Name: TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, TGF-β kaynaklı invazyonu 3 boyutlu kollajen jellerde MCF10A hücre hatları kullanarak nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, meme kanseri ilerlemesindeki işgal mekanizmalarını incelemek için diğer hücre hatlarına da uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz hücre hatları için reaktifler ve Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanser Intitute, Detroit, ABD) Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, ABD) teşekkür ediyoruz.

1. Methocel çözüm Hazırlama (500 mL) <ol><li> Bir manyetik karıştırıcı içeren 500 ml şişe metilselüloz Otoklav 6 gr. </li><li> 20 dakika, önceden ısıtılmış DMEM/F12 250 ml serum (60 ° C) olmadan metilselüloz çözülür. </li><li> DMEM/F12 (RT),% 10 at serumu içeren 250 ml ekleyin. Mix gecede (4 ° C). </li><li> Santrifüj (5000g, 2h, 4 ° C) çözüm temizleyin. </li><li> Yeni bir tüp (stok solüsyonu yaklaşık% 90-95) açık oldukça viskoz bir çözüm atın. </li><li> Mağaza, 4 ° C kullanana kadar. </li></ol> 2. Sfero kültür <ol><li> % 20 methocel solüsyonu (10 ml methocel ve 40 ml besi) hazırlayın. </li><li> Hücreler PBS ile iki kez yıkayın, 37 yaşında% 0.1 tripsin ve inkübe hücreleri eklemek ° C </li><li> Hücrelerin büyüme ortamında süspanse edin ve hücre sayımı. </li><li> % 20, 10 000 ml başına hücrelerinin süspansiyon hazırlamak methocel. </li><li> 96 iyi yuvarlak alt hücre süspansiyonuuspension levhalar (ortalama 100 ul). </li><li> Ertesi gün, süspansiyon plakalar sfero oluşumunu kontrol edin. Tanecikler ise 1-3 gün sonra kullanıma hazır olacaktır. </li></ol> 3. Kollajen hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde 8 ml kollajen, 1 ml PBS 10x, 1 ml 0.1 N NaOH ve 3 damla 0,1 N HCl çözeltisi hazırlayın. PH indikatörü şeritler çözümün bazı tespit ederek pH 7.4 olup olmadığını kontrol edin. PH aralığı olmadığını ayarlayın. </li><li> 96 plaka kuyularda nötralize kollajen çözüm 50 ul ekle </li><li> 37 inkübe ° C kollajen (90 dk) katılaşan kadar. </li><li> Buz üzerinde methocel-kollajen-ligand çözümleri hazırlayın: kollajen çözüm her ligand pipet 1 parçası. Kollajen TGF-β 20 ng ml başına ekleyin. Farklı katmanlar üzerinde methocel ve difüzyon ile seyreltme sonra, TGF-β nihai konsantrasyonu 5 ng / ml Mix tarafından vorteks olacaktır. 1 methocel çözümün parçası ekleyin. Vorteks ile karıştırın. </li></ol> 4. Sfero embedding <ol><li> 200 ul pipet ucu kesilmiş yaklaşık 5 mm, 200 ul ucu yerleştirin. Pipet ile bir sfero emmek ve orta boş bir tabak içine dikkatlice dağıtmak. Sfero ucu içinde kalırsa izleyin. Sfero, beyaz bir nokta olarak görülebilir. Piston bırakmadan, 100 ul kollajen methocel karışımı emmek ve kollajen kaplı iyi 96 kollajen karışımı sfero dağıtmak. 12 parçacıklarının her bir durum için bunu yapın. </li><li> Let en az 30 dakika katılaşmasını kollajen 37 ° C </li><li> 200 ul ucu ile hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> % 1.6 serum ve DMSO içinde çözülmüş inhibitörleri ile 50 ul orta ekleyin. SB-431.542 için 4 ul stok solüsyonu (10 mM) orta 1 ml ekleyin. Difüzyon sonra inhibitörü son konsantrasyonu 10 mcM olacaktır. TGF-β ve inhibitörleri, deney boyunca kalacaktır. 40X büyütme ile mikroskop altında parçacıklarının fotoğraflar çekin. </li><li> 4 sonraTGF-β ve / veya inhibitörleri ile stimülasyon 8h, 40X büyütme ile mikroskop altında parçacıklarının fotoğraf çekmek. </li><li> 2 gün sonra işgalci parçacıklarının alanı ölçün ve başlangıç ​​alanına çıkarmak. Ölçüm alanında bir sfero: Adobe Photoshop Extended (Şekil 2A) sfero resim ve Hızlı Seçim aracı (Şekil 2B) seçeneğini açın. Bir "artı" (+) işareti (şekil 2C) ile bir daire içine fare işaretçisi değişir. Sfero üzerine imleci sürüklerken, Photoshop, sfero sınırları tanıyacak. Sfero dışında bir alan seçili ise araç çubuğu (-) işareti, bu bölgede Alt tuşuna basarak veya tarafından belirtilen olumsuz bir seçim aracını kullanarak seçim dışında olabilir. (-) 'Eksi' ile bir daire içine imleç işareti ve yanlış seçilmiş bir alan üzerinde imleci sürükleyerek, bu alanda seçim (Şekil 2D) kaldırılır. Eğer gerekirse, birden fazla bölgede, Sh basarak seçilebilirift düğmesi. Daha doğru bir şekilde çalışmak için, fare işaretçisi boyutu araç çubuğunda fırça çapı (Şekil 2E) değiştirerek ayarlanabilir. Tüm sfero seçildiğinde, seçimin alan menü çubuğunda ANALİZ-TEDBİR aracılığıyla veya Ctrl + Shift + M (Şekil 2F) tuşuna basarak hesaplanır. Dosya adı ve piksel cinsinden seçim alanı yanı sıra diğer verileri (Şekil 2G) gösteren ölçüm kayıt penceresi görünecektir. Eğer birden çok seçim ölçülür, ilk satırı tüm alanları toplamını gösterir. Aşağıdaki satırlarda, bireysel seçimleri ölçümleri sunulmaktadır. Tüm ölçümlerin verileri bir metin dosyasına ihraç ve Excel'de açılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: MCF10A1 (M1) normal meme epitel hücreleri ile sfero testinin bir örneği, H-RAS MCF10AneoT (M2) hücrelerin dönüştürdü ve M2-kökenli MCF10CA1a (M4) Şekil 3'te verilmiştir. M1 hücreleri olmadan sadece zayıf işgali gösterdistimülasyon, ancak önemli ölçüde işgal TGF-β tarafından uyarılması üzerine daha iyi. Buna karşılık, türev M1-M2 uyaranlara ek olmadan verimli bir şekilde zaten işgal RAS-dönüştürülmüş ve bu konuda daha fazla TGF-β tedavisi üzerine 4-5 kat arttı. M4 hücreleri hem de TGF-β ek olmadan, güçlü işgali gösterdi. Sonra, biz kimyasal inhibitörleri kullanarak bu sfero model TGF-β-kaynaklı işgali etkileyebilecek olmadığını inceledi. Bu amaçla biz SB-431.542, bir ATP analog ve TβRI kinaz aktivitesini seçici inhibitörü gibi aktivin tip IB reseptör (ActRIB) ve aktivin kinaz-benzeri reseptör (ALK) 7 12 kullanılır. Beklendiği gibi, SB-431.542 kuvvetli M1 TGF-β indüklenen işgali, TGF-β indüklenen bu işgali belirten M2 ve M4 hücreleri (Şekil 4), inhibe TβRI-kinaz bağımlı. Buna ek olarak, bazal parçacıklarının işgali de güçlü bir şekilde inhibe, bu bazal işgali düşündüren de aynı zamandaTGF-β sarkık. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: 3D sfero testinin akış çizelgesi. İlk olarak, hücreler, U-şekilli süspansiyonlar plakalar yapışmaz koşullar altında kaplanmıştır. Hücreler multcellular parçacıklarının aggregrate ve kollajen matriks içine gömülü olabilir. Bu kollajen matriks içine, onlar işgal mümkün. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Genişletilmiş Adobe Photoshop kullanarak parçacıklarının alan Kantitasyonu. (A) sfero resmi kullanarak wongly yer alan sfero (D) Kaldırma alanı seçmek için sfero üzerine imleci sürükleme Hızlı Seçim aracı Adobe Photoshop Extendend (B) Seçim (C) açıldı daha doğru bir alanı seçmek için Hızlı Seçim aracı fırça boyutunu olumsuz Hızlı Seçim aracı (E) Ayarı (F) Seçimiölçüm komutu bir ölçüm kayıt örneği kaydetmek için (G). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A1 (M1) (A) parçacıklarının TGF-β indüklenen işgali, MCF10AneoT (M2 (B) ve metastatik türevi MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 ve M4 parçacıklarının gömülü RAS dönüştürülmüş belirtildiği gibi 48 saat için kollajen içine TGF-β 5ng/ml ile tedavi edildi. AC Temsilcisi resim gömme gün alınmış ve iki gün sonra D Bağıl işgali gün 2 gün 0 eksi alan farkı gibi sayısal sonuçlar ifade edilmiştir. olarak ortalama ± SD 13 'den uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4a"> <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/3337/3337fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4b"> Şekil 4. Bazal ve TGF-β-kaynaklı sfero işgali b inhibe ediliry SB-431.542. M1, M2 ve M4 parçacıklarının kollajen içine gömülü ve 5ng/ml TGF-β ve / veya 10 belirtildiği gibi mcM SB-431.542 ile tedavi edildi. Temsilcisi resimler 2 gün sonra alınan (A). Bağıl işgali gün 2 gün 0 (B) eksi alan farkı olarak belirlendi. Sonuçlar, ortalama ± SD 13 den uyarlanmıştır olarak ifade edilir .

<ol><li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li>
<li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+TGF-%CE%B21+and+TGF-%CE%B2+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li>
<li>Sheen-Chen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+transforming+growth+factor-%CE%B21+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Surg%22%5BJournal%5D)">Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer.</a> Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).</li>
<li>ten Dijke, P., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+TGF-%CE%B2-Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into TGF-β-Smad signaling.</a> Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).</li>
<li>Moustakas, A., Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Smad+TGF-%CE%B2+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-Smad TGF-β signals.</a> J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).</li>
<li>Soule, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+spontaneously+immortalized+human+breast+epithelial+cell+line%2C+MCF-10%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10.</a> Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).</li>
<li>Strickland, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+premalignant+MCF10AT+generates+heterogeneous+malignant+variants+with+characteristic+histologic+types+and+immunohistochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers.</a> Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).</li>
<li>Santner, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+multicellular-mediated+resistance+to+alkylating+agents+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).</li>
<li>Inman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-b+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).</li>
<li>Wiercinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF-%CE%B2%2FSmad+pathway+induces+breast+cancer+cell+invasion+through+the+up-regulation+of+matrix+metalloproteinase+2+and+9+in+a+spheroid+invasion+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system.</a> Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).</li>
<li>Tang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC. Med. 6, 11-11 (2008).</li>
<li>Ramaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).</li>
<li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).</li>
<li>Lee, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).</li>
<li>Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> 30, 256-256 (2011).</li>
<li>Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21-Activated+kinase+1+coordinates+aberrant+cell+survival+and+pericellular+proteolysis+in+a+three-dimensional+culture+model+for+premalignant+progression+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer.</a> 10, 314-314 (2011).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması.

Biz MCF10A1 hücreleri ve malign türevleri TGF-β bağımlı bir şekilde bir kollajen matriks içine işgal sfero bir model oluşturdu. Birincisi, parçacıklarının metilselüloz varlığı 96-kuyular yuvarlak alt süspansiyon plakaları oluşur. Tabii ki, aynı zamanda U-şekilli poli-HEMA kaplı plakaları bu amaç için kullanılabilir. Hücreler metilselüloz yokluğunda ölecek beri Metilselüloz kesinlikle, bu adım gereklidir. Hücreler bu faktör kolajen orta op üst eklendiğinde TGF-β daha iyi cevap verdiğini bulundu beri TGF-β kollajen methoc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Metil selüloz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Gelişmiş BioMatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> pH indikatörü şeritleri </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96-iyi süspansiyon plakalar </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 650 (185) </td><td></td></tr><tr><td> TC yapışma 96-well plakalar </td><td> Greiner Bio-one </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

tgf-β-kaynaklı invasion tedbir sfero testi

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-β başlangıç ​​aşamasında bir tümör baskılayıcı gibi davranan, ancak daha sonraki bir aşamada 1,2 invazyon ve metastaz uyarıcı, meme kanseri ilerlemesinde rol karşı vardır . Ayrıca, TGF-β meme kanseri sık sık aşırı eksprese ve kendi ifadesini, kötü prognoz ve metastaz 3,4 ile ilişkilidir. TGF-β indükler işgali iyi anlaşılmış değildir hangi mekanizmaları. TGF-β, TGF-β Tip II (TβRII) ve tip I (TβRI) reseptörleri aracılığıyla hücresel yanıtlar ortaya çıkarır. TGF-β indüklenen heteromeric kompleks oluşum üzerine, TβRII TβRI fosforile. Aktif TβRI reseptör Smads fosforilleyerek (R-Smads), yani Smad2 ve Smad3, onun hücre içi kanonik sinyal yolağı başlatır. Bu aktive R-Smads çekirdeğinde birikir ve hedef genlerin 5 transkripsiyonunu düzenleyen Smad4 heteromeric kompleksleri oluşturur. Buna ek olarak, daha önce described smad yolu olmayan bazı smad sinyalizasyon yolaklar aktivasyonu reseptör aktivasyonu sonuçları, örneğin Mitojen Protein Kinaz (MAPK) 6 yolakları. Meme kanseri farklı aşamalarında TGF-β rolünü araştırmak için, biz MCF10A hücre sistemi kullanmak yaptı. Bu sistem kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A1 (M1), meme epitel hücreleri 7 oluşur, H-RAS farelerde 8 premalign lezyonları M1 türev MCF10AneoT (M2), ve gelen kurulmuştur M2 türev MCF10CA1a (M4) dönüştürdü M2 xenografts ve formlar 9 akciğer metastaz yeteneği ile yüksek dereceli karsinomlar. Bu MCF10A serisi hücre yanıtları farklı bir genetik arka önyargılı değildir malignite farklı sınıflarda eğitim imkanı sunuyor. TGF-β indüklenen işgalinin analizi için, biz homotypic MCF10A sfero hücre kültürleri embe oluşturulan3D kollajen matriks in vitro (Şekil 1) dded. Bu modelleri yakından sfero 10 iç hatta dış nekrotik ve latent veya hücreleri üzerinde aktif ve invaziv hücrelerinde oksijen ve besin maddelerinin bir degrade kurarak in vivo insan tümörleri andırır. Sfero bazlı çalışmaları da tek tabaka kültürler 11 ilaç direnci daha iyi özetlemek için gösterilmiştir. Bu MCF10 3D model sistem malignite farklı aşamalarında meme hücrelerinin invaziv özelliklerini TGF-β sinyal etkisini araştırmak için izin verdi.

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

TGF-&beta;, başlangıç aşamasında bir tümör baskılayıcı olarak hareket ederek, ancak invazyon ve metastazı stimüle ederek meme kanseri progresyonunda zıt rollere sahiptir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, üç boyutlu bir ortamda TGF beta ile indüklenen invazyonun potansiyel düzenleyicilerinin etkisini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin sferoidleri oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından PHE'ler, 3D bir ortam sağlayan kolajen içine gömülür.Ardından, invaziv alan miktarlaştırılır. Tedavinin TGF beta tarafından indüklenen invazyon üzerindeki etkisini belirlemek için elde edilen sonuçlar, TGF-beta yolak modülatörlerinin, 3D kolajen matris içindeki steroidlerin invaziv özelliğini etkilediğini göstermektedir. Bu tekniğin çizik testi (scratch assay) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, 3D ortamı daha iyi yeniden yansıtmasıdır.Bu yöntem, TGF beta kaynaklı invazyonla ilişkili yeni genlerin tanımlanması gibi T metre alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. TGF beta kaynaklı invazyon deneyi için metil hücre çözeltisi hazırlamak üzere, manyetik karıştırıcı içeren 500 mililitrelik bir şişede altı gram Metilselülozu otoklavlayarak başlayın. Metilselülozu, serum içermeyen 250 mililitre önceden ısıtılmış D-M-E-M-F 12 içinde 20 dakika boyunca çözün, %10 at sırumu içeren oda sıcaklığındaki 250 mililitre D-M-E-M-F 12'yi ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca karıştırın; ertesi gün çözeltiyi dört derece santigrat sıcaklıkta, 5,000 G'de iki saat boyunca santrifüj ederek berraklaştırın.Berrak, yüksek viskoziteli çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın ve phe kültürü için kullanana kadar dört derece Celsius'ta saklayın. Hazırlanmış 10 mililitre metil hücre stok ve 40 mililitre büyüme medyumu kullanarak %20'lik bir metil hücre çözeltisi hazırlayın. MCF 10 A hücrelerini PBS ile iki kez yıkayın.%0,1 tripsin ekleyin ve tüm hücreler ayrılana kadar hücreleri 37 °C'de inkübe edin. Hücreleri 10 mL büyüme ortamında yeniden süspande edin ve bir hücre sayıcı kullanarak hücreleri sayın. %20 metil selüloz içerisinde mililitrede 10.000 hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın.Her bir test koşulu için, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı süspansiyon plakasının 12 kuyucuğuna 100 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün sferoid oluşumunu kontrol edin.Sferoidler bir ila üç gün içinde kullanıma hazır olacaktır. Buz üzerinde sekiz mililitre kolajen, bir mililitre 10 XPBS, bir mililitre 0,1 normal sodyum hidroksit ve üç damla 0,1 normal hidroklorik asitten oluşan bir çözelti hazırlayın. Çözeltinin pH değerini pH indikatör şeritleri üzerine damlatarak 7,4 olduğunu doğrulayın.pH aralık dışındaysa ayarlayın. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 50 µL nötralize edilmiş kolajen çözeltisi ekleyin ve yaklaşık 90 dakika boyunca veya kolajen katılaşana kadar 37 °C'de inkübe edin. Test edilecek her bir ligand için, buz üzerinde bir metil hücre kolajen ligand çözeltisi hazırlayın.Tedavi başına bir mililitre kolajen çözeltisi ile başlayın ve vorteksleyerek karıştırarak, beş nanogram/mililitre son konsantrasyonu sağlamak için 20 nanogram TGF beta ekleyin. Ardından, toplam hacim iki mililitre olacak şekilde bir mililitre metil hücre çözeltisi ekleyin ve vorteksleyin. Bir steroid gömmek için, 200 mikrolitrelik bir pipete, ucundan beş milimetre veya daha fazlası kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu yerleştirin.Ardından, bir S sferoidini pipetle alın. S sferoidinin ucun içinde kaldığından emin olarak, besiyerini dikkatlice boş bir plakaya aktarın. Pistonu serbest bırakmayın.Kollajen metil hücre karışımından 100 µL alın ve sferoid kollajen karışımını, 96 kuyucuklu bir plakanın kollajen kaplı kuyucuğuna aktarın; her koşul için 12 kuyucuğu doldurun. Kollajenin 37 °C'de en az 30 dakika boyunca katılaşmasını bekleyin ve hava kabarcıklarını 200 µL'lik bir uç yardımıyla giderin.1,6% at eti serumu içeren D-M-E-M-F 12'nin bir mililitresine dört mikrolitre SB 4 31 542 stok çözeltisi ekleyerek 40 mikromolar TGF beta inhibitörü SB 4 31 542 çözeltisi hazırlayın. Difüzyondan sonra her kuyucuğa inhibitörlü ortamdan 50 mikrolitre ekleyin. İnhibitörün nihai konsantrasyonu 10 mikromolar olacaktır.Steroidin mikroskop altında 40 x büyütme ile fotoğraflarını çekin, ardından 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. İki günlük inkübasyonun ardından tekrar fotoğraflar çekin ve bir sferoid fotoğrafını Adobe Photoshop'ta açarak istila eden steroidin alanını ölçün. Genişletme işlemini yapın ve hızlı seçim aracını seçin.Sferoid üzerinde imleci sürüklerken fare imleci, artı işaretli bir daireye dönüşecektir. Yazılım, sferoidin sınırlarını tanıyacaktır. Sferoid dışında bir alan seçilirse, alt tuşuna basarak veya araç çubuğundaki eksi işareti olan negatif seçim aracını kullanarak bu alanı hariç tutun.İmleci yanlış seçilen alanın üzerine sürüklediğinizde, yazılım bu alanı seçimden çıkaracaktır. Sferoid içindeki bir alan seçimden çıkarılırsa, shift tuşuna basılı tutarak sürükleme yaparak bu alan yeniden seçime dahil edilebilir. Daha hassas çalışmak için araç çubuğundaki fırça çapını değiştirerek fare imlecinin boyutunu ayarlayın.Tüm aktif seçimlerin alanını hesaplamak için menü çubuğunda analiz ölçümünü seçin. Dosya adını ve seçim alanını pikseller cinsinden gösteren bir ölçüm kayıt penceresi açılacaktır. Bir sferoid içerisinde birden fazla seçim ölçülürse, ilk satır tüm alanların toplamını, altındaki satırlar ise her bir alanı gösterecektir.Bireysel seçimlerin değerlerini listeleyecektir. Verileri bir metin dosyasına dışa aktarın ve excel'de açın. Normal meme epitel hücreleri olan MCF 10 A, transformasyon geçirmiş MCF 10 A neo T hücreleri ve M iki türevli MCF 10 CA one A ile yapılan S sferoit deneyi örneği burada gösterilmiştir.M1 hücreleri stimülasyon olmadan sadece zayıf bir invazyon göstermiş, ancak TGF beta stimülasyonu sonrası belirgin şekilde daha iyi invaze olmuştur. Buna karşılık, RA'lar ile transforme edilmiş M1 türevi M iki, stimüli eklenmeden verimli bir şekilde invaze olmuş ve bu durum dört ila beş kat daha artmıştır. TGF beta tedavisi sonrası M dört hücreleri, hem TGF Beta eklemesi olmadan hem de eklemesiyle birlikte en güçlü invazyonu göstermiştir.Bu deneyin sonuçlarının grafiksel bir gösterimi Photoshop kullanılarak elde edilmiştir ve burada gösterilmiştir; TGF beta reseptör birinin kinaz aktivitesinin seçici bir inhibitörü ve bir ATP analoğu olan, aynı zamanda tip bir B reseptöründe ve reseptör benzeri kinaz yedide aktif olan SB 4 31 5 42 hücre kültürlerine eklenmiştir. SB 4 31 5 42, M1, M2 ve M4 hücrelerinin TGF beta ile indüklenen invazyonunu güçlü bir şekilde inhibe ederek, TGF-beta ile indüklenen invazyonun TGF-beta reseptör bir kinazına bağımlı olduğunu göstermiştir. Ayrıca, PHE'nin bazal invazyonu güçlü bir şekilde inhibe edilmiştir. Bu deneyin sonuçlarının grafiksel bir gösterimi yeniden Photoshop kullanılarak oluşturulmuştur ve burada gösterilmektedir.Bu prosedürün ardından, hangi genlerin veya hangi proteinlerin eksprese edildiği gibi ek soruları yanıtlamak için RNA izolasyonu veya protein izolasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, tavita kaynaklı invazyonun yeni modülatörlerinin nasıl bulunacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

spheroid-assay-to-measure-tgf-induced-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Guyon, J.,  et al. Glioblastoma için bir 3D sferoid modeli. J. Vis. Uzm. (2020)Video, tümör hücresi istilasının üç boyutlu küresel bir modelinin oluşturulmasını göstermektedir. Sferoidler, insan beyni tümör hücrelerinden oluşur ve bir kollajen matrisine gömülür. Küresel periferdeki tümör hücreleri, kollajeni parçalamak için proteazlar salgılayan ve çevredeki matrisi istila etmek için ilerleyen istilacı bir fenotip benimser.

Tümör Hücresi İstilasının Üç Boyutlu Küresel Modelinin Oluşturulması

Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

HMCA tabanlı görüntüleme plaka işgali tahlil performans için sunulmaktadır. Bu plaka üç boyutlu (3D) tümör pulcuklarının oluşumu ve hücre dışı matriks (ECM) içine kanser hücre işgalinin ölçüm kolaylaştırır. İstila tahlil miktar yarı otomatik analizi ile elde edilir.

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Tümör mikroçevre kanser büyüme ve işgali önemli bir parçasıdır. Karsinom ilerlemesini taklit etmek için biyolojik olarak alakalı bir insan matrisine ihtiyaç vardır. Bu protokol, insan leiomyoma tabanlı matris uygulayarak in vitro üç boyutlu küroid invazyonu tahlil için bir gelişme tanıtır. Protokol aynı zamanda bilgisayar tabanlı bir hücre istilası analizi sunar.

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Öğrenin, TGF-β kaynaklı invazyonu 3 boyutlu kollajen jellerde MCF10A hücre hatları kullanarak nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, meme kanseri ilerlemesindeki işgal mekanizmalarını incelemek için diğer hücre hatlarına da uyarlanabilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Daha fazla video keşfet