3'UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Bu prosedürün genel amacı, insan üç asal T'sinde tahmin edilen mikro RNA hedeflerini doğrulamak için bir mikro RNA taklidi ile transfect raportör yapılarını bir araya getirmektir.Bu, ilk olarak bir hücre hattı seçme ve deneysel ve kontrol ile birlikte mikro RNA taklitçilerinin seçilmesi dahil olmak üzere deneysel bir tasarım ortaya konarak gerçekleştirilir üç asal UTR Go Klon muhabir yapısı Yapışma hücreleri daha sonra transfeksiyondan yaklaşık 24 saat önce oturtulur. Prosedürün bir sonraki adımı, her bir deneysel veya kontrol üç asal UTR go klon raportör yapısını bir mikro RNA taklidi veya hedef olmayan ve kontrol ile birlikte transfekte etmek ve ardından 24 ila 48 saatlik bir inkübasyon yapmaktır. Son adım olarak, ışık anahtarı lusiferaz tahlil reaktifi doğrudan hücrelere ve kültüre eklenir ve Lumin koku sinyali bir plaka luminometresinde okunur.

Nihayetinde, raportör tahlil teknolojisi ile lusiferaz sinyal yıkımının ölçülmesi yoluyla belirli bir mikro RNA'nın hangi insan üç asal ur'unun hedefi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, mikro RNA araştırmacıları için temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, çünkü canlı hücrelerde tahmin edilen mikro RNA üç asal UTR hedef etkileşimini doğrulamak için işlevsel bir tahlil sağlar. Deneysel tasarım, uygun bir yüksek transfekte yapışma hücre hattı mikro RNA'sının seçilmesiyle başlar, taklit tabanlı tahliller, mikro RNA'nın düşük endojen ekspresyon seviyelerine sahip hücre hatlarında en iyi sonucu verir.

Ardından, mikro RNA taklidi ve hedef olmayan kontrol çiftini seçin, hedef olmayan bir kontrol de dahil olmak üzere, bir plazmidi ve küçük bir RNA oligosunu kesen manto, tek başına plazmidin kesilmesinden daha düşük sinyale yol açtığından kritiktir. Ardından, anahtarlama cihazları genom geniş koleksiyonundan ön klon üç asal UTR Go Clone muhabir yapısını seçin. Çevrimiçi kataloğa gidin ve UTR arama düğmesine tıklayın.

Gen adları, gen sembolleri veya erişim numaraları listesini girdikten sonra, arama sonucu envanter durumu ile birlikte vektör ve dizi bilgileri sağlayacaktır. Şimdi kontrol muhabiri yapılarını seçin. Mikro RNA aşırı ekspresyonunun genel hücre sağlığı veya tahlil sinyali üzerindeki spesifik olmayan etkilerini kontrol etmek için temizlik, urs veya rastgele fragmanlar gibi seçilen mikro RNA tarafından hedeflenmesi muhtemel olmayan üç ana Ur içeren kontrol yapılarını seçin.

Ayrıca, birinci gün tohum düşük geçişli yapışma hücrelerinde taklit aktivitesi için pozitif bir kontrol olarak sentetik bir mikro RNA hedef raportörü kullanmayı düşünün, böylece 24 saat sonra transfeksiyon için %80 ila 100 arasında birleşmiş olurlar. Son derece akıcı hücreler kullanmak, iyi sonuçlar elde etmenin anahtarıdır. Hücreleri, 100 mikrolitre toplam hacimde beyaz 96 oyuklu bir doku kültürü plakasına tohumlayın.

Paralel olarak. Ani bir birleşme için şeffaf bir plakada uygun hücre sayısına bakın: 2. günde, hücre oturmasından 24 saat sonra. Transfeksiyon çözülmesi için hazırlanın.

Oda sıcaklığında raportör yapılarını ve mikro RNA'ları klonlayın. Çözüldükten sonra, iyice karıştırılmış, mikro RNA'ları RNA'larda iki mikromolar çalışma konsantrasyonuna seyreltin, serbest su goone plazma DNA'sı mikrolitre başına 30 nanogramda verilir ve daha fazla seyreltme gerektirmez. Transfeksiyon karışımını hazırlamak için, her bir D-N-A-R-N-A kombinasyonunun, gerçekleştirilen tahlil sayısını hesaba katacak şekilde üç kopya hacimde transfekte edilmesi gerektiğini göz önünde bulundurun.

Transfeksiyon başına 9.85 mikrolitre serum serbest ortam ve 0.15 mikrolitre Dharma etkisi DUO'yu birleştirerek transfeksiyon reaktif karışımını oluşturun. Karışımın oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesine izin verin. Ardından, istenen nihai konsantrasyonu elde etmek için 3.33 mikrolitre go klon raportör yapısını yeterli mikro RNA taklidi ile birleştirerek her test için D-N-A-R-N-A karışımını oluşturun.

Serum içermeyen medya ile hacmi 10 mikrolitreye getirin. Daha sonra, 10 mikrolitre transfeksiyon reaktif karışımını her bir D-N-A-R-N-A karışımından 10 mikrolitre ile birleştirin ve iyice karıştırın. Her tahlil için 20 mikrolitrelik son bir hacim vardır.

İyice örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, 80 mikrolitre antibiyotik içermeyen ön ısıtma ekleyin. Bireysel kuyucuk başına toplam 100 mikrolitre hacim için komple ortam, 10 ila 15 nanomolar arasında nihai mimik konsantrasyonları ile sonuçlanan tahlildir.

Son adım olarak, ortamı tohumlanmış hücrelerin her bir oyuğundan dikkatlice çıkarın ve uygun son transfeksiyon karışımından 100 mikrolitre ile değiştirin. Plakayı inkübatöre geri koyun ve 24 ila 48 saat inkübe edin. Karışımın çoğu 24 saat içinde önemli sonuçlar verecektir.

48 saatlik bir inkübasyon süresi, sinyalde daha yüksek kuyudan kuyuya varyasyona neden olacaktır: Transfeksiyondan 24 saat sonra, 3. günde, ışık anahtarı lusiferaz tahlil reaktifleri kullanılarak lusiferaz tahlilleri yapın, hücreler hemen test edilebilir veya eksi 80 santigrat derecede dondurulabilir ve daha sonra test edilebilir. Donma çözülme döngüsünün eklenmesi, gelişmiş hücre lizisi ve daha yüksek raportör sinyali ile sonuçlanacaktır. Kopyalanan hücrelerin plakasını oda sıcaklığına getirin.

Daha sonra ışık anahtarı lusiferaz tahlil solüsyonunu kitlerin talimatlarına göre hazırlayın ve steril bir rezervuara dökün. Her numuneye doğrudan 100 mikrolitre ışık anahtarı tahlil çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipetleyici kullanın. Beyaz 96 oyuklu plakada, plakayı örtün, ışıktan koruyun ve inkübasyonun ardından oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Her bir kuyucuğu bir plaka üzerinde iki saniye boyunca okuyun: Luminometre, üç asal UTR, Luciferaz raportör aktivitesinin LE yedi A ile yıkılması, HT 10 80 hücrelerinde manşon ile ölçüldü. Sonuçları analiz etmek için her bir muhabir yapısını bir let seven A mimik veya hedef olmayan kontrol ile transekte etmek. Hedef olmayan denetimden gelen sinyalin her yapı için %100 olduğunu düşünün.

Spesifik mikro RNA taklitçisinden gelen sinyali hedef olmayan kontrol sinyaline bölerek yıkım yüzdesini hesaplayın. Herhangi bir mikro RNA taklidi, genel hücre canlılığı üzerinde spesifik olmayan etkilere veya spesifik olmayan etkileri düzeltmek için test sinyaline sahip olabilir. Deneysel bir UTR hedefi ile gözlemlenen devrilmeyi, burada gösterildiği gibi temizlik veya rastgele kontrol T ile gözlemlenen devrilme ile karşılaştırın.

PONC ve kurak üç B insan üç asal ur, PUNC için insan üç asal UTR muhabirinden gelen yedi A mikro RNA sinyallerinin hedefidir ve kurak üç B geni, yedi A mikro RNA taklidi varlığında önemli ölçüde yere serilir. Temizlik ve rastgele sıra için sinyaller URS olmasa da. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde başarılı bir bebek karyolası, mikroRNA taklitlerinin transfeksiyonu ve üç ana UTR raportör yapısının nasıl kurulacağını iyi anlamalı ve sinyal kilitlemesini ölçmek için luminometredeki sinyali okumalısınız.