Name: 3UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, LightSwitch lusiferaz sistemiyle insan hücrelerinde mikroRNA hedeflerini doğrulama yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesi araştırmalarında 3'UTR etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Giriş MicroRNA birçok önemli biyolojik süreçlerin aktivitesini düzenleyen gen ekspresyonu önemli bir düzenleyici olarak ortaya çıkmıştır. 700'den fazla insan miRNA'lar Şimdiye kadar 1 tanımlanan, mutasyonlar ve miRNA'lar yanlış düzenleme, kanser ve kalp hastalığı 2,3 gibi çeşitli fizyolojik bozukluklar ile bağlantılı olması şaşırtıcı değil. Son çalışmalar miRNA düzenleyici bağlayıcı sitelerin çoğunluğu 3'UTRs 4,5 olduğunu göstermiştir ve bazı araştırmacılar, yüzlerce hücre 6 miRNA başına hedefleri olduğunu tahmin etmektedir . MiRNA'lar biyolojik önemi göz önüne alındığında, çok sayıda var miRNA'lar ve bunların her biri için çok sayıda hedefler, araştırmacılar, güvenilir, tercihen yüksek verimli çalışmalar için uygun platformlarda miRNA'lar endojen hedefleri tespit etmek mümkün olduğu kritik öneme sahiptir. MiRBase, TargetScan ve PicTar 1,6,7 gibi hesaplama araçlarını kullanarak herhangi bir miRNA için olası mRNA hedefleri listeleri oluşturmak için güçlü bir yol olsa da, tahminlerin henüz sadece 8 güvenerek yeterince doğru değildir . Bu nedenle, araştırmacılar da hedefleri de novo öngörülen hedefler belirlemek veya doğrulamak için bir dizi deneysel yaklaşımlar kaldıraç. Birçok ekipleri ifade değişiklikleri miRNA aktivite olduğunda 4,9,10 tedirgin olan genleri tanımlamak için kararlı durum mRNA veya protein düzeyleri yüksek verimlilik önlemleri dayanıyordu. Bu tür değişiklikler, ancak bir miRNA bir transkript ve dolaylı veya alt sinyalizasyon etkileri üzerinde doğrudan etkileri arasında bir ayrım yapmaz, hiç kuşkusuz genel ifade değişiklikleri ölçerek biyolojik olarak anlamlı ve önemli bir ilk adımı temsil ediyor. MiRNA-mRNA doğrudan etkileşim için kanıt Diğer güçlü araçlar miRNA'lar ve mRNA'ların çapraz bağ argonaute proteinler (ve böylece RISC kompleksi), etkileşim ortakları belirlemek rağmen derhal işlevsel etkileri göstermek değildir kromatin-immunoprecipitation (ChIP) stratejileri gibi bağlayıcı bir olay 5,11. Böylece, belirli bir UTR miRNA etkisi için fonksiyonel kanıt 3'UTR muhabiri testlerin, kapsamlı bir miRNA çalışmanın önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Hesaplamalı hedef öngörüleri veya ifade ve proteomik verileri ile birlikte ele alındığında bu hücre bazlı analiz verileri belirli bir 3'UTR doğrudan ilgi miRNA tarafından düzenlenir dair güçlü kanıtlar sağlar. 3'UTR muhabiri tahlil, ilgi bir gen 3'UTR lusiferaz muhabiri gen sonuna kadar erimiş. 3'UTR bir miRNA bir hedef ise, muhabir transkript istikrar ve / veya çeviri verimliliği fonksiyonel miRNA konsantrasyon değişimi ile değişecektir. Yani transkript-bazlı testlerin aksine, muhabir testlerinde istikrarlı bir devlet mRNA ve protein düzeyleri üzerindeki etkileri tespit yardımcı olur. Muhabir sistemleri de aslında interaction8 için gerekli olduğunu onaylamak için bir 3'UTR bir varsayılan miRNA bağlayıcı site mutagenizing fonksiyonel etkilerini incelemek için de kullanılıyor olabilir. Ifade diziler, proteomik teknikler ve argonaute ChIP kullanarak büyük ölçekli çalışmalar, çok az sayıda deneysel koşullar, hücre tabanlı muhabiri deneyleri için değerli genom veri sağlar miRNA-3 'çalışma için ölçeklendirme için en müsait UTR etkileşimler gibi koşullar yüzlerce ya da binlerce küçük moleküller veya diğer kütüphane tabanlı etkileyiciler yüksek verimli tarama için gerekli olabilir. Birçok bilim adamı çalışma miRNA 3'UTR etkileşimleri muhabiri tahlil teknolojisini uyguladık. Ancak, birçok miRNA'lar her hedef yüzlerce farklı transkript, yüksek verimli bir ölçekte bu güçlü bir yaklaşım kullanmak için araştırmacılar için zor olduğunu fikri ile binlerce farklı oluşturmak için klonlama, doğrulama ve optimizasyon adımları çünkü 3'UTR muhabir vektörler pahalıdır maliyet. 3'UTR-muhabiri, küçük ve büyük ölçekli çalışmalar herhangi bir araştırmacı için ulaşılabilir kılmak amacıyla, biz, insan 3'UTRs yüksek optimize LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi içine önceden klonlanmış bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. Muhabir sistemi de doğrulanmış kontrolü vektörler, pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere 700'den fazla sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları bir dizi ve bir dizi standart deney protokolleri içerir. Aşağıdaki protokolü kullanarak, belirli bir insan 3'UTR ilgi miRNA bir hedef olup olmadığını sorabilirsiniz. Bu iş akışında kritik adımlar, deneysel tasarım, muhabir yapıları ve miRNA taklit transfeksiyon, lusiferaz muhabiri testleri ve veri analizi. Deneysel tasarım, düşünceli bir transfectable hücre hattı, deney ve kontrol muhabiri yapıları, ve miRNA taklit ve hedefleme kontrolleri önemlidir. Ortak yüksek transfectable adhHT1080, HepG2 gibi erent hücre hatları, HCT-116, Hela, 293, ve diğerleri genellikle bu protokol ile iyi çalışır. Deneysel tasarım ile ilgili önemli notlar LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi RenSP lusiferaz gen ve LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanan GoClone yapıları içeren bir tam optimize muhabiri sistemi. En iyi muhabir tahlil sonuçları elde etmek için önerilen LightSwitch Sistem tüm bileşenleri kullanın. Şalt GoClone muhabiri yapıları ile herhangi bir oligos / plazmid Co-transfeksiyon non-spesifik bir şekilde genel lusiferaz sinyalleri azaltır. Bu nedenle, aşağıdaki transfeksiyon kombinasyonları gerçekleştirmek için önemlidir: sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabiri + özel miRNA. Empty_3UTR vektör (güçlü organizatörü, UTR yok) lusiferaz sinyal çok yüksek bir seviyeye sağlar ve transfeksiyon verimliliği için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve sentetik miRNA hedef muhabiri vektör taklit aktivite için bir pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, biz doğru sıra-özel vs non-spesifik etkileri ayırmak için GoClone 3'UTR temizlik kontrolleri ve rasgele denetimler kullanmanızı öneririz. Çalışma protokolü ve mümkün pipetleme hata veya buharlaşma nedeniyle veri değişkenliği azaltmak için master miksler yapmak. Bu protokol DharmaFect Duo transfeksiyon reaktifi (Dharmacon) kullanır. 1. Gün ÖNEMLİ İPUCU: hücre hattı akıllıca seçin. En iyi sonuç için, transfectable olduğu bilinen bir hücre hattı kullanın. Biz de o belirli miRNA yüksek endojen seviyeleri ile hücre hatları içinde zayıflatılmış bir miRNA 3 'UTR muhabiri ölçülebilir yanıt taklit olduğunu bulduk. Hücre hattı ifade miRNA nasıl bilmiyorsanız, dolaylı bir hücre, testin dinamik aralık olarak bildiren yanı sıra belirli bir miRNA bolluğu önlemler SGG sentetik microRNA hedef deneyin. 1. Tohum hücreleri transfeksiyon süresi ≥ 80% izdiham verim. <ol><li> Tohum hücreleri 100μl toplam hacmi 96-de beyaz TC plaka. </li><li> Izdiham değerlendirmek için net 96-plaka paralel, tohum hücrelerin uygun sayıda. </li></ol> ÖNEMLİ İPUCU 1: Confluence taklit deney iyi sonuçlar elde anahtarıdır. Optimum demonte için, hücre Transfeksiyondan zamanda konfluent% 100 olmalıdır. ÖNEMLİ İPUCU 2: En iyi sonuçları elde etmek için düşük geçit hücreleri kullanın. Çok kez geçişli olan hücreler gürültülü transfeksiyon veri verim eğilimindedir. 2. Gün GoClonereporter yapıları ve miRNA'lar hazırlayın, sonra konfluent hücrelerin içine transfect. 2. Oluşturur hazırlayın <ol><li> Çözülme GoClone yapıları oda sıcaklığında (plazmid DNA). İyice karıştırın. </li><li> Santrifüj kapağı yoğunlaşma kaldırmak için. </li></ol> 3. Mikro RNA'lar hazırlayın <ol><li> Oda sıcaklığı ve yoğuşma kapakları kaldırmak için santrifüj çözülme microRNA (özel taklit ve hedefleme olmayan kontroller). </li><li> RNaz içermeyen su 2 mcM bir çalışma konsantrasyonu seyreltilir. </li></ol> Deneysel bir miRNA ek olarak DAİMA olmayan bir hedefleme miRNA kontrolü de taklit ediyor. Co-transfecting plazmid ve küçük bir RNA oligo yalnız plazmid transfecting daha düşük sinyal yol açar. Bir veya daha fazla pozitif kontroller içerir. SGG katalog sentetik miRNA hedef muhabiri vektörler yüzlerce birini kullanmayı düşünün. Bir veya daha fazla negatif veya non-spesifik kontrolleri ekleyin. SGG kontrolleri 3 'UTRs housekeeping genler, rastgele parçaları ve / veya boş (hayır UTR insert) kontrolü de dahil olmak üzere bir dizi vardır. Bir veya daha fazla deneysel bir yapı ile birlikte bu denetimleri özel miRNA veya olmayan hedefleme kontrolü aşırı ekspresyonu atfedilebilecek herhangi bir non-spesifik etkileri normalleştirmek için izin verecektir. 4. Transfections hazırlayın <ol><li> Her transfeksiyon için tek bir tahlil için aşağıdaki reaktifler birleştirmek: </li></ol> Karışım 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Bireysel GoClone muhabiri: </td><td> 3.33 mcL </td></tr><tr><td> microRNA: </td><td> * Değişir. </td></tr><tr><td> Serum ücretsiz medya: </td><td> 10 mcL </td></tr></tbody></table> * Etkili konsantrasyon miRNA 10 nM-100 nM değişebilir. Uygun konsantrasyonu için miRNA üreticisine danışın. ÖNEMLİ İPUCU: taklit çok fazla eklemek etmeyin. Taklit konsantrasyonları için makul bir son 100uL reaksiyon aralığı 10-50 nM. En az üç çoğaltma gerçekleştirinte her bir tedavi / UTR kombinasyonu transfections ve hata pipetleme izin vermek için ek hacim içerir. Örneğin, hata veya buharlaşma pipetleme için ekstra dahil olmak üzere 3 çoğaltmak transfeksiyon kuyu için yeterli transfeksiyon karışımı elde etmek için tek bir reaksiyon hacimleri 3.5 ile çarpın. Her muhabir için, aşağıdaki çoğaltır kurmak sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabir + özel miRNA. Olmayan bir hedefleme kontrolü için olduğu gibi, aynı zamanda hedef microRNA transfections ayarlayın. <ol start="2"><li> DharmaFECT DUO (Dharmacon) karışımı olarak her transfeksiyon için aşağıdaki Makyaj: </li></ol> Karışım 2 <table border="1"><tbody><tr><td> DharmaFect Duo: </td><td> 0.15 mcL </td></tr><tr><td> Serum ücretsiz medya: </td><td> 9,85 mcL </td></tr></tbody></table> DharmaFECT Duo eklenecek miktar bağımlı hücre hattı olabilir. Yukarıda belirtilen miktarda HT1080 hücreler için uygun. Hücre hattı için uygun miktarını belirlemek için üreticinin belgelerine bakın. İpucu: gazetecilere sayısına göre yukarıdaki miktarlar çarpılarak büyük bir transfeksiyon karışımı olun sayısını çoğaltır ve miRNA'lar sayısı test edilecek. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için miktarı hesaplanırken, hataları ve buharlaşma pipetleme için hesap için ekstra bir miktar eklemeyi unutmayın. <ol start="3"><li> DharmaFECT Duo karışım 5 dakika oda sıcaklığında inkübe izin verin. </li><li> 5 dakika sonra, hazırlanan 10uL plazmid ve / veya miRNA (Karışım 1) her tüp DharmaFECT Duo karışımı (Karışım 2) 10μL ekleyin. Her tüp daha sonra çoğaltmak transfeksiyon başına 20μL hacmi içermelidir. </li><li> Her karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 20 dakika sonra, her tüp çoğaltmak transfeksiyon başına 100μL toplam 80 mcL çoğaltmak için önceden ısıtılmış (37 ° C), antibiyotik içermeyen, tam medya ekleyin. Birçok eş zamanlı olarak çoğaltır ve örnekler hazırlanması için kullanılan derin kuyu blok olabilir. Yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın. </li><li> Inkübatör numaralı seribaşı plaka çıkarın. Hücrelerin en az% 80 konfluent olduğundan emin olun. </li><li> Her kuyudan medya kapalı dikkatlice pipetlemeyin. </li><li> Her iyi transfeksiyon karışımı (20uL DNA / reaktif karışımı + 80uL medya) 100μL ekle. </li><li> Gecede inkübatör yerleştirin plakası. </li></ol> Aşırı inkübe etmeyin. En çok taklit eden 24 saat içinde iyi niyetli hedefleri üzerinde önemli sonuçlar üretecektir. 48 saat ölçülebilir baskı daha büyük olabilir, ama çok iyi değişkenlik iyi olacak. Mimik deneyler inhibitörü deneyler daha kolaydır. En çok taklit eden 24 saat içinde gerçek hedefleri önemli ölçüde bastırmak da inhibitörü ilişkin de baskının önemli ölçülebilir olması için 48 saat alabilir ve hemen hemen her zaman taklit etkisi daha az belirgin olacaktır. 3. Gün Not: Lusiferaz testlerin hemen yapılabilir ya da plakaları -80 dondurulmuş olabilir ° C (donma genellikle hücre lizis ve lusiferaz sinyal artar) . Dondurma ve en iyi sonuç için assaying önce hücreleri Çözülme. LightSwitch Testi Reaktif eklemeden önce oda sıcaklığına kadar donmuş hücreleri çözülme izin UNUTMAYIN. 5. LightSwitch AssayReagents ile ölçün lusiferaz aktivitesini <ol><li> Inkübatör plakasını çıkarın ve oda sıcaklığına getirmek. </li><li> LightSwitch Testi Reaktifler (LS010 kiti için, diğer kiti boyutları protokolleri çevrimiçi bulunabilir) hazırlayın: <ol><li> Liyofilize Testi Yüzey tüp Solvent Yüzey 100μL ekleyerek sulandırın 100X Yüzey ışıktan koruyunuz ve oda sıcaklığında süresini en aza indirmek. 100X Yüzey, 2-3 haftayı-20C saklanabilir . En iyi sonuç için, taze sulandırılmış substrat kullanın. </li><li> Testi Buffer oda sıcaklığında su banyosunda 10 ml şişe çözülme Testi Çözüm hazırlayın ve kullanmadan önce sulandırılmış 100X Yüzey 100μL ekleyin. İyice karıştırın. </li></ol></li><li> Doğrudan beyaz 96-plaka Her numune (100uL hücreleri + medya içeren) 100μL LightSwitch Assay Çözümü (buffer + substrat) eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. Hücreleri başka bir plaka veya cam şişe biçimi, transfer örnekleri yetiştirilen olsaydı 100μL toplam hacmi (medya ya da PBS) beyaz 96 plaka. </li><li> Kapak plakası, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eğer birden fazla plaka assaying, böylece her bir plaka okuma 30 dakika önce kuluçkaya yanı sıra tahlil çözüm bocalama . </li><li> 2 saniye boyunca her bir plaka lumi iyi okuyunnometer (SPECTRAmax L veya muadili). </li><li> (Lüminesans = Belirli miRNA / kontrol dışı hedef), hedefleme kontrolü üzerinde özel miRNA için her bir yapı için lusiferaz sinyal oranını hesaplarken demonte hesaplayın. UTR non-spesifik tedavi etkileri kontrol etmek için temizlik, rastgele ve boş yapıları verileri kullanın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Bir hedefleme miRNA varlığı 3'UTR hedefleri lusiferaz demonte göstermektedir. Let-7a 3'UTR lusiferaz muhabiri faaliyet demonte Işıklı muhabiri okuduktan sonra, 24 saat süreyle inkübe 20nm izin 7a taklit veya hedefleme kontrolü ile inşa HT1080 hücrelerinde her muhabir co-transfecting 100ng tarafından ölçüldü LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanarak sinyal. <img src="/files/ftp_upload/3343/3343fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil 1. Nokt ve ARID3B insan 3'UTRs let-7a microRNA hedeflerdir. Nokt ve ARID3B genlerin insan 3'UTR gazetecilere gelen sinyaller let-7a microRNA varlığı önemli ölçüde yere serdi taklit ederken temizlik ve rasgele sıra sinyalleri UTRs değil.

<ol><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+cancer+connection%3A+the+beginning+of+a+new+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li>
<li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li>
<li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li>
<li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li>
<li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li>
<li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li>
<li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li>
<li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li>
<li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem.+Epub%22%5BJournal%5D)">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Yazarlar bu makalede yer alan araçlar ve reaktifler yapmak Şalt Genomik çalışanları. Bu makalenin Üretim Şalt Genomik sponsor oldu.

Biz, canlı hücreler olarak miRNA 3&#39;UTR etkileşimleri çalışmalarını sağlamak için ön klonlanmış insan 3&#39;UTR-muhabiri yapıları bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. İşte biz lusiferaz muhabiri sistemi kullanarak 3&#39;UTR-muhabirleri ile birlikte transfecting miRNA taklit ve yüksek işlem tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymuştur. Bu yöntem son derece transfectable hücre hattı kullanarak ve bir aşırı ekspresyonu tekniği ile miRNA faaliyet rahatsızlık vermesini araştırmacılar dayanır. Kötü transfectable hücre hatları kullanan araştırmacılar Sigma (Misyon 3&#39;UTR Lenti GoClones) ile birlikte oluşturulan arkadaşı lentiviral 3&#39;UTR muhabiri toplama kullanmayı düşünebilirsiniz. MiRNA ile hücrelerin tedavisinde aşırı ekspresyonu-tipi bir deneyde sonuçlar taklit eder, ve bu tür bir çalışmada, araştırmacılar, şu ya da gerçek fizyolojik şartlar temsil etmemektedir olabilir ki hesaba katması gerekiyor. Aşırı ekspresyonu endişeleri gidermek için, araştırmacılar pertürbasyon 12-14 iki farklı tipleri ile etkileşim çalışması miRNA inhibitörleri taklit için ek olarak kullanabilirsiniz. Bir kez büyük olasılıkla miRNA hedefler belirlenmiştir, araştırmacılar siteler fonksiyonel etkileşim için gerekli olup olmadığını belirlemek için varsayılan miRNA bağlanma yerleri mutagenize isteyebilirsiniz. Ayrıca yüzlerce farklı potansiyel hedef UTRs (Boutz) test büyütmek isteyebilirsiniz. Buna ek olarak, araştırmacılar miRNA transkript istikrar ya da tercüme verimliliği etkileyen olup olmadığını olarak ilgilenen eğer lusiferaz muhabiri verileri önlemleri kararlı durum transkript seviyeleri karşılaştırıldığında olabilir. Orantılı bir değişim transkript düzeyleri ile ilişkili değildir lusiferaz sinyali herhangi bir değişiklik Çeviri verimliliği üzerinde bir etkisi işaret eder. Son olarak, araştırmacıların farklı UTRs göreli hassasiyeti miRNA konsantrasyonu 14 değişikliklere karşılaştırmak için muhabir vektörler bir doz yanıt eğrisi oluşturmak kullanabilirsiniz.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Beyaz Doku Kültürü Levhalar (96 katı alt) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> Kapaklı Clear Doku Kültürü Levhalar (96-well) </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktif </td><td> Şalt </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo Transfeksiyon Reaktif (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> Folyo Plaka Sızdırmazlık Tape </td><td> E &amp; K Bilimsel </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> Nefes Plaka Sızdırmazlık Tape </td><td> E &amp; K Bilimsel </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> Plaka Luminometre </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td> SPECTRAmax L </td></tr></tbody></table>

3&#39;utr muhabiri oluşturur ve bir microrna kullanarak lightswitch lusiferaz test sistemi ile İnsan microrna belirlenmesi hedefler yapışık hücrelere mimik

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNA (miRNA&#39;lar) gen ekspresyonu önemli regülatörleri ve birçok biyolojik süreçlerin bir rol oynayabilir. Her biri benzersiz hedef mRNA&#39;ların yüzlerce kadar olan 700&#39;den fazla insan miRNA&#39;lar şimdiye kadar tespit edilmiştir. Hesaplamalı araçları, ifade ve proteomik Testler ve kromatin-immunoprecipitation tabanlı teknikler belirli bir miRNA doğrudan hedefleri olan mRNA&#39;ların tanımlamak için önemli ipuçları sağlar. Onlar için işlevsel kanıtlar sağlar ve hücre tabanlı bir sistem belirli miRNA 3&#39;UTR etkileşimlerin etkileri Asitli Bunun yanı sıra, 3&#39;UTR muhabir testleri ayrıntılı miRNA hedef çalışmaların önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Kaldıraç 3&#39;UTR muhabiri deneyleri için daha fazla araştırmacılar etkinleştirmek ve ölçek yüksek performans seviyesi testleri desteklemek için, biz, son derece optimize edilmiş LightSwitch Lusiferaz, insan 3&#39;UTR lusiferaz gazetecilere genom bir koleksiyon yarattık Testi Sistemi. Bu sistem aynı zamanda, pozitif kontrol, çeşitli endojen 3&#39;UTR muhabiri yapıları, ve bir dizi standart deney protokolleri olarak kullanmak için sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları içerir. Burada miRNA, verimli, tekrarlanabilir ve yüksek verimlilik analizi için uygun olduğunu taklit ile birlikte tek tek 3&#39;UTR muhabir yapıları co-transfeksiyon için bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA (miRNA&#39;lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

MikroRNA'lar (miRNA'lar), gen ekspresyonunun önemli düzenleyicileridir ve birçok biyolojik süreçte rol oynarlar. 700'den fazla insan miRNA'sı...

Bu prosedürün genel amacı, insan 3' UTR'lerinde öngörülen mikro RNA hedeflerini doğrulamak için reporter konstrüktlarını bir mikro RNA mimiği ile birlikte ko-transfekte etmektir. Bu işlem; öncelikle bir hücre hattının seçilmesi ve deneysel ve kontrol 3' UTR Go Clone reporter konstrüktları ile birlikte mikro RNA mimiklerinin belirlenmesini içeren bir deneysel tasarımın oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, adheran hücreler transfeksiyondan yaklaşık 24 saat önce ekilir. Prosedürün bir sonraki adımı, her bir deneysel veya kontrol 3' UTR Go Clone reporter konstrüktünün bir mikro RNA mimiği veya hedef dışı kontrol ile ko-transfekte edilmesi ve ardından 24 ila 48 saatlik bir inkübasyon sürecidir. Son adım olarak, light switch lüsiferaz assay reaktifi doğrudan hücre ve kültür ortamına eklenir ve lüminesan sinyal bir plat lüminometre ile okunur.Nihayetinde, raporlayıcı assay teknolojisi ile lusiferaz sinyalinin azalmasının ölçümü yoluyla, hangi insan 3' UTR'lerinin belirli bir microRNA'nın hedefi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, canlı hücrelerde öngörülen microRNA 3' UTR hedef etkileşimlerini doğrulamak için fonksiyonel bir assay sağladığından, microRNA araştırmacılarının temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Deneysel tasarım, uygun, yüksek transfeksiyona sahip bir adherent hücre hattının seçimi ile başlar; microRNA mimic bazlı assayler, microRNA'nın endojen ekspresyon seviyelerinin düşük olduğu hücre hatlarında en iyi sonucu verir.Ardından, mikro RNA mimic ve hedef dışı kontrol çiftini seçin; bir hedef dışı kontrolün dahil edilmesi kritiktir çünkü bir plazmid ile küçük bir RNA oligonükleotidinin birlikte transfekte edilmesi, plazmidin tek başına transfekte edilmesine göre daha düşük sinyale yol açar. Sonra, switchgears genom çapındaki koleksiyonundan ön klonlanmış 3' UTR Go Clone reporter konstrüktlerini seçin. Çevrimiçi kataloğa gidin ve UTR arama düğmesine tıklayın.Gen isimleri, gen sembolleri veya erişim numaraları listesi girildikten sonra, arama sonucu vektör ve sekans bilgilerinin yanı sıra envanter durumunu sağlayacaktır. Şimdi kontrol raporlayıcı konstrüktları seçin. Mikro RNA'nın genel hücre sağlığı veya analiz sinyali üzerindeki spesifik olmayan etkilerini kontrol etmek için, housekeeping dizileri veya rastgele fragmanlar gibi, seçilen mikro RNA tarafından hedeflenmesi düşük ihtimal olan 3' UTR içeren kontrol konstrüktlarını tercih edin.Ayrıca, birinci günde düşük pasajlı aderent hücreleri ekin; böylece transfection işleminden 24 saat sonra %80 ila %100 konfluans seviyesine ulaşacaklardır ve mimic aktivitesi için pozitif kontrol olarak sentetik bir mikro RNA hedef raporlayıcısı kullanmayı değerlendirin. İyi sonuçlar elde etmek için yüksek konfluansa sahip hücreler kullanmak temel şarttır. Hücreleri, toplam 100 µL hacimde beyaz bir 96 kuyucuklu doku kültürü plakasına ekin.Paralel olarak. Hücre ekiminden 24 saat sonra, 2. günde, şeffaf bir plakadaki hücrelerin aniden konfluens olup olmadığını uygun sayıda hücre için kontrol edin. Transfeksiyon çözünürlüğü için hazırlık yapın.Reporter konstrüktlerini ve mikro RNA'ları oda sıcaklığında çözdürün. Çözündükten sonra iyice karıştırın ve mikro RNA'ları RNA'sız su ile 2 µM'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltein; plazmid DNA'sı 30 ng/µL konsantrasyonda sunulur ve daha fazla seyrelme gerektirmez. Transfeksiyon karışımını hazırlarken, her bir DNA-RNA kombinasyonunun üç tekrarlı olarak transfekte edilmesi gerektiğini göz önünde bulundurun; hacim, gerçekleştirilecek analiz sayısına göre ölçeklendirilmelidir.Her transfeksiyon için 9.85 µL serumsuz medyum ve 0.15 µL Dharma effect DUO'yu birleştirerek transfeksiyon reaktif karışımını hazırlayın. Karışımın oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilmesini sağlayın. Ardından, 3.33 µL go klon raporlayıcı konstrükt ile istenen nihai konsantrasyona ulaşacak miktarda mikro RNA mimiği birleştirerek her analiz için D-N-A-R-N-A karışımını hazırlayın.Hacmi serumsuz besiyeri ile 10 µL'ye tamamlayın. Ardından, 10 µL transfeksiyon reaktifi karışımını her bir DNA-RNA karışımının 10 µL'si ile birleştirin ve iyice karıştırın. Her bir analiz için final hacmi 20 µL'dir.Kuyucukların üzerini kapatın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir kuyucuk için toplam hacim 100 µL olacak şekilde önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz tam besiyerinden 80 µL ekleyin; bu işlem, analizde 10 ile 15 nM arasında nihai mimik konsantrasyonları ile sonuçlanacaktır.Son adım olarak, hücrelerin ekildiği her kuyucuktaki medyayı dikkatlice uzaklaştırın ve yerine 100 µL uygun nihai transfeksiyon karışımı ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. Karışımların çoğu 24 saat içinde anlamlı sonuçlar verecektir.48 saatlik bir inkübasyon süresi, kuyucuklar arası sinyal varyasyonunun artmasına neden olacaktır. Transfeksiyondan 24 saat sonra, 3. günde light switch lusiferaz assay reaktiflerini kullanarak lusiferaz assay'leri gerçekleştirin; hücreler hemen analiz edilebilir veya -80 °C'de dondurulup daha sonra analiz edilebilir. Dondurma-çözme döngüsünün eklenmesi, hücre lizisinin artmasını ve daha yüksek reporter sinyali elde edilmesini sağlar. Transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu plakayı oda sıcaklığına getiriniz.Ardından, kit talimatlarına göre light switch lusiferaz analiz çözeltisini hazırlayın ve steril bir rezervuara boşaltın. Her bir örneğin kuyucuğuna, beyaz 96 kuyucuklu plakadaki her bir örneğe doğrudan 100 µL light switch analiz çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Plakayı kapatarak ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.Her kuyucuğu bir plak Luminometre ile iki saniye boyunca okuyun. Üç prime UTR Luciferase raporer aktivitesinin let-7a tarafından baskılanması, her bir raporer konstrüktün let-7a mimiği veya hedef dışı kontrol ile birlikte transfekte edildiği HT 1080 hücrelerinde ölçülmüştür. Sonuçları analiz etmek için hedef dışı kontrolden gelen sinyali, her konstrükt için %100 olarak kabul edin.Spesifik mikro RNA mimic'inden gelen sinyali, hedef dışı kontrol sinyaline bölerek yüzde baskılanmayı (knockdown) hesaplayın. Herhangi bir mikro RNA mimic'i, genel hücre canlılığı veya assay sinyali üzerinde spesifik olmayan etkilere sahip olabilir; bu nedenle tüm spesifik olmayan etkileri düzeltin. Deneysel bir UTR hedefi ile gözlemlenen baskılanmayı, burada gösterildiği gibi housekeeping veya rastgele kontrol T ile gözlemlenen baskılanma ile karşılaştırın.PONC ve arid 3B insan 3' UTR bölgeleri, let-7a mikroRNA'larının hedefleridir. PONC ve arid 3B genleri için insan 3' UTR raporlayıcılarından gelen sinyaller, let-7a mikroRNA mimiği varlığında önemli ölçüde azalırken; housekeeping ve rastgele sekans UTR'lerine ait sinyaller azalmamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücrelerde mikroRNA mimikleri ve 3' UTR raporlayıcı konstrüktların başarılı bir ko-transfeksiyonunun nasıl kurulacağı ve sinyal azalmasını ölçmek için lüminometredeki sinyalin nasıl okunacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

identifying-targets-human-micrornas-with-lightswitch-luciferase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

Hücresel süreçlerin bir sistem düzeyinde anlayış elde günümüz hücre biyolojisi bir hedeftir. Burada çeşitli hücresel fonksiyonunun çoklama lusiferaz gazetecilere yönelik stratejiler tarif son noktaları genom ölçekli RNAi kütüphaneleri kullanılarak gen işlevini sorgulamak için.

Kültür Hücreler Kanser ile ilişkili Sinyal İletimi sorgulanması için bir Multiplexed Lusiferaz tabanlı Tarama Platformu

Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Farklılaşmış insan nöral kök hücreleri (hNSC'ler) üzerindeki miRNA'lardaki değişiklikleri karakterize etmek amacıyla, üç boyutlu bir sistemde hNSC farklılaşmasını, miRNA PCR dizisi ile mikroRNA ekspresyonundaki değişikliklerin değerlendirilmesini ve miRNA hedef tahmini için hesaplamalı analizi ve ikili lusiferaz testi ile doğrulanmasını açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

3' çevrilmemiş bölgelerdeki fonksiyonel elementlerin ışıldayan tanımlaması (3'UTR'ler) (3'LIFE), miRNA'lar veya diğer düzenleyici faktörler tarafından 3'UTR'lerdeki fonksiyonel düzenlemeyi tanımlamak için kullanılan bir tekniktir. Bu protokol, fonksiyonel baskılama için yüzlerce varsayılan etkileşimi taramak için 96 oyuklu transfeksiyon ve lusiferaz tahlilleri gibi yüksek verimli metodolojiyi kullanır.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Öğrenin, LightSwitch lusiferaz sistemiyle insan hücrelerinde mikroRNA hedeflerini doğrulama yöntemini. Bu teknik, gen düzenlemesi araştırmalarında 3'UTR etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

3UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik (Video) | JoVE Journal

3'UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Daha fazla video keşfet