3'UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Bu prosedürün genel amacı, insan 3' UTR'lerinde öngörülen mikro RNA hedeflerini doğrulamak için reporter konstrüktlarını bir mikro RNA mimiği ile birlikte ko-transfekte etmektir. Bu işlem; öncelikle bir hücre hattının seçilmesi ve deneysel ve kontrol 3' UTR Go Clone reporter konstrüktları ile birlikte mikro RNA mimiklerinin belirlenmesini içeren bir deneysel tasarımın oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, adheran hücreler transfeksiyondan yaklaşık 24 saat önce ekilir. Prosedürün bir sonraki adımı, her bir deneysel veya kontrol 3' UTR Go Clone reporter konstrüktünün bir mikro RNA mimiği veya hedef dışı kontrol ile ko-transfekte edilmesi ve ardından 24 ila 48 saatlik bir inkübasyon sürecidir. Son adım olarak, light switch lüsiferaz assay reaktifi doğrudan hücre ve kültür ortamına eklenir ve lüminesan sinyal bir plat lüminometre ile okunur.

Nihayetinde, raporlayıcı assay teknolojisi ile lusiferaz sinyalinin azalmasının ölçümü yoluyla, hangi insan 3' UTR'lerinin belirli bir microRNA'nın hedefi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, canlı hücrelerde öngörülen microRNA 3' UTR hedef etkileşimlerini doğrulamak için fonksiyonel bir assay sağladığından, microRNA araştırmacılarının temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Deneysel tasarım, uygun, yüksek transfeksiyona sahip bir adherent hücre hattının seçimi ile başlar; microRNA mimic bazlı assayler, microRNA'nın endojen ekspresyon seviyelerinin düşük olduğu hücre hatlarında en iyi sonucu verir.

Ardından, mikro RNA mimic ve hedef dışı kontrol çiftini seçin; bir hedef dışı kontrolün dahil edilmesi kritiktir çünkü bir plazmid ile küçük bir RNA oligonükleotidinin birlikte transfekte edilmesi, plazmidin tek başına transfekte edilmesine göre daha düşük sinyale yol açar. Sonra, switchgears genom çapındaki koleksiyonundan ön klonlanmış 3' UTR Go Clone reporter konstrüktlerini seçin. Çevrimiçi kataloğa gidin ve UTR arama düğmesine tıklayın.

Gen isimleri, gen sembolleri veya erişim numaraları listesi girildikten sonra, arama sonucu vektör ve sekans bilgilerinin yanı sıra envanter durumunu sağlayacaktır. Şimdi kontrol raporlayıcı konstrüktları seçin. Mikro RNA'nın genel hücre sağlığı veya analiz sinyali üzerindeki spesifik olmayan etkilerini kontrol etmek için, housekeeping dizileri veya rastgele fragmanlar gibi, seçilen mikro RNA tarafından hedeflenmesi düşük ihtimal olan 3' UTR içeren kontrol konstrüktlarını tercih edin.

Ayrıca, birinci günde düşük pasajlı aderent hücreleri ekin; böylece transfection işleminden 24 saat sonra %80 ila %100 konfluans seviyesine ulaşacaklardır ve mimic aktivitesi için pozitif kontrol olarak sentetik bir mikro RNA hedef raporlayıcısı kullanmayı değerlendirin. İyi sonuçlar elde etmek için yüksek konfluansa sahip hücreler kullanmak temel şarttır. Hücreleri, toplam 100 µL hacimde beyaz bir 96 kuyucuklu doku kültürü plakasına ekin.

Paralel olarak. Hücre ekiminden 24 saat sonra, 2. günde, şeffaf bir plakadaki hücrelerin aniden konfluens olup olmadığını uygun sayıda hücre için kontrol edin. Transfeksiyon çözünürlüğü için hazırlık yapın.

Reporter konstrüktlerini ve mikro RNA'ları oda sıcaklığında çözdürün. Çözündükten sonra iyice karıştırın ve mikro RNA'ları RNA'sız su ile 2 µM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltein; plazmid DNA'sı 30 ng/µL konsantrasyonda sunulur ve daha fazla seyrelme gerektirmez. Transfeksiyon karışımını hazırlarken, her bir DNA-RNA kombinasyonunun üç tekrarlı olarak transfekte edilmesi gerektiğini göz önünde bulundurun; hacim, gerçekleştirilecek analiz sayısına göre ölçeklendirilmelidir.

Her transfeksiyon için 9.85 µL serumsuz medyum ve 0.15 µL Dharma effect DUO'yu birleştirerek transfeksiyon reaktif karışımını hazırlayın. Karışımın oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesini sağlayın. Ardından, 3.33 µL go klon raporlayıcı konstrükt ile istenen nihai konsantrasyona ulaşacak miktarda mikro RNA mimiği birleştirerek her analiz için D-N-A-R-N-A karışımını hazırlayın.

Hacmi serumsuz besiyeri ile 10 µL'ye tamamlayın. Ardından, 10 µL transfeksiyon reaktifi karışımını her bir DNA-RNA karışımının 10 µL'si ile birleştirin ve iyice karıştırın. Her bir analiz için final hacmi 20 µL'dir.

Kuyucukların üzerini kapatın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir kuyucuk için toplam hacim 100 µL olacak şekilde önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz tam besiyerinden 80 µL ekleyin; bu işlem, analizde 10 ile 15 nM arasında nihai mimik konsantrasyonları ile sonuçlanacaktır.

Son adım olarak, hücrelerin ekildiği her kuyucuktaki medyayı dikkatlice uzaklaştırın ve yerine 100 µL uygun nihai transfeksiyon karışımı ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Karışımların çoğu 24 saat içinde anlamlı sonuçlar verecektir.

48 saatlik bir inkübasyon süresi, kuyucuklar arası sinyal varyasyonunun artmasına neden olacaktır. Transfeksiyondan 24 saat sonra, 3. günde light switch lusiferaz assay reaktiflerini kullanarak lusiferaz assay'leri gerçekleştirin; hücreler hemen analiz edilebilir veya -80 °C'de dondurulup daha sonra analiz edilebilir. Dondurma-çözme döngüsünün eklenmesi, hücre lizisinin artmasını ve daha yüksek reporter sinyali elde edilmesini sağlar. Transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu plakayı oda sıcaklığına getiriniz.

Ardından, kit talimatlarına göre light switch lusiferaz analiz çözeltisini hazırlayın ve steril bir rezervuara boşaltın. Her bir örneğin kuyucuğuna, beyaz 96 kuyucuklu plakadaki her bir örneğe doğrudan 100 µL light switch analiz çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı kapatarak ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

Her kuyucuğu bir plak Luminometre ile iki saniye boyunca okuyun. Üç prime UTR Luciferase raporer aktivitesinin let-7a tarafından baskılanması, her bir raporer konstrüktün let-7a mimiği veya hedef dışı kontrol ile birlikte transfekte edildiği HT 1080 hücrelerinde ölçülmüştür. Sonuçları analiz etmek için hedef dışı kontrolden gelen sinyali, her konstrükt için %100 olarak kabul edin.

Spesifik mikro RNA mimic'inden gelen sinyali, hedef dışı kontrol sinyaline bölerek yüzde baskılanmayı (knockdown) hesaplayın. Herhangi bir mikro RNA mimic'i, genel hücre canlılığı veya assay sinyali üzerinde spesifik olmayan etkilere sahip olabilir; bu nedenle tüm spesifik olmayan etkileri düzeltin. Deneysel bir UTR hedefi ile gözlemlenen baskılanmayı, burada gösterildiği gibi housekeeping veya rastgele kontrol T ile gözlemlenen baskılanma ile karşılaştırın.

PONC ve arid 3B insan 3' UTR bölgeleri, let-7a mikroRNA'larının hedefleridir. PONC ve arid 3B genleri için insan 3' UTR raporlayıcılarından gelen sinyaller, let-7a mikroRNA mimiği varlığında önemli ölçüde azalırken; housekeeping ve rastgele sekans UTR'lerine ait sinyaller azalmamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde mikroRNA mimikleri ve 3' UTR raporlayıcı konstrüktların başarılı bir ko-transfeksiyonunun nasıl kurulacağı ve sinyal azalmasını ölçmek için lüminometredeki sinyalin nasıl okunacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.