Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki aşamalı bir afinite saflaştırma prosedürü ile oldukça saf rekombinant proteinler üretmektir. Bunu başarmak için, bir albümin bağlama domainine dayalı bispesifik bir saflaştırma etiketi, ilgilenilen geni içeren bir ekspresyon vektörüne klonlanır ve ardından füzyon proteininin e coli içinde ekspresyonu gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hedef proteini içeren bakteriyel lizat, immobilize insan serum albümini veya HSA içeren bir kromatografi kolonunda saflaştırmaya tabi tutulur.

Bunu, stafilokokal protein A'dan türetilmiş immobilize Z alanını içeren bir MAB select superior resistance veya sure kolonunda gerçekleştirilen ek bir saflaştırma işlemi takip eder. Bu işlem, zorlayıcı uygulamalar için uygun olan yüksek saflıkta bir ürünle sonuçlanır. Ardından, hedeflenen proteinin başarıyla homojenliğe ulaşacak şekilde saflaştırıldığından emin olmak için saflık, SDS page ve gerekirse kütle spektrometrisi ile değerlendirilir; sonuçlar, bu protokolde kullanılan yeni bispesifik saflaştırma etiketi ile tek bir adıma kıyasla, birbirini izleyen iki adımdan sonra etkin bir saflaştırma olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, tek adımlı afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hedef proteinin özelliklerinden bağımsız olarak, yalnızca tek bir afinite kolu kullanan basit bir protokol ile saf protein elde edilebilmesidir.

Bu yöntem, çok çeşitli özelliklere sahip proteinler için kullanılabilir. Ayrıca, etiket çok küçük olduğu için bakteriyel konak tarafından kolayca üretilir. Genel olarak, bu saflaştırma prosedüründe yeni olan kişiler, yöntemi oldukça basit ve anlaşılır bulacaktır.

Kritik bir adım, örneğinizi ikinci kolona yüklemeden önce pH değerini ayarlamaktır. Streptokok protein G'den türetilen mevcut bir albümin bağlanma alanına ek bir bağlanma bölgesi dahil edilerek, iki doğal afiniteye sahip küçük bir saflaştırma etiketi geliştirilmiştir. 46 amino asitlik albümin bağlanma alanı, stabil bir üçlü heliks demeti şeklinde katlanır ve temel olarak ikinci heliks üzerinde yer alan, insan serum albümini için bir bağlanma bölgesi içerir; birinci ve üçüncü helikste bulunan 11 yüzey açık amino asidin genetik olarak rastgeleleştirilmesiyle yeni bağlanma yüzeyleri mühendisliği yapılmıştır. Kombinatoryal kütüphanenin faj üzerinde eksprese edilmesiyle, stafilokok protein A'dan türetilen bir Z domainine karşı gerçekleştirilen birkaç tur biyopanning, hem HSA'ya hem de Z domainine afinite gösteren A BDZ one olarak adlandırılan bispesifik bir molekülle sonuçlanmıştır. Bispesifik füzyon etiketi ekspresyon plazmidini hazırlamak için, uygun restriksiyon bölgeleriyle çevrelenmiş A BDZ one geni PCR fragmanlarını hazırlayın ve ekspresyon plazmidindeki hedef genin uçlarını kesin; A BDZ one PCR fragmanlarını ve ilgi duyulan geni içeren saflaştırılmış ekspresyon vektörünü, uygun bir reaksiyon tamponunda seçilen restriksiyon enzimleri ile kesin. Ligasyondan önce ürünleri saflaştırın.

Ardından, kısıtlanmış A BDZ bir fragmanını, ilgilenilen geni içeren ekspresyon vektörüne ligaze edin ve ligasyon ürününü e coli'ye transforme edin. Transforme edilmiş hücreleri, seleksiyon için uygun antibiyotiklerle desteklenmiş agar plaklarına yayın. Birkaç koloniyi PCR ile tarayın ve sonuçta oluşan ekspresyon kasetini DNA dizileme yoluyla doğrulayın.

Son olarak, hedef proteini eksprese etmek için dizisi doğrulanmış bir koloninin gece boyu süren kültüründen plazmidi hazırlayın ve bunu tercih edilen ekspresyon suşuna transforme edin. Uç kısmına yeni etiket eklenmiş olan protein için, önce tek bir bakteri kolonisini, litre başına beş gram maya özütü ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mililitre triptik soya suyuna inoküle edin; 150 RPM ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu süren kültürden bir mililitreyi 100 mililitre taze besiyerine inoküle edin ve protein ekspresyonunu indükleyin.

Hücreler logaritmik büyüme evresine ulaştığında, protein indüksiyonundan sonra hücreleri 150 RPM ve 25 °C'de gece boyunca inkübe edin, ertesi gün hücreleri santrifüj ile hasat edin; A BDZ one füzyon proteininin ortogonal afinite saflaştırması, immobilize HSA veya zoma içeren bir kolon üzerindeki ilk saflaştırma yoluyla gerçekleştirilir. Ardından, bispesifik etiketin ikinci afinitesi kullanılarak ardışık bir saflaştırma adımı uygulanır.

MA select sure gibi Z domeninin immobilize edildiği kromatografik ortamlar, antikorların saflaştırılması için kolayca temin edilebilir. Öte yandan HSA, ortogonal afinite saflaştırmasına devam etmek için ikinci bir matris sağlamak amacıyla ortamla kimyasal olarak eşlenebilir. Pelletlemiş örnekleri 25 mililitre yürütme tamponunda resüspande edin. Ardından hücreleri %60 genlikte ve bir saniyelik darbeler ile bunu takip eden bir saniyelik duraklamalar şeklinde, toplam üç dakika boyunca sonikasyonla parçalayın.

Örneği santrifüj ettikten sonra, hedef protein içeren süpernatantı daha ileri saflaştırma işleminden önce 0.45 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından, uygun bir protein saflaştırma sisteminde, bir mililitrelik bir HSA spheros kolonunu veya HSA ile eşleştirilmiş bir NHS aktive kolonunu, dakikada bir mililitre hızında 10 kolon hacmi çalışma tamponu ile dengeleyin. Dengeleme tamamlandığında, bakteriyel lizatı dakikada 0,5 mililitre hızla yükleyin, akış hızını tekrar dakikada bir mililitreye ayarlayın ve kolonu beş kolon hacmi çalışma tamponu, ardından beş kolon hacmi yıkama tamponu ile yıkayın.

Örneği, dakikada 1 mL hızında elüsyon tamponu ile elüe edin ve fraksiyonları toplayın. Elüe olan pikten fraksiyonları seçmek için 280 nanometredeki absorbsiyonu izleyin. Daha ileri saflaştırma için, en yüksek protein konsantrasyonuna sahip fraksiyonları birleştirin, ardından iki kat seyreltin.

Çalışma tamponunun hazır olduğundan ve pH değerinin nötr civarında olduğundan emin olun. Bu adım, proteinin Z domenine bağlanması için kritiktir. Gerekiyorsa, pH'ı yükseltmek için bir molar tris HCL pH sekiz ekleyin.

Ardından, örneği dakikada 0.5 mililitre hızla, sure çalışma tamponu ile dengelenmiş bir mililitrelik yüksek tuzak MA sure kolonuna yükleyin. Akış hızı dakikada bir mililitreye yeniden ayarlandıktan sonra, kolon beş kolon hacmi sure çalışma tamponu ile yıkanır. Daha sonra, hassas hedef proteinler için proteinleri 0.2 molar asetik asit pH 2.7 ile elüe edin.

EIT, toplama işlemi sırasında T tris eklenerek doğrudan nötralize edilebilir. Protein saflığını değerlendirmek için H-C-L-S-D-S sayfası kullanılabilir. A BDZ birindeki serbest bir sistein, indirgen olmayan koşullar altında ürünün dimerizasyonuna neden olabileceği için numunenin tamamen indirgenmesi önemlidir.

Son adım olarak, saflaştırılmış ürünün moleküler ağırlığı, bir HSA kolonu ve ardından bir MA select sure kolonu kullanılarak uygulanan ortogonal protokol ile saflaştırmanın ardından kütle spektrometrisi ile analiz edilebilir. Çeşitli saflaştırma noktalarında toplanan farklı örnekler SDS page ile analiz edilmiştir. Örnekler arasında A BDZ one tag'in kendisinin yanı sıra; farklı çözünürlük sınıflarını, moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktaları temsil eden, AB DZ one ile füzyonlanmış üç farklı insan hedef proteini yer almıştır.

Bir ile dört arasındaki şeritler, üç farklı AB DZ one füzyon proteini ve AB DZ one etiketinin kendisi için saflaştırma öncesindeki protein lizatlarını göstermektedir. Beş ile sekiz arasındaki şeritler, proteinlerin HSA saflaştırma basamağından elde edilen sonuçları göstermektedir. Son olarak, dokuz ile 12 arasındaki şeritler, final mAbs select Sure saflaştırma basamağından elde edilmiştir.

Ek olarak, aynı kolonlar üzerinde ters sırada saflaştırılan aynı lizatlardan elde edilen örnekler burada analiz edilmiştir. Bir ile üç arasındaki şeritler saflaştırma öncesindeki lizatları gösterirken, dört ile altı arasındaki şeritler MAB Select Sure kolonundaki ilk saflaştırma adımından sonra alınmıştır. Yedi ile dokuz arasındaki şeritlerdeki yüksek saflıktaki ürünler, final HSA saflaştırmasının sonucudur.

Sonuçlar, çift etiket kullanımının ve iki yüksek özgünlükteki saflaştırma adımının faydasını açıkça göstermektedir. Jellerden görülebileceği üzere, ilk saflaştırma adımından sonra makul bir saflık elde edilse de, takip eden adım, oldukça talepkar uygulamalar için çok uygun olan çok saf bir ürün sağlamaktadır. Bu yöntemin merkezinde yer alan saflaştırma adımı bir kez kavrandığında, birçok farklı uygulama için uygun, yüksek saflıkta bir rekombinant protein elde etmek amacıyla tek bir kişi tarafından birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir.

Örneğin, bu prosedürün ardından saflaştırılmış biyomoleküller, bir kompleksin bağlanma gücü gibi soruları yanıtlamak amacıyla etkileşim çalışmaları gibi diğer uygulamalarda kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu çift afinite etiketi kullanarak nasıl gerçekten saf bir protein ürünü elde edileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.