Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler
31 Ekim 2011
Bu makale, fareler koku ampulün yüzeyi harita koku uyarılmış faaliyetleri içsel optik sinyalleri ve flavoproteins otofloresans sinyallerini görüntüleme protokolleri sunar.
Bu deneyin genel amacı, fareyi uyuşturduktan ve kafatasını açığa çıkardıktan sonra içsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresan sinyalleri veya FAS görüntüleme kullanarak farelerin koku alma ampulünün yüzeyindeki koku uyandıran aktiviteleri haritalamaktır. Koku soğancığının üzerindeki kemik incelir. Bir neşter bıçağının ucu kullanılarak bir kemik flebi çizilir ve daha sonra çıkarılır: diş çimentosundan yapılmış bir oda, koku soğancığının açıkta kalan yüzeyini çevreler.
Aros ile doldurulur ve bu preparatın üzerine bir kapak camı yerleştirilir. Koku alma haritaları, içsel optik sinyaller ve FAS görüntüleme kullanılarak aynı farede sırayla elde edilir, Optik yansıma ve otofloresan sinyalleri kullanarak fare koku soğancığındaki diğer uyarılmış aktiviteleri görüntülemek, koku soğancığındaki siparişlerin özel kaplamasıyla ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin iki doksi glukoz görüntüleme veya FMRI gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, sipariş evok aktivitelerini tek bir cazibe listesinin özel bir çözünürlüğünde kaydetmeyi mümkün kılmaktır.
Genel olarak, bu yöntemlere yeni başlayan bireyler, hem cerrahi hem de enstrümantal becerilerin kazanılması yavaş olduğu için işlerinin başında zorluklar yaşayacaklardır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi, cerrahi ve görüntüleme prosedürlerinin önemli adımlarına dikkat çekmek için kritik öneme sahiptir. Anesteziyi onaylamak için farenin arka pençesini sıkıştırın ve saç kesme makinesi kullanarak saç derisinden tüyleri çıkarın.
Damıtılmış suya batırılmış steril gazlı bezlerle ciltte kalan tüyleri silin. Fareyi, burnu başın arkası ile aynı düzlemde olacak şekilde stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Koku ampulünü yatay olarak konumlandırmak için, hareketi önlemek için kulak ve burun çubuklarını sıkıca sabitleyin.
Görüntüleme sırasında kurumayı önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün ve ardından steril makas kullanarak kafa derisi bölgesini Betadine ile dezenfekte edin. Başın arkasında kulaklar arasında bir kesi yapın, ardından her iki taraftan kulağın tabanına doğru ve ön arka yönde göz kapakları boyunca alnına doğru kesin. Burun üzerindeki cildi keserek kafa derisini çıkarmayı bitirin.
Burun çubuğunu kılavuz olarak kullanmak. Hayvanı stereo mikroskop altına yerleştirin ve kafatasının üst kısmındaki periosteuumu nazikçe ayırmak için tuzlu suyla ıslatılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Kalan dokuyu çıkarmak için bir çift forseps kullanın ve koku alma ampulü alanını deney boyunca nemli tutmak için temiz bir hazırlık sağlamak için kafatasının yüzeyini bir neşterle kazıyın.
Gözler arasında bulunan koku soğancığının üzerindeki kemiğin üzerine damıtılmış su ile ıslatılmış bir parça emilebilir jelatin, sünger yerleştirin. Jelatin süngeri çıkarın ve 10 numara neşter bıçağıyla kemiği nazikçe kazıyarak başlayın. Bıçak ile kemik arasında 45 derecelik sabit bir açı tutun ve bıçağı göz kapaklarından ampul alanının sagital tarafına doğru hareket ettirin.
İnceltme işlemi sırasında kemiğe dikey baskı uygulamamaya veya venöz sinüsün üzerindeki kemiği çizmemeye dikkat edin. Her beş dakikada bir durun ve hazırlığı soğutmak için kemiğin üzerine hidratlı bir jelatin sünger yerleştirin. Kemiği, tozu çıkarmak için kafatasını süngerle temizleyin ve neşterin ucunu temiz tutmak ve keskin tutmak için periyodik olarak silin.
Süngerimsi kemik tabakası veya trabekül görünene kadar devam edin. Koku soğancığının ince damar sistemi göründüğünde, kemiği kaşımayı bırakın ve dikdörtgen bir alan çizmek ve koku soğancığını kapatmak için 11 numaralı neşterin ucunu kullanın. Pencereyi venöz sinüslerin sınırları içinde tutarak dikdörtgen alan içindeki kemiği çizmeye devam edin.
Dura yüzeyine dokunmaktan kaçınmak için neşter ucunun derinliğine ekstra dikkat edin. Kalan kemiğin kalınlığını anlamak için, bir forseps parasının ucuyla hafifçe itin. Kemik basınç altında katlanırsa, bir sonraki adıma geçin.
Bir damla salin ekleyin ve kemik kapağını kaldırmak için neşterin ucunu yatay olarak kullanın. Kalan kemiğin yırtılmasını önlemek için forseps kullanarak kanadı dikkatlice çıkarın. Koku soğanı yüzeyi açığa çıktığında, herhangi bir kanama veya kan damarı olup olmadığını kontrol edin. Anastomoz.
Alanı tuzlu suya batırılmış bir jelatin süngerle silin. Koku soğancığını nemli tutmak için, kafatası penceresinin etrafındaki kemik üzerinde bir kuyu oluşturmak için 29 gauge bir şırınga kullanarak poli akrilat diş çimentosu uygulayın. Duranın üzerine bir damla düşük erime noktalı aros damlatın ve görüntüleme için kraniyal pencerenin üzerine steril kapak camı yerleştirin.
Kılcal damarları görünür hale getirmek için stereotaksik çerçeveyi, kraniyal pencere görüş alanı odağında ortalanacak şekilde stereo mikroskobun altına yerleştirin. 580 nanometre yeşil ışığa geçin ve görüntüleme sırasında preparatın durumunu kontrol etmek için bir anatomik kontrol görüntüsü yakalayın. Ardından, 630 nanometre aydınlatma altında içsel optik sinyal görüntüleme veya 480 nanometre aydınlatma altında flavoprotein otofloresan sinyal görüntüleme kullanarak stimülasyon denemelerini yakalamaya devam edin, Standart bir görüntüleme oturumu, yalnızca havanın verildiği beş ila 10 saniyelik bir taban çizgisi içerir, ardından seçilen koku konsantrasyonuna bağlı olarak üç ila 10 saniye boyunca koku stimülasyonu.
Ve son olarak, temel kurtarma için 70 ila 82 saniyelik hava dağıtımı kaydedilir. Burada, koku soğancığının damar sistemi kraniyal pencereden görüntülenir, ardından hem iOS hem de FAS görüntüleme kullanılarak yakalanan koku maddesi olarak h sinal kullanılarak yapılan bir stimülasyon denemesinin sonuçları gelir. iOS görüntüleme kullanılarak, koku uyarılmış aktivite, AL tarafından aktive edilen emilim alanlarının karanlık alanları olarak gösterilir ve aktif alanlar hem tekli hem de ortalama çoklu denemelerde görülebilir.
Aynı fare OD uyarılmış aktivitesinde FAS görüntülemeye geçmek, artık siyah oklarla gösterilen otofloresan emisyonunun beyaz alanları olarak gösterilmektedir ve ayrıca hem tek hem de ortalama çoklu çalışmalarda görülebilir. Hem iOS görüntüleme kullanılarak görülen siyah absorpsiyon bölgelerinin hem de FAS görüntüleme kullanılarak görülen beyaz otofloresan emisyon alanlarının örtüştüğüne dikkat edin. Bu uzamsal eşleşme, iki tekniğin aynı koku alma glomerüllerinin görselleştirilmesine izin verdiğini doğrular: Bir kez ana görüntüleme sırası, optik yansıma ve otofloresan sinyalleri kullanılarak uyarılmış aktiviteler, ameliyat için bir saat içinde ve görüntü elde etmek için birkaç saat içinde yapılabilir.
Bu optik görüntüleme yöntemlerini kullanmanın temel dezavantajları, koku alma haritalarını bir şekilde serbest hareket eden fareler olarak görselleştirmek için uygulanamamalarıdır. Ve fotonların biyolojik dokulara sınırlı nüfuz etmesi nedeniyle, doksanlı yılların sonlarında gelişmesinden sonra ventral koku alma glomerüllerine erişim sağlamazlar ve koku alma sistemindeki içsel sinyalleri kaydederler. Belki de optik görüntüleme alanındaki araştırmacılar için özel od kaplamasının özelliklerini keşfetmenin bir yolu.
Koku soğancığında flavoprotein otofloresan görüntüleme, endojen optik sinyaller kullanılarak OD'nin özel kaplamasında yeni bilgiler vermek için umut verici bir tekniktir.
Genel Bakış
Bu makale, farelerin koku maddesi tarafından uyandırılan aktiviteleri koku soğanı yüzeyinde haritalandırmak için içsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresan sinyallerini görüntüleme protokollerini sunmaktadır. Açıklanan yöntemler, koku soğanı aktivitesinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesine olanak tanır ve koku alma sinir mekanizmaları hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Koku işleme
- Görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Koku işlemeyi anlamak, duyusal algı hakkında bilgiler için çok önemlidir.
- İçsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresans gibi görüntüleme teknikleri beyin aktivitesini incelemek için değerlidir.
- Koku maddesi tarafından uyandırılan aktiviteleri haritalandırmak duyusal tepkilerin mekansal organizasyonunu ortaya çıkarabilir.
- Mevcut yöntemler, ayrıntılı analiz için gereken çözünürlükten yoksun olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Koku maddesi tarafından uyandırılan aktiviteleri koku soğanında haritalandırmak için bir protokol geliştirmek.
- İçsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresansı yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanmak.
- Bu görüntüleme tekniklerinin geleneksel yöntemlere göre avantajlarını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Fareler anestezi altına alınır ve koku soğanı görüntüleme için maruz bırakılır.
- Koku soğanının üzerindeki kemik, görüntüleme için inceltilir.
- Sıralı görüntüleme, hem içsel optik sinyaller hem de flavoprotein otofloresansı kullanarak koku stimülasyonuna verilen tepkileri yakalır.
- Görüntüleme seansları, uyandırılan aktiviteleri değerlendirmek için temel ve koku stimülasyon aşamalarını içerir.
Ana Sonuçlar
- Koku maddesi tarafından uyandırılan aktiviteler, absorbans ve otofloresans alanları olarak görselleştirilir.
- Sonuçlar, farklı kokulara tepki olarak farklı aktivasyon desenlerini göstermektedir.
- Her iki görüntüleme tekniği de koku soğanı aktivitesi hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlar.
- Yüksek mekansal çözünürlük, duyusal tepkilerin ayrıntılı haritalandırılmasını sağlar.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş protokoller, koku soğanı aktivitesinin etkili bir şekilde haritalandırılmasını sağlar.
- İçsel optik sinyaller ve flavoprotein otofloresansı sinirbilim araştırmaları için güçlü araçlardır.
- Bu yöntemler, beyindeki duyusal işlemeyi anlamamızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Mapping odor-evoked neural activity in the olfactory bulb supports target validation in neuroscience drug discovery by enabling visualization of functional neural circuits involved in sensory processing. This approach provides mechanistic de-risking for compounds targeting olfactory pathways or related neurological disorders by linking molecular interventions to measurable changes in neural activation patterns. The technique enhances predictive confidence in early discovery by offering a disease-relevant system to assess target engagement and circuit-level effects prior to phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing odor-evoked activation patterns in glomeruli as functional modules of sensory processing.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of neural circuit engagement in response to sensory stimuli.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking target modulation to measurable changes in spatial activation maps.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline and evoked activity profiles in the olfactory bulb.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sequential imaging of intrinsic optical signals and flavoprotein autofluorescence under controlled stimulation.
- Scalability: Highlights platform reuse across stimulation trials and odorants to enable reliable compound evaluation in sensory neuroscience.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to neurological disorders.
- Mechanistic De-risking: Describes continuity from discovery through preclinical validation by mapping neural responses that reflect target-mediated changes in brain activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by providing quantitative spatial readouts that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation by providing neural activity readouts that inform target confidence and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by visualizing odor-evoked activation in glomeruli.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through sequential baseline and stimulation imaging using 630 nm and 480 nm illumination.
- Analytics: Highlights measurements such as absorbance changes (intrinsic optical signals) and autofluorescence emission (flavoprotein signals) that enable comparison of neural activation across conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking olfactory bulb activation patterns to sensory processing pathways relevant to therapeutic targeting.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal studies and cross-compound comparison in the same preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in sensory processing pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of neural activity mapping across trials and subjects.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuroscience programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on neural activation thresholds and spatial patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroscience, surgical preparation, and optical imaging techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including stereotaxic frame, stereo microscope, light sources at 580 nm, 630 nm, and 480 nm, and image acquisition systems.
- Cross-team standardization requirements for surgical preparation, anesthesia depth, and imaging parameters across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, noting current application in mouse olfactory bulb with potential for extension to other sensory regions.
- Practical limitations supported by source material: inability to visualize olfactory maps in freely moving mice and limited photon penetration restricting access to ventral olfactory glomeruli.
