inflamatuar yanıtta önemli bir rol oynar. Kapsamlı yüzey profilleri veya immünofenotipler, kanser sınıflandırmasını geliştirmek için hastalık imzaları olarak kullanılabilir ve ameliyat sonrası optimal tedaviyi mümkün kılar.

Tamam, başlayalım. Burada gösterilen deneyde, A'dan D'ye kadar derecelendirilmiş klinik kolorektal kanser tümör örnekleri Hank'in tamponuna toplanır. Başlamak için, iki skalpel kullanarak tümörü dikkatlice bir milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin.

Kesitleri, sindirim için %2 kollagenaz tip dört ve %10 DNA çözeltisine yerleştirin. Aynı hastanın normal bağırsak mukozasından alınan kesitler, primer tümör bölgesinden 10 santimetre uzaklıktan toplanır. Bu örnek kontrol grubu olarak işlev görür ve tümör örneği ile aynı şekilde işlenir.

Bağ dokusunun parçalanmasını sağlamak için tümör sindirimi 37 °C'de bir saat boyunca gerçekleştirilir; DNase, hasarlı hücrelerden kaynaklanan DNA'ları temizler. İnkübasyonu takiben, doku süspansiyonu tel örgü filtreden geçirilir; bu sırada örnek üzerine Hanks tamponu dökülürken, hücrelerin filtreden geçmesine yardımcı olmak için 10 mL'lik bir şırınga pistonu kullanılır. Bu işlem, hücrelerin çoğu tel örgüden geçene kadar birkaç kez tekrarlanır.

Elek, hücreleri sindirilmemiş bağ dokularından ayırır. Ardından, hücre süspansiyonunu 10 M şırınga ile çekip önce 200 µm'lik bir fcon filtreden, ardından 50 µm'lik bir fil con filtreden geçirerek daha ileri düzeyde süzün. Bu daha ince filtreler, fazla mukusun veya DNA'nın uzaklaştırılmasını sağlamalı ve canlı tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre kümelerini dağıtmalıdır.

Aynı işlem normal mukoza için de uygulanır. Normal mukozanın daha fazla bağ dokusu içerme eğiliminde olduğunu ve sonuç olarak, 20 °C'de beş dakika boyunca 410 G'de mesh santrifüj hücre süspansiyonuna geçmesi için biraz daha fazla yıkama gerektiğini tespit ettik. Soğuk saklama hazırlığı için, hücre peletini 750 µL fetal calf serum ile süspanse ettik ve ardından DMS içeren fetal calf serum ile eş hacimlerde seyreltme yaptık.

Çözeltiyi bu DMS'ye ekleyin. Sabit karıştırma altında çözeltiyi damla damla ekleyin, süpernatandan bir miktar alarak kriyotüpe aktarın ve yalıtkan bir kaba yerleştirin. Bu örnekler -80 °C'de bir yıla kadar saklanabilir.

İzolasyon ve DMSO, hücrelerin parçalanmadan yavaşça çözünmesini sağlamalıdır. Saklamanın bir yan etkisi, kırmızı kan hücresi popülasyonunun lizisidir. Şanslıyız ki, bunlara ihtiyaç yoktur.

Deney için; örnekleri saklama alanından çıkarın ve hızla aktarın. 37 °C'lik bir su banyosunda, hücre süspansiyonunu 10 mL Hank's tamponu içinde yeniden süspanse edin; tampon çözelti, %10 DMSO ve fetal calf serumu seyreltmeye yardımcı olmalıdır; ardından hücreleri 20 °C'de 410 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı dökün ve 500 µL Hank's tamponunda yeniden süspande edin; dondurma ve çözme işlemi sırasında bazı hücreler parçalanabilir ve bu durum süspansiyona DNA salınımına neden olabilir. Bu sorunu gidermek için örneği oda sıcaklığında %0,1 DNAs ile inkübe edin. Bu süre zarfında bir hücre canlılık sayımı gerçekleştirilebilir.

Eşit miktardaki triam blue'u 10 µL hücre süspansiyonu ile karıştırın ve bu karışımdan 10 µL'yi bir hücre sayaca pipetleyin. Mikroskop altında sağlıklı ve canlı hücreler şeffaf görünür. Öte yandan, membranları bozulmuş canlı olmayan hücreler mavi görünecektir.

DOT scan antikoru ile hücre yakalama işlemi için minimum 4 milyon canlı hücre gereklidir. MICRORAY çöktürülür. DNA işlemi sonrası hücreler, 10 ml Hank's tamponu ile ikinci kez yıkanır ve 20 °C'de, 410 G'de beş dakika boyunca santrifüj edilir.

Son hücre paletini 200 µL RPMI besiyeri ile süspanse ediyoruz. Bu besiyeri, Hanks tamponuna göre nispeten daha fazla besin içerir ve hücre canlılığını korurken antikor mikro-diziliminde hücre yakalamayı kolaylaştırmak için kullanılır. Kolorektal kanser nokta tarama antikor mikro-dizilimi, nitroselüloz üzerinde çoğaltılmış 140 farklı antikor noktasından oluşur.

Dizideki her bir nokta, hücre yüzeyi antijenine karşı 10 nanolitre monoklonal antikor içerir. Antikor mikro-dizisini hazırlamak için, nitrocellulozu nemlendirmek amacıyla diziyi bir PBS tepsisine batırın ve dizinin cam kenarını Kim wipes ile silin. Nitrocelluloz bölüme dokunmamaya dikkat ederek mikro-diziyi bir tepsiye yerleştirin ve hücre süspansiyonunu nitrocelluloz üzerine pipetleyin.

Hücre süspansiyonunun eşit şekilde yayılması, tüm antikorların hücreleri yakalama potansiyeline sahip olmasını sağlayacaktır. Mikro-diziyi 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, farklı hücreler aşağı doğru süzülerek dizideki hücreler üzerindeki antikorlarla temas edecektir.

Antikoruna karşılık gelen yüzey antijenlerini sunan hücreler, inkübasyonun ardından bağlanacak ve yakalanacaktır. Bağlanmayan hücreleri, dizileri üç kez taze PPS içine nazikçe daldırarak yıkayın. Sıçrayan hücreleri %10'luk dış yükseklik ve PPS çözeltisi içinde sabitleyin.

Nitro selüloz yükleme bölgesini kaplayacak miktarda fiksatifi nazikçe pipetle ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, mikro dizileri taze PBS içine üç kez daldırın.

Fazla yüksekliğin floresan multiplekslemeyi etkileyebileceği nedeniyle, her yıkamada dizileri 30 saniye boyunca PBS içinde bekletin. Çok daha hassas bir analiz için bir mikro-diziyi ışık altında tutarak hücre bağlanmasının gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol edebiliriz. DOT tarayıcı ve analiz yazılımı, bağlanma örüntüsünü taramamıza ve karışık bir hücre popülasyonundaki antijen ekspresyonunun nicel sonuçlarını üretmemize olanak tanır.

Yazılım, hücre bağlanma yoğunluğunu sekiz bitlik bir gri tonlama ölçeğinde arka plan gürültüsüne karşı karşılaştırır. Yoğunluk birimleri maksimum 256 değerine normalize edilmiştir. Bir dizi arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için, herhangi bir pozitif izotip kontrol bağlanması, karşılık gelen IG izotiplerine sahip antikorlardan çıkarılır.

Mikrodiziye 200 µL bloklama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Floresan multipleksleme hazırlığı için, 118 µL bloklama tamponuna 10 µL konjuge CD3 ve 20 µL Alexa konjuge epam ekleyin. Ayrıca, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için karışıma 2 µL ısı ile inaktive edilmiş serum ekleyin.

Bloklama işlemi tamamlandığında, bloklama tamponu multipleksleme çözeltisi ile değiştirilir ve 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilir. İnkübasyon sırasında oda sıcaklığında, CD3 konjuge antikorlar dizideki CD3 eksprese eden T hücrelerine bağlanırken, EPAM konjuge antikor dizideki epitel hücrelerine veya kolorektal kanser hücrelerine bağlanacaktır. Ardından, mikro diziyi taze PBS ile üç kez yıkayın ve floresan tarama işleminden önce karanlıkta kurumalarını bekleyin.

Floresans, bir Typhoon FLA 9.000 tarayıcı ile tespit edilir. FICO profilinin taraması 523 nanometre lazer ve 580 BP 30 emisyon filtresi kullanılarak gerçekleştirilir; Alexa 647'nin taraması ise 633 nanometre lazer ve 670 BP 30 emisyon filtresi kullanılarak yapılır. Elde edilen floresan görüntüler, analiz için tif formatına dönüştürülür.

Bir DOT tarama yazılımı kullanılarak. Floresan multipleksleme, aynı doku örneği içindeki farklı hücre popülasyonlarının antijen profillerini ayırt etmemize olanak tanır. Burada gösterilen görüntüler bir kolorektal kanser örneğine aittir.

Bu üç görüntü; bir optik taramanın, CD3 eksprese eden hücreler için floresan taramanın ve EPAM eksprese eden hücreler için floresan taramanın görüntüleridir. DOT tarama mikro-diziliminden elde edilen sonuçlar, iki kopya lam arasında tutarlı hücre bağlanma modelleri göstermelidir. Lamın kenarı boyunca yoğun dizilim noktası bağlanması, yeterli miktarda hücrenin yakalandığını gösterir.

Hücre bağlanmasına yönelik kantitatif değerler elde etmek için bir PDF raporu oluşturulabilir. Hücre bağlanmasını gösteren sütun grafiği, normal mukoza ile tümör örneği arasındaki antijen ekspresyonu farkını ortaya koymaktadır.

Optik sonuçlar örnekteki tüm hücre tipleri üzerindeki antijen ekspresyonunun genel bir temsilini verirken, AAM multipleks sonuçları normal epitelyal hücreler ile kanser hücreleri arasındaki antijen ekspresyon farkına dair daha net bir tablo sunmaktadır. Diferansiyel eksprese olan antijenlerin çoğu grup olarak bilinen kolorektal kanser biyobelirteçleri olsa da, stratifikasyon için tek bir biyobelirtecin ulaşabileceğinden çok daha doğru bir hastalık imzası sağlarlar. CD3 multipleks sonuçları, normal örneğe kıyasla kanser örneğinde daha fazla T hücresi olduğunu göstermektedir.

Kanser T hücreleri genellikle aktivasyon belirteçleri eksprese ederler; bu durum, söz konusu T hücrelerinin tümöre sızan lenfositler veya inflamasyonla ilişkili T hücreleri olma olasılığını doğurur. Büyük ölçekli analizler, açık kaynaklı bir ısı haritası ve veri analiz yazılımı olan multi experiment viewer versiyon 4.4 ile gerçekleştirilebilir. Kolorektal kanser örneklerinin hiyerarşik kümelemesi, hastalık evresi veya hasta prognozu ile ilişkilendirmek için kullanılabilir.

Kapsamlı bir hastalık imzası kütüphanesi, kolorektal kanser hastalarında prognoz öngörüsünde veya ameliyat sonrası tedavi sürecinin belirlenmesinde değerli bir araçtır; DOT scan antikor mikro dizisi ve floresan çoklu analizini kullanarak, kolorektal kanser dokusundaki karışık bir hücre popülasyonunda yüzey antijen ekspresyonunun profillenmesi için gereken prosedürü göstermiş olduk. Bu deneyde unutulmaması gereken önemli bir husus, her zaman taze doku kullanılması gerektiği ve deneyin başarılı olması için en az 4 milyon canlı hücrenin gerekli olduğudur. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.