Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

Bu prosedürün amacı, etkili in vitro veya in vivo transgen iletimi için rekombinant adeno ilişkili virüsler veya r AAV'ler üretmektir. Bu, ilk olarak HEC 2 93 hücrelerinin, trans geni ve viral genleri kodlayan DNA plazmitleri ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Kesilen hücreler daha sonra kazınır ve bir araya getirilmiş RAAV parçacıklarını hasat etmek için yalan söyler.

Daha sonra, R AAV'ler, heparin kolonu saflaştırması yoluyla hücre lizatından saflaştırılır. Son adım, viral stokları sıkılaştırmaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, immünofloresan mikroskobu yoluyla güçlü ve kalıcı virüs aracılı trans gen ekspresyonunu göstermektedir.

Bu noktada, RA AAV'ler in vitro veya in vivo uygulamalar için hazırdır. Tekniğimizi sezyum klorür gradyan saflaştırması gibi diğer saflaştırma yöntemlerine göre kullanmanın temel avantajı, bir ultrasantrifüj veya toksik malzeme kullanmamıza gerek olmamasıdır. Ayrıca daha yüksek ve saf viral vektörler elde ediyoruz.

Bu protokolün başlamasından önce, yüksek kaliteli plazmid, DNA stokları hazırlayın ve yazılı protokolde açıklandığı gibi bütünlük için çığlık atın. Başlamak için, ikinci plaka% 80 COFLUENT 150 santimetre kare HEC 2 9 3 hücre şişeleri beş adet 15 santimetre çapında NOC doku kültürü kaplarına, kültür hücrelerine. %10 fetal buzağı serumu içeren düşük glukozlu standart DMEM'de, transfeksiyon gününde hücrelerin transfeksiyondan üç saat önce %70 ila 80 oranında birleşmesi gerekir.

DMEM'i çıkarın ve buz koyunun modifiye edilmiş dobe CHO'S ortamı veya %5 fetal buzağı serumu içeren IMDM ile değiştirin. Transfeksiyon karışımını, yazılı protokolde belirtildiği gibi tek bir virüs partisi için hazırlayın: İkinci sınıf bir doku kültürü davlumbazında, steril bir şekilde, transfeksiyon karışımını 50 mililitrelik bir tüpe süzün, çözeltiyi hızlı bir şekilde girdaplarken, iki kez yığın halinde 13 mililitre ekleyin. Tuzlu su tamponlamış.

50 mililitrelik tüpün kapağını yerine takın ve 15 saniye boyunca girdap yapmaya devam edin. Bir dakika 45 saniye bekletin. Beyaz bir çökelti oluşmalıdır: Her 15 santimetrelik doku kültürü kabına yavaşça beş mililitre transfeksiyon çözeltisi ekleyin.

16 saat inkübe ettikten sonra karıştırmak için plakaları döndürün. IMDM'yi çıkarın, DMEM ile değiştirin ve hücreleri inkübe etmeye devam edin. R AAV'leri hasat etmek için.

Ortamı hücre kültürü plakalarından çıkarın. Transfeksiyondan 72 saat sonra ve atma işlemi her zaman Vercon solüsyonu veya başka bir uygun dezenfektan ile tedavi edilmelidir. Hücreleri ılık bir kez fosfat tamponlu tuzlu su içinde nazikçe yıkayın.

Her plakaya 25 mililitre ılık PBS ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile nazikçe çıkarın. Süspansiyonu 50 mililitrelik tüplerde topladıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 800 kez G'de peletleyin. Supinatı atın ve peleti yeniden askıya alın.

Doku kültürü plakası başına 10 mililitre 150 milimolar sodyum klorür tamponunda, süspansiyonu iki adet 50 mililitrelik tüpe bölün. Daha sonra taze hazırlanmış %10 Sodyum deoksi kaplama çözeltisi içeren hücreler bulunur. Daha sonra nükleik asitlerin uzaklaştırılması için benzoat nükleaz ekleyin.

Tüpleri karıştırdıktan sonra, bir saat boyunca 37 santigrat derece inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, 15 dakika boyunca 3000 kez G'de santrifüjleme ile hücresel kalıntıları çıkarın. Supinatı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve heparinin tıkanmasını önlemek için tüm hücre kalıntılarının çıkarıldığından emin olun.

r AAV'lerin saflaştırılması için sütunlar. Bir şırıngaya 10 mililitrelik bir sodyum klorür tamponu ve peristaltik bir pompa kullanarak yüksek tuzak heparin kolonlarını ayarlayın, böylece çözeltiler kolondan dakikada bir mililitre hızla akar. Heparin kolonuna hava kabarcığı girmediğinden emin olmak önemlidir.

Kolonu 10 mililitre 150 milimolar sodyum klorür tamponu ile dengeleyin. Sütuna 50 mililitre virüs çözeltisi uygulayın ve çözeltinin akmasına izin verin. Daha sonra sütunu 20 mililitre 100 milimolar sodyum klorür tamponu ile yıkayın.

Beş mililitrelik bir şırınga kullanarak. Sütunu bir mililitre 20 milimolar sodyum klorür tamponu ve ardından bir mililitre 300 milimolar tampon ile yıkamaya devam edin. Akışı atmak.

Artan yüksek sürtünme tamponları uygulayarak virüsü kolondan çıkarmak için beş mililitrelik şırınga ve hafif basınç uygulayın. Elüatı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Vektörü, 100.000 moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip AmCon Ultra dört santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin.

Yoğunlaştırıcıya dört mililitre kolon elüatı yükleyin ve iki dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi tekrarladıktan sonra, konsantre hacim yaklaşık 250 mikrolitre olmalıdır. Akışı atın ve yoğunlaştırıcıyı kalan virüs çözeltisiyle yeniden yükleyin.

500 mikrolitrelik son hacim için virüse 250 mikrolitre PBS ekleyin ve yoğunlaştırıcıdan çıkarın. Son adım olarak, stok virüsünü daha sıkı hale getirmek için vektörü 13 milimetre çapında 0,2 mikron şırınga filtresinden süzün. HEC 2 9 3 hücrelerini, Cree'ye bağımlı R AAV'lerin titrasyonu için %40 ila 50 oranında uyumlu olacak şekilde tohumlayarak 18 poliol lizin kaplı cam örtü fişi hazırlayın.

Cree rekombinazı kararlı bir şekilde eksprese eden HEC 2 9 3 hücrelerini kullanın. 72 saat sonra seyreltme başına üç kuyucuk kullanarak yazılı protokolde tarif edildiği gibi RAAV vektörünün seri seyreltilmesi ile her bir oyuğu enfekte edin, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ortama eşit hacimde% 4 kuvvette formaldehit ekleyerek HEC 2 9 3 hücrelerini sabitleyin, hücreleri PBS'de üç kez ve bir kez damıtılmış su ile durulayın. Ardından montaj ortamını kullanarak kapak fişlerini kızakların üzerine yerleştirin.

Hücre tarafı aşağı. En yüksek seyreltme faktörüne sahip olan ancak yine de enfekte hücreler içeren üç kuyudan hendekli hücrelerin sayısını sayın. Bunların ortalamasını bulun ve mikrolitre başına bulaşıcı birim sayısını vermek için seyreltme faktörü ile çarpın HEC 2 9 3 virüsü ile transdüksiyona tabi tutulmuş gelişmiş yeşil floresan proteini ile gösterilmiştir.

Mikrolitre başına yaklaşık altı kez 10 ila altı bulaşıcı partikül arasında tutarlı titreler genellikle elde edilir. Burada, yetişkin par albümin Cree transgenik farelerinin farklı beyin bölgelerine yeşil floresan proteini kodlayan Cree'ye bağımlı R AAV'lerin stereotaksik enjeksiyonlarının örnekleri gösterilmektedir. Viral yeşil floresan protein ekspresyonu, farklı hedef bölgelerdeki Cree eksprese eden nöronlarla sınırlıdır.

Bu örnekte, retiküler talamus ve globus palus, dentat girus ve hipokampusun bir bölgesinde yeşil floresan protein immünoreaktivitesi gösterilmiştir. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa virüs üretimi için yedi ila sekiz gün ve titreme için üç gün içinde gerçekleştirilebilir.