Name: Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, raporlayıcı gen etiketli mikobakteriler kullanarak tam kan içinde metabolik aktiviteyi ölçme yöntemini. Bu teknik, tüberküloz araştırmalarında konak-patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273) için kişisel burslar tarafından finanse edildi.

1. BCG lüks muhabiri mikobakteriler stok hazırlanması <ol><li> BCG büyümeye lux Middlebrook 7H9 broth içeren% 0.2 gliserol,% 0.05 arasında 80 ve% 10 ADC zenginleştirme orta-logaritmik faz 200rpm az sallayarak (servis plazmid pSMT1 ile dönüştürülmüş M. bovis BCG Montreal suşu). </li><li> Luminometre çift tüp (900μl PBS + 100μl BCG lüks kültür) 1ml steril PBS BCG lüks kültür 1:10 seyreltme hazırlayın. </li><li> N-desil aldehit (luciferin enzim substratı) içeren tüp makine sırtına yük ve kapağı sabitleniyor ve tüpler sağlamak. </li><li> Luminometreye yerleştirilen 3 boş emişli tüplerin her birine 100 ucl x 3 enjekte etmek için ana program üzerinden substrat ile Başbakan luminometre enjektör. </li><li> Luminometre 2 tüpler içine yükleyin ve her tüp içine substrat 100 ucl enjekte bir program aracılığıyla okuma ve 1 sn aralıklarla 20 saniye boyunca okuyun. </li><li> Stok 1x10 8 RLU / ml 2x10 8 RLU / ml (Bu büyüme 3-4 gün sürer) ulaştığında, 50ml şahin tüp kültür eşit hacimde steril% 30 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> -80 Etiketli 2 ml vidalı kapaklı mikrotüp ve mağaza ° C içine kısım 1.5ml hacimleri </li></ol> 2. Belirlenmesi stok RLU / CFU korelasyon ve alikotları içeriği <ol><li> Havalandırmalı bir kap ile 200ml Erlenmeyer şişesinde% 10 ADC ek Middlebrook 7H9 kültür ortamı 15ml ekleyin. </li><li> % 20 Tween hygromycin ve 30μl 15μl ekleyin. </li><li> Güvenlik kabini, oda sıcaklığında (RT) dondurucu ve defrost BCG lüks bir şişe çıkarın . Orta flakon içeriğini ekleyin ve kapağını sıkın. </li><li> 37 200rpm az sallayarak ° C'de 4 gün inkübe edin. </li><li> Her gün makyaj CFU belirlenmesi için seri 10-kat dilüsyonları (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 ve 1:100,000). </li><li> Paralel olarak aynı dilüsyonları kurmak ve lüminesans belirlemek için (1.2-1.6) çoğaltmak. </li><li> Middlebrook 7H11 agar (% 0.5 gliserol,% 10 OADC ek,% 20 Tween ve hygromycin, 1 ml 1 ml içeren sıvı bir ortamda 1 litre) 3 bölmesi iki tabak hazırlayın. </li><li> Sıvı bireysel kamara arasında eşit şekilde dağıtarak, ayrı serpme kullanarak her plaka bir segment üzerine her seyreltme 100μl, dışarı Plaka. </li><li> Parafilm her tabak, steril bir plastik torba yerine, otoklav bandı ile mühür Seal, ve 37 inkübe ° C, 2 hafta boyunca aşağı bakacak şekilde kapaklı. </li><li> CFU (2-3 hafta) görünene kadar düzenli olarak kontrol edin. </li><li> Koloniler saymak için, kuvöz ve bir koloni sayacı yer plakaları çıkarın. Yinelenen plakalardan her seyreltme için ortalama hesaplayın. </li><li> Her seyreltme için eşdeğer RLU ve CFU sayıları kullanarak RLU / CFU oranını hesaplayın. Bu oran, 3 ve 5 RLU / CFU arasında olmalıdır. </li></ol> 3. Tam kan inokülasyon için BCG lüks kültür hazırlanması <ol><li> Havalandırmalı bir kap ile 200ml Erlenmeyer şişesinde% 10 ADC ek Middlebrook 7H9 kültür ortamı 15ml ekleyin. </li><li> % 20 Tween hygromycin ve 30μl 15μl ekleyin. </li><li> Güvenlik kabini RT dondurucu ve defrost BCG lüks bir şişe çıkarın. Orta flakon içeriğini ekleyin ve kapağını sıkın. </li><li> 37 200rpm az sallayarak ° C 2 ila 4 gün inkübe edin. </li><li> Luminometre çift tüp (900μl PBS + 100μl BCG lüks kültür) 1ml steril PBS BCG lüks kültür 1:10 seyreltme hazırlayın. </li><li> Başbakan luminometre substrat ile (yukarıda açıklandığı gibi), 2 tüpler yavaşça girdap ve luminometre yüklemek ve okuma (yukarıda açıklandığı gibi) almak. </li><li> 7x10 6 RLU eşdeğer (monosit sayısı varsayarak, 2x10 yaklaşık 5 CFU / ml kan ve BCG oranı 1:1 monositler için bir inokulum verecek vermek için PBS içinde kültür sulandırmak için bu okuma kullanın. kan ml başına 4x10 için yaklaşık 5 2x10, 5 monositler) . </li></ol> 4. Tam kan hazırlanması <ol><li> 3 alın, koruyucu içermeyen heparin içeren bir tüp 5ml venöz kan. </li><li> 50ml şahin tüp kan transferi ve eşit miktarda glutamin ve 25mm Hepes (Herhangi bir kalem / strep) içeren RPMI 1640 ile seyreltilir . </li><li> 0hrs için 3 ve 96hrs için 3, gerekirse ek timepoints için ek tüp ayarlayın: Her zaman noktası için steril küçük ama tüpleri (toplam 6 tüpler içine üç nüsha olarak seyreltilmiş kan kısım 900μl </li><li> % 10 ADC takviyesi + 50μg/ml hygromycin (BCG lüks kültürü eskiden olduğu gibi aynı ortamda) Middlebrooks 7H9 kültür orta kısım 900μl büyümesini kontrol çoğaltın. </li><li> Her bir tüp kan seyreltilmiş BCG lux, 100μl ekleyin ve 2 büyüme kontrolütüpler. </li><li> İyice karıştırın ve 37 sallanan inkübatör kendi tarafında zaman 96hr noktası ve 2 büyümesini kontrol için 3 bijous ° C, 20 dev / dak (CO 2 gerekli değildir). </li></ol> 5. Ölçüm lüminesans (0hr ve 96hrs) <ol><li> 10 dakika 2000g 3 bijous santrifüjleyin. </li><li> , -80 Dondurmak için 2 ml vidalı kapaklı mikrotüpler pelet ve yeri rahatsız etmeden dikkatlice süpernatant 300μl kaldırmak ° C, daha sonraki sitokin analiz için. </li><li> Kaldırılır süpernatant hacmi yerine her küçük ama PBS 300μl ekleyin. </li><li> Her küçük ama içeriğini ilgili 50ml şahin tüp içine aspire edin ve her tüp 8 ml distile su ekleyin. 10 dakika için bir zamanlayıcı başlayın. Nb: Bu zamana duyarlı bir adım olduğunu ve bu kuluçka hücreleri ilk kez su ile temas ettiğinde itibaren, herhangi bir 10 dakika daha uzun olmamalıdır. </li><li> 2ml için distile su ve 5 saniye vorteks ile ilgili şahin tüpe devrilme önce her küçük ama durulayın. </li><li> 10 dakikalık inkübasyon sonunda, 10 dakika için 2000g şahin tüpler santrifüj. </li><li> Surfanios dezenfektan içine Durusu süpernatant. </li><li> Her pelet ve vorteks birkaç cam boncuk ekleyin. </li><li> 1ml steril PBS her tüp ve vorteks ekleyin. </li><li> Luminometre tüplerde, PBS (900μl PBS + 100μl örnek) ile yinelenen ve 96hr zaman noktası, her bir örnek için 01:10 dilüsyonları olun. Büyüme kontrollerin her biri için aynı dilüsyonları olun. </li><li> Yavaşça vorteks tüpleri ve luminometre yüklemek ve okuma (yukarıda açıklandığı gibi) almak Nb: aynı örnek triplicates arasında Okumalar, biri diğerinin% 15 içinde olmalıdır . </li></ol> 6. Temsilcisi sonuçları: Metabolik aktivite suboptimal olduğu gibi, yani önce örnekleri aşılamak için 48-72 saat içinde büyüdü, tam kan lüks deneyleri için büyüme logaritmik faz, bakteri kullanılması önemlidir dondurucu düz dışarı ya durumunda veya sabit faz . Önce büyüme değişkenliği önlemek için bir dizi deneyler ya da 48 veya 72 saat için standardize edilmelidir. Şekil 1 BCG lüks bir temsilcisi kültürünün büyüme eğrisi gösterir. Sabit faz ulaşana kadar iki katına çıkma süresi 24 saat. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: BCG Temsilcisi büyüme eğrisi lüks 7H9 orta ve RLU ve CFU korelasyon 96 saat içinde. RLU değerleri her zaman CFU ile korele olsa da, tutarlı bir enfeksiyon çokluğu garanti etmek için bir dizi deney boyunca aynı donmuş stoğu kullanmak için iyi bir neden (tek bir CFU ilgili RLU sayısı, stok bağlı olarak değişebilir. İçişleri Bakanlığı). Tablo 1, aşılama zamanı (T 0) ve 96 saat ham tarihten bir örnek gösterir . Büyüme oranları, formül T 96 / T 0 kullanılarak hesaplanır, ama başka zaman aralıkları içerisinde de ölçülebilir . Önemli hücre ölümü gerçekleşir gibi olur, ancak tavsiye, 96 saat ötesinde kültürlerin kullanmak için değil. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1, aşılama (T0) süresi ve 96 saate kadar (T96) ve 3 erişkin vericilerden hesaplanan büyüme oranları ham veri örneği . Mevcut antijen spesifik bellek yanıtları ve muhtemelen de nötrofil sayısı bağlı olarak, büyüme oranları, çocukların kan Şekil 2 ve HIV enfeksiyonu olmadan burada görüldüğü gibi, bireyler arasında değişir. Ortalama olarak, genç çocuklar yetişkinlere göre daha yüksek büyüme oranlarına sahip, Tüberkülin deri testi (TDT) + ve bireylerin TST-ve bireylerin daha düşük büyüme oranları ve HIV enfeksiyonlu hastalarda, CD4 T hücre popülasyonunun eksikliği nedeniyle yüksek büyüme oranlarına sahip mikobakteriler için hücresel immün yanıtları anahtar arabulucular biri. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Inter-donör değişkenliği: altta yatan HIV durumuna bağlı olarak, hastaların bir dizi T 0'a karşı 96 saat Büyüme oranları. Şekil 3, 12 aylık bir süre içinde ve kontrol deneyleri için tekrar tekrar kanadı tek bir donör iki kanadı 64 donörlerin sonuçları özetleyen bir süre içinde büyüme oranlarının Tekrarlanabilirlik gösterilmiştir. Değişkenlik potansiyel nedenleri gibi birçok biyoanalizlere gözlenen ana sitokinlerin düzeyleri içinde mikobakteriyel hassasiyete ya da değişkenlik değişiklikler olabilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. 12 ay içinde 12 kez (a) Tek donör 12 metreye kadar 2 kez (b) birden fazla (64) donörlerinonths.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri, hayvan modellerinde de kurulmuştur. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. M. enfekte insan bakterisidal testlerinin ilk nesil, tek başına makrofajlar kullanılarak dizayn edilmiştir tüberküloz. CFU, en az 3 haftalık bir süre sonra ana mikobakteriyel hayatta kalma okuma olarak görev yaptı. Bu testl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Kedi yok </td></tr><tr><td> BCG aşısı lüks </td><td> Çeşitli </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H9 broth </td><td> BD Biosciences </td><td> 271.310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC zenginleştirme </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC takviyesi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-desil aldehit </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanol (% 99,7) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> Steril PBS </td><td> House </td><td> n / a </td></tr><tr><td> L-Glutamin, 25mm Hepes RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> Steril distile Su </td><td> House </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Ekipman </td></tr><tr><td> Tüp luminometre (enjektabl port zorunlu) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 veya tek tüp luminometre Sirius </td><td></td></tr><tr><td> Luminometre tüpler, 12 x 75mm, pyrex çerçevesiz </td><td> VWR gelen Corning </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Bacalı kapakları Erlenmeyer şişeler, steril polikarbonat 250ml </td><td> Corning üzerinden Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Kan Alma Tüpleri (koruyucu madde içermeyen heparin) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ml Falcon tüpleri, konik </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml STERILIN örnek polipropilen küçük ama borular </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> STERILIN Evrensel konteynerler (30 ml) </td><td> Laboratuar Analiz LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Cam boncuklar 2mm çaplı </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ml pipet ve pipet çocuk </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl ve 200μl pipetler ve filtre ipuçları </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Genel laboratuvar ekipmanları: </td></tr><tr><td> Sınıf II güvenlik kabini kabin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buzdolabı (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tüpler karıştırmak için Rocking çalkalayıcı platformu (180 0) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı inkübatör bakteri kültürleri büyüyen 37 ° C&#39;de </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikobakteriler canlılık tedbir fonksiyonel tam kan testi, reporter gen bcg veya m. tb (bcg takip edilen konu kullanarak lüks / m. tb lüks)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Fonksiyonel testlerin uzun süre belirli bir aşı immünojenite ölçme önemli bir rol oynamıştır. Bu, geleneksel serum bakterisidal titreleri olarak ifade edilir. Çocukluk aşıları yanıt serum bakterisidal titreleri çalışmaları rutin olarak kullanılması, koruyucu bağışıklık yanıtlarını ve bu cut-off için seviyelerini geliştirmek ve cut-off doğrulamak sağlamıştır. Testler TB aşıları gibi efektör T hücre yanıtları şeklinde öncelikle hücre-aracılı bağışıklık neden olan aşıların rutin değerlendirme içine ileri atılmıştır. Hayvan modeli, belirli bir aşı adayı performans rutin standart bakterisidal tayinlerde değerlendirilir ve mevcut tüm roman TB aşı adayı 1 insan çalışmalarda faz önce bu adımı değerlendirilmesi maruz kalmış. Immünojenite ve bu nedenle yeni anti-TB aşıların koruyucu etkinlik olasılığını değerlendirme ideal bakterisidal testleri ölçümleri de dahil olmak üzere, insan modelleri benzer bir adım akıllıca değerlendirme geçmelidir. Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri zaten iyi, hayvan modellerinde yılında kurulmuş olan. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. Ancak, bugüne kadar yeni anti-TB aşıları için böyle testleri klinik çalışmalarda içine dahil edilmiştir. Mikobakterilerin insan makrofaj içinde öldürülmesi neden tam mekanizmaları hakkında belirsizlik hala var olmasına rağmen, mikobakteriler ile makrofaj ve T hücrelerinin etkileşimi açıkça gereklidir. Bu yazıda anlatılan testi onların göreceli bireysel katkı hakkında varsayımlar yapmadan tam kan mevcut diğer tüm hücresel ve humoral faktörler gibi temel hücresel bileşenleri çalışmaları sağlar bakterisidal testlerinin bir roman neslini temsil ediyor. Grubumuz tarafından açıklanan tam kan tahlil küçük hacimlerde kullanır ve zaten TB-endemik ayarları yetişkinler ve çocuklar çalışmalarda istihdam edilmiştir. Biz, BCG aşısı immünojenite gösterilen mikobakterilerin büyüme, HIV-pozitif hastalarda mikobakteriyel sağkalım üzerine in vitro anti-retroviral tedavi ve D vitamini etkisinin yanı sıra artmıştır. Burada metodoloji özetlemekte ve bu nispeten basit, düşük maliyetli ve sahada dostu bir model kullanarak tekrarlanabilirlik veri mevcut. Not: Tanımlar / Kısaltmalar BCG lux = M. bovis BCG, Montreal gerilme, mikobakteriyel GroEL (hsp60) promotör kontrolü altında, Vibrio harveyi luxAB genleri taşıyan servis plazmid pSMT1 dönüştürdü. CFU = Koloni Oluşturan Birim (mikobakteriyel canlılığının bir önlem).

Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım tarif<em&gt; In vitro</em, Muhabir-gen kullanan&gt; yerine koloni oluşturan birim (CFU) mikobakteriler etiketli. Organizmalar &quot;Survival&quot; gibi bir konak cevabı belirteçler tüberküloz bağlamda ev sahibi / patojen etkileşimleri çalışmaları için düşük maliyetli, çok yönlü ve fonksiyonel bir sistem, aynı anda ölçülür.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Fonksiyonel analizler, belirli bir aşının immünojenitesinin ölçülmesinde uzun süredir kilit bir rol oynamaktadır. Bu durum geleneksel olarak serum bakterisid etkisine göre ifade edilir...

Bu in vitro analiz, mikobakteriler ile konakçı bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin etkisini değerlendirmek amacıyla tam kandaki mikobakteriyel metabolik aktiviteyi ölçer. İlk olarak, bir zaman seyri boyunca gerçek zamanlı okuma sağlamak için raporlayıcı gen etiketli mikobakterileri insan tam kanına ekleyin. Sitokin ölçümleri için örnek süpernatanlarını ve RNA analizleri için hücre paletlerini toplayın; eritrositleri lizlemeden sonra seri dilüsyonlar ve biyolüminesans kullanarak mikobakterilerin metabolik aktivitesini ölçün.Son olarak, final biyolüminesans sinyalinin göreceli ışık birimleri ile inokülasyon anındaki biyolüminesans sinyali arasındaki oran hesaplanır. Sonuçlar, konakçının mikobakterileri kontrol altında tutma yeteneğini göstermektedir. Bu tam kan gen analiz yöntemi, alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Örneğin, bir kan örneğinde belirli efektör bağışıklık hücrelerinin bulunması, bu vakadaki organizmalar üzerinde fonksiyonel bir etkiye sahip midir? Mikobakteriler. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikobakteri sayımının üç haftalık inkübasyonun ardından koloni oluşturan birimleri saymak yerine gerçek zamanlı olarak elde ed

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, biyolüminesans testi ve koloni oluşturan birimlerin sayımı kullanılarak Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux inokulumunun hazırlanmasını ve miktar tayinini göstermektedir. Hazırlanan aşı enfeksiyon çalışmaları için kullanılabilir.

Enfeksiyon için Mycobacterium bovis BCG lux İnokulumunun Hazırlanması ve Miktar Tayini

Bu video, Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux ile enfekte böcek larvaları kullanılarak yapılan in vivo bakteri yükü ölçümünü göstermektedir. İşlem, larva homojenizasyonunu, bir lusiferaz substratı ile muameleyi ve bakteri yükü ile ilişkili nispi ışık birimlerini belirlemek için biyolüminesans ölçümünü içerir.

Bir Böcek Larvasında Lusiferaz İfade Eden Bakterilerin İn Vivo Yükünün Ölçümü

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.

Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade

Galleria mellonella son zamanlarda Mycobacterium tüberküloz kompleksi için reproducible, ucuz ve etik olarak kabul edilebilir bir enfeksiyon modeli olarak kurulmuştur. Burada, Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella 'nın başarılı enfeksiyonunu kurmak için alınan adımları tarif ediyoruz ve gösteriyoruz .

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Balgamın ısı inaktivasyonundan sonra yapılan tüberküloz moleküler bakteriyel yük testini tanımladık. Isı inaktivasyonu balgam örneklerini enfeksiyöz olmayan hale getirir ve tüberküloz moleküler testleri için 3 laboratuvarları kapsama ihtiyacını ortadan kılmaktadır.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Bu çalışma, bakteri canlılığını hızlı bir şekilde değerlendirmek için floresan ve lüminesans kullanarak, yakın zamanda oluşturulmuş bir çift raportör suşu ile Mycobacterium abscessus'a karşı yüksek verimli tarama için bir test geliştirdi. Bu protokol, bu ilaca dirençli bakterilere karşı yeni ilaçları taramayı amaçlayan araştırmacılar için geçerli olacaktır.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Öğrenin, raporlayıcı gen etiketli mikobakteriler kullanarak tam kan içinde metabolik aktiviteyi ölçme yöntemini. Bu teknik, tüberküloz araştırmalarında konak-patojen etkileşimlerini gerçek zamanlı değerlendirir.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks) (Video) | JoVE Journal

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Daha fazla video keşfet