Name: Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin, rekombinant proteinleri iki adımlı afinite kromatografisi ile saflaştırma yöntemini. Küçük bispecifik etiket kullanarak yüksek saflıkta protein elde edin ve çeşitli uygulamalar için kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Knut ve Alice Wallenberg Vakfı ve İsveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

1. Klonlama inşa hedef gene/ABDz1-tagged füzyon <ol><li> Ifade plazmid hedef gen (plazmid içeren ABDz1 bir malzeme transferi anlaşması üzerinden serbestçe kullanılabilir) N-terminal ligasyonu için uygun kısıtlama siteleri tarafından çevrili ABDz1 geninin PCR parçaları hazırlayın. </li><li> Cleave saflaştırılmış ifade vektör ve uygun bir reaksiyon tamponu seçilen restriksiyon enzimleri ile PCR parçaları. Ligasyonu önce ürünleri arındırın. </li><li> , Ilgi gen içeren ekspresyon vektörü sınırlı ABDz1 parçası bağlanır ve E. ligasyonu ürün dönüşümü coli (orijinal yöntem RR1ΔM15 zorlanma 8 kullanılmıştır). Seçim için uygun antibiyotikler ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri yayılmıştır. </li><li> PCR ekran birkaç koloni ve sıra DNA dizi analizi ile ortaya çıkan ifade kaset doğrulayın. </li><li> Bir gecede bir dizi verif kültürü plazmid hazırlayınIED koloni ve tercih edilen bir ifade suşu (Rosetta insan genleri tarafından kodlanan proteinlerin üretimini artırmak için plazmid bir pRARE barındıran özgün yöntemi E. coli (de3) kullanılmıştır) dönüşüm . </li></ol> 2. Protein ekspresyonu <ol><li> Tek bir bakteri kolonisi, 5 g / l maya özü ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş triptik soy broth 10 ml inoküle edin. ° C gecede 37 150 rpm'de inkübe edin. </li><li> 1 ml, 100 ml taze orta gecede kültür aşılamak ve hücrelerin logaritmik büyüme fazı ulaştığınızda protein ekspresyonu (lac operonunun kullanılan izopropil-β-D-thiogalactoside başlangıçta 1 mM) neden. </li><li> 150 rpm'de 25 ° C gecelik ve hasat hücreler santrifüj tarafından inkübe edin. </li></ol> 3. Ortogonal yakınlık arıtma <ol><li> 25 ml çalıştıran tamponu (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 (w / v) Tween 20, pH 8.0) pelletini tekrar ve th bozabilir% 60 genlik ve 3 dakika 1.0/1.0 bakliyat sonication e hücreleri. Örnek Santrifüj ve supernatant (0,45 mikron) ve daha ileri saflaştırma önce hedef protein içeren filtre. </li><li> 1 ml / dak 'da uygun bir protein arıtma sistemi tampon çalışan 10 sütun hacimleri (CV) ile tedarikçi tavsiyelerine göre daha önce HSA ile birleştiğinde ya da 1 ml HSA sepharose kolon veya NHS aktif sütun, muvazene. 0.5 ml / dak bakteriyel lizat yükleyin ve sonra akış hızı 1 ml / dak sıfırlanır. </li><li> 5 yıkama tampon CV (5 mM NH 4 Ac, pH 5.5) takip çalışan tampon CV ile 5 sütun yıkayın. </li><li> 1 ml / dak elüsyon tamponunda (0.5 M HAC, pH 2.5) ile örnek Zehir ve daha ileri saflaştırma için yıkandı, zirveden kesirler seçmek için 280 nm, monitör emme kesirleri toplamak. </li><li> Yüksek protein konsantrasyonu Havuz kesirler, Sure çalışan tampon iki kez seyreltilmiş (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7.2) vepH yaklaşık nötr olduğundan emin olun. Gerekirse pH artırmak için 1 M Tris-HCl, pH 8 ekleyin. </li><li> 0.5 ml / dk, 1 ml / dak Sure çalışan bir tampon 10 CV ile dengelenmiş bir 1 ml HiTrap MabSelect Sure sütun örnek yükleyin. Yükledikten sonra 1 ml / dak akış hızı sıfırlayın. </li><li> Tabii çalışan tampon 5 CV (adım 5) sütun yıkayın ve 0.2 M HAC, pH 2.7 ile proteinlerin Zehir. Hassas hedef proteinlerin eluat toplama üzerine Tris-HCl ilavesi ile doğrudan nötralize edilebilir. </li></ol> Kromatografik adımlar MabSelect eluat tersine çevrilirse Sure sütun tampon (adım 3.1) çalışan seyreltilir ve 1 M Tris-HCl ilave edilerek pH yaklaşık 8 artış olabilir. Emin matris ikinci adımı istihdam Genel olarak, dar doruklarına görülmektedir. 4. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflık Değerlendirme <ol><li> Yük bir saflaştırılmış fraksiyonlarıeğer istenirse, kütle spektrometresi ile analiz arındırılmış ürün molekül ağırlığı, SDS-PAGE azaltılması ve. ABDz1 ücretsiz bir sistein düşürücü olmayan koşullar altında ürün dimerization neden olabilir bu yana tam örnek azaltmak için önemlidir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Ilkesinin bir kanıtı olarak, dik yakınlık arıtma ABDz1 etiketi ile kolaylaştırdı farklı çözünürlük sınıfları, moleküler ağırlık ve izoelektrik noktaları (Tablo 1) temsil eden üç insan hedef proteinlerin değerlendirildi. ABDz1 gen, genetik, hedef genlerin erimiş ve yapıları E. coli ifade edildi, Şekil 2 ardışık yöntemi tüm adımlar için bir akış şeması gösterir. Dik protokolü tarafından arıtma ardından, farklı noktalarda toplanan numuneler, SDS-PAGE (Şekil 3) ile analiz edildi. Sonuçları bir çift etiket ve iki son derece özel bir arıtma adımları yararını açıkça göstermektedir. Makul bir saflık ac olsa bilehieved jeller görüldüğü gibi ilk arıtma adımdan sonra, ardışık adım de son derece zorlu uygulamalar için uygun, çok saf bir ürün elde edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bispecific ABDz1 etiketi seçimi için kullanılan Kombinatoryal kütüphane tasarımı. 46 amino asit albümin bağlayıcı etki alanı istikrarlı bir üç sarmal paket içine kıvrım ve özellikle ikinci sarmal bulunan insan serum albümin için bağlayıcı bir site içerir. Genetik on birinci ve üçüncü sarmal bulunan yüzey maruz kalan amino asitler rastgele olarak, yeni bir bağlayıcı yüzey mühendisliği oldu. Onbir pozisyonları rakam gösterilir ve Kraulis ve ark göre numaralandırılmıştır. [9 ]. Faj üzerinde ifade Kombinatoryal kütüphanesi ile, bispecific ABDz1 molekül tespit edildi Stafilokokal protein Z etki alanı bir dimer karşı biopanning ardından. <img alt='"Şekil' src='"/' files> Şekil 2. dik benzeşme arıtma protokolü için basitleştirilmiş akış şeması. ABDz1 dizisi içeren bir PCR-parçası, uygun bir ifade vektör ilgi bir gen ile (N-terminal) bağlandı. Ligasyonu ürün E. dönüştürülmüştür. sıra doğrulama ve plazmid hazırlık için coli. Bir ifadesi ev sahibi dönüşümün ardından, rekombinant protein ekspresyonu için büyük ölçekli bir kültür, bir ilk gecede kültür kurulur. Bakteriler santrifüj yoluyla, hedef protein içeren bakteriyel lizat üretmek için hasat ve sonication tarafından parçalanmış. Artık katı parçacıklar kaldırmak için bir filtrasyon adımdan sonra art arda iki arıtma adımları geçiren lizat bir sıvı taşıma sistemi dik yakınlık arıtma tabi tutulur. Yıkandı, hem de arıtma adımları doruklarına örneklenmiş ve saflık değerlendirmek için SDS-PAGE tarafından değerlendirilir ve t karşılaştırıldığındao arıtma önce lizat. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. füzyon ifade ABDz1 ile saflaştırılmış hedef proteinleri SDS-PAGE analizi. Sure-sütun MabSelect tarafından izlenen bir HSA-sütun üzerinde arıtma karşılık gelen doruklarına örnekler, farklı özellikler gösteren ABDz1, ABDz1 Etiketin kendisi için füzyon ifade üç proteinlerin bakteriyel lizat alınan numuneler ile bir araya toplanmıştır (A) . Lanes 1-4 9-12 MabSelect Sure arıtma (ikinci adım) arıtma, HSA arıtma şerit 5-8 (ilk adım) ve şerit önce lizatları örnekler temsil eder. ABDz1-141.377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ve ABDz1: Örnekler aşağıdaki sırayla yüklenir. (B) yanı sıra, aynı sütun üzerinde tersten saflaştırılmış aynı lizatları elde örnekleri incelendi. Lanes arıtma, şerit 4-6 f önce lizatları örnekleri temsil 1-3rom MabSelect emin arıtma (ilk adım) ve HSA arıtma (ikinci adım) şerit 7-9. Örnekleri (A), ancak etiket kendisi dahil değildir olarak aynı sırayla yüklendi. Bu sonuçlardan yola çıkarak bu iki adımlı bir yöntem adımları sırayla uygulanır bakılmaksızın yüksek derecede saflaştırılmış protein verir açıktır. <table border="1"><tbody><tr><td> Adı b </td><td> Hedef protein Uniprot c </td><td> Moleküler ağırlık (kDa) </td><td> Çözünürlük sınıf d </td><td> Molekül ağırlığı füzyon ürünü (kDa) </td><td> Izoelektrik nokta füzyon ürün </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Yalnız ABDz1 etiketi Molekül ağırlığı 6.3 kDa, izoelektrik noktası 6.7. </li><li> Hedef protein, Uniprot protein bir kısmını temsil eder. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> N-terminal protein parçası Onun 6 ABP 10 Çözünürlüğü sınıfı. </li></ol> Tablo 1. ABDz1 etiketi ile hedef proteinler ve füzyon ürünleri bir ilke çalışmanın bir kanıtı olarak değerlendirilir. Üç farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik noktası eşsiz insan proteinleri dik benzeşme yaklaşımı ile ifade ve saflaştırılması için seçilmiştir.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan dik benzeşme arıtma protokolü hedef proteinlerin geniş bir yelpazede etkili arınma sağlar. Bağlayıcı bir roman yüzeyi ile albümin bağlayıcı etki doğasında bağlayıcı site birleştirerek, küçük bir bispecific protein etiketi geliştirilmiştir. Bu, sadece herhangi bir tercih ifade vektör ilgi herhangi bir protein klonlanmış ve füzyon ifade beri etiket kullanmak için çok basittir. Çoğu laboratuvarlarda kullanılabilir Standart donanım, iki adımlı bir protein saflaştırılması için istihdam edilebilir. ABDz1 etiketi etki alanı verimli bir şekilde iki bağlayıcı yüzeyler ortaya çıkarmak için doğru katlama fonksiyonu bağlı olduğundan, bu yöntem çözünür şeklinde ifade proteinler sınırlı ve denatüre koşulları altında saflaştırılması için uygun değildir. Indirgeyici ajanlar, MabSelect emin bir matris üzerine Z-etki alanına ABDz1 bağlama ile müdahale yılından bu yana da kaçınılmalıdır. Ortogonal afinite purificaTION birçok zorlu uygulamalar proteinlerin yüksek oranda saflaştırılmış gereksinimlerini karşılamak için geleneksel yöntemlere bir alternatif sağlar. Bu yöntem aynı zamanda, farklı saflaştırma stratejileri arkaya kullanılan Kombinatoryal etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Yerli bir hedef protein gerektiren uygulamalar için, mümkün ABDz1 etiketi 11 enzimatik kaldırılmasını işlemek için proteaz bölünme sitesi tanıtıldı olabilir. Ayrıca, bugüne kadar açıklanan ilk bispecific küçük ve katlanmış protein etki alanı ABDz1 etiketi. Iki hedef özel yakınlık etkileşimleri bağlıdır arıtma stratejisi sağlar çünkü benzersizdir. Geleceğe hazır ve ucuz kromatografik reçine ile uyumlu olan yeni bağlayıcı yüzeyler taşıyan roman bispecific etiketleri gelişmekte olan bu konsepti genişletmek için ilginç olacaktır. Örneğin, temel kalıntıları, bir etiketi i ile uyumlu amino asitler albümin bağlayıcı bir yer değiştirerekdeğiştirici kromatografi ulaşılabilir olabilir. Benzer bir kavram, sırasıyla, Z asit 12 ve Z temel 13 anyon ve katyon değişim ile uyumlu olarak bilinen etiketleri oluşturmak için Z-etki sorumlu mühendislik etkili olduğu kanıtlanmıştır .

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> Rosetta E. coli (de3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Triptik soy broth </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Maya özü </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Titreşim hücre sonikatör </td><td> Sonics ve malzeme </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Eski ürün </td></tr><tr><td> Tabii HiTrap MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HiTrap NHS aktive HP sütun </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

küçük bispecific affinity tag kolaylaştırılmış ortogonal protein saflaştırma

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Protokolleri rasyonalize gerekir rekombinant proteinlerin saflaştırılması ile ilgili yüksek maliyetler nedeniyle. Yüksek verimli çalışmalar için hedef protein özel optimizasyon 1 gerekmez genel yöntemler için bir talep vardır. Bunu başarmak için, genetik ilgi gen erimiş olabilir arıtma etiketleri genellikle 2 kullanılır. En yaygın olarak kullanılan bir yakınlık kolu hexa-histidin etiketi, yerli ve denatüre edici koşullar 3 hem de altında arıtma için uygundur . Etiketiyle üretimi için metabolik yükünün düşük, ama rakip afinite kromatografisi dayalı stratejiler 1,2 gibi yüksek bir özgüllük olarak sağlamaz . Burada, 46 amino asit iki farklı bağlanma yerleri ile bispecific arıtma etiketi, küçük protein etki alanı olmuştur. Albümin bağlayıcı etki alanı Streptokoksik protein G türetilmiştir ve insan serum albümin güçlü bir doğal yakınlığına sahiptir.Kalkış Desteği (HSA). Onbir yüzey maruz albümin bağlayıcı 4 ilgisi olmayan amino asitler, kombinatoryal bir kütüphane üretmek için genetik olarak randomize edildi . Rastgele bağlayıcı yüzey (Şekil 1) düzenlenen romanı ile protein kütüphane faj ekran teknolojisi bağlayıcı seçimi kolaylaştırmak için faj partikülleri ifade edildi. Dimerik karşı biopanning birkaç tur sayesinde Z Stafilokokal protein A 5, HSA ve roman hedef 6 tespit edildi hem yakınlığa sahip küçük bir bispecific molekül türetilmiş etki alanı. ABDz1 olarak anılacaktır roman protein etki, farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik nokta ile hedef proteinlerin bir seçim için bir arınma etiketi olarak değerlendirildi. Üç hedef proteinlere Escherishia coli K-Termini erimiş ve daha sonra afinite saflaştırılmış roman etiketiyle ifade edildi. Immobilize HSA veya Z-etki alanı ya da bir sütun ilk arıtma ilişkiler sonuçlandıvely saf ürünler. Bispecific etiketi ile iki adım yakınlık arıtma protein saflık önemli bir iyileşme sonuçlandı. Kromatografik Z-alanıyla medya, Sure örnek MabSelect, immobilize antikor saflaştırılması için hazır ve HSA kolayca kimyasal ikinci matris sağlamak için medya birleştiğinde olabilir. Kurtarılan hedef proteinin saflığı yüksek bir talep olduğunda bu yöntem özellikle avantajlıdır. Ifade ev sahibi metabolik yük etiketiyle küçük boyutu nedeniyle sınırlı iken etiketi bifunctionality iki farklı kromatografik adımları kullanılmasına izin verir. Birden fazla etiket kombinasyonu 1,7 kullanılır Kombinatoryal etiketleme denilen rekabetçi bir alternatif sunuyor.

Yeni ve son derece verimli, iki kademeli afinite kromatografisi protokolü geliştirildi ve ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yöntem iki içsel yakınlık küçük bir arıtma etiketi dayanan ve farklı özelliklere sahip geniş bir hedef proteinlerin uygulanabilir.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Rekombinant proteinlerin saflaştırılmasıyla ilişkili yüksek maliyetler nedeniyle protokollerin rasyonelleştirilmesi gerekmektedir. Yüksek kapasiteli çalışmalar için bir ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki aşamalı bir afinite saflaştırma prosedürü ile oldukça saf rekombinant proteinler üretmektir. Bunu başarmak için, bir albümin bağlama domainine dayalı bispesifik bir saflaştırma etiketi, ilgilenilen geni içeren bir ekspresyon vektörüne klonlanır ve ardından füzyon proteininin e coli içinde ekspresyonu gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, hedef proteini içeren bakteriyel lizat, immobilize insan serum albümini veya HSA içeren bir kromatografi kolonunda saflaştırmaya tabi tutulur.Bunu, stafilokokal protein A'dan türetilmiş immobilize Z alanını içeren bir MAB select superior resistance veya sure kolonunda gerçekleştirilen ek bir saflaştırma işlemi takip eder. Bu işlem, zorlayıcı uygulamalar için uygun olan yüksek saflıkta bir ürünle sonuçlanır. Ardından, hedeflenen proteinin başarıyla homojenliğe ulaşacak şekilde saflaştırıldığından emin olmak için saflık, SDS page ve gerekirse kütle spektrometrisi ile değerlendirilir; sonuçlar, bu protokolde kullanılan yeni bispesifik saflaştırma etiketi ile tek bir adıma kıyasla, birbirini izleyen iki adımdan sonra etkin bir saflaştırma olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, tek adımlı afinite saflaştırması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hedef proteinin özelliklerinden bağımsız olarak, yalnızca tek bir afinite kolu kullanan basit bir protokol ile saf protein elde edilebilmesidir.Bu yöntem, çok çeşitli özelliklere sahip proteinler için kullanılabilir. Ayrıca, etiket çok küçük olduğu için bakteriyel konak tarafından kolayca üretilir. Genel olarak, bu saflaştırma prosedüründe yeni olan kişiler, yöntemi oldukça basit ve anlaşılır bulacaktır.Kritik bir adım, örneğinizi ikinci kolona yüklemeden önce pH değerini ayarlamaktır. Streptokok protein G'den türetilen mevcut bir albümin bağlanma alanına ek bir bağlanma bölgesi dahil edilerek, iki doğal afiniteye sahip küçük bir saflaştırma etiketi geliştirilmiştir. 46 amino asitlik albümin bağlanma alanı, stabil bir üçlü heliks demeti şeklinde katlanır ve temel olarak ikinci heliks üzerinde yer alan, insan serum albümini için bir bağlanma bölgesi içerir; birinci ve üçüncü helikste bulunan 11 yüzey açık amino asidin genetik olarak rastgeleleştirilmesiyle yeni bağlanma yüzeyleri mühendisliği yapılmıştır. Kombinatoryal kütüphanenin faj üzerinde eksprese edilmesiyle, stafilokok protein A'dan türetilen bir Z domainine karşı gerçekleştirilen birkaç tur biyopanning, hem HSA'ya hem de Z domainine afinite gösteren A BDZ one olarak adlandırılan bispesifik bir molekülle sonuçlanmıştır. Bispesifik füzyon etiketi ekspresyon plazmidini hazırlamak için, uygun restriksiyon bölgeleriyle çevrelenmiş A BDZ one geni PCR fragmanlarını hazırlayın ve ekspresyon plazmidindeki hedef genin uçlarını kesin; A BDZ one PCR fragmanlarını ve ilgi duyulan geni içeren saflaştırılmış ekspresyon vektörünü, uygun bir reaksiyon tamponunda seçilen restriksiyon enzimleri ile kesin. Ligasyondan önce ürünleri saflaştırın.Ardından, kısıtlanmış A BDZ bir fragmanını, ilgilenilen geni içeren ekspresyon vektörüne ligaze edin ve ligasyon ürününü e coli'ye transforme edin. Transforme edilmiş hücreleri, seleksiyon için uygun antibiyotiklerle desteklenmiş agar plaklarına yayın. Birkaç koloniyi PCR ile tarayın ve sonuçta oluşan ekspresyon kasetini DNA dizileme yoluyla doğrulayın.Son olarak, hedef proteini eksprese etmek için dizisi doğrulanmış bir koloninin gece boyu süren kültüründen plazmidi hazırlayın ve bunu tercih edilen ekspresyon suşuna transforme edin. Uç kısmına yeni etiket eklenmiş olan protein için, önce tek bir bakteri kolonisini, litre başına beş gram maya özütü ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mililitre triptik soya suyuna inoküle edin; 150 RPM ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu süren kültürden bir mililitreyi 100 mililitre taze besiyerine inoküle edin ve protein ekspresyonunu indükleyin.Hücreler logaritmik büyüme evresine ulaştığında, protein indüksiyonundan sonra hücreleri 150 RPM ve 25 °C'de gece boyunca inkübe edin, ertesi gün hücreleri santrifüj ile hasat edin; A BDZ one füzyon proteininin ortogonal afinite saflaştırması, immobilize HSA veya zoma içeren bir kolon üzerindeki ilk saflaştırma yoluyla gerçekleştirilir. Ardından, bispesifik etiketin ikinci afinitesi kullanılarak ardışık bir saflaştırma adımı uygulanır.MA select sure gibi Z domeninin immobilize edildiği kromatografik ortamlar, antikorların saflaştırılması için kolayca temin edilebilir. Öte yandan HSA, ortogonal afinite saflaştırmasına devam etmek için ikinci bir matris sağlamak amacıyla ortamla kimyasal olarak eşlenebilir. Pelletlemiş örnekleri 25 mililitre yürütme tamponunda resüspande edin. Ardından hücreleri %60 genlikte ve bir saniyelik darbeler ile bunu takip eden bir saniyelik duraklamalar şeklinde, toplam üç dakika boyunca sonikasyonla parçalayın.Örneği santrifüj ettikten sonra, hedef protein içeren süpernatantı daha ileri saflaştırma işleminden önce 0.45 mikronluk bir filtreden süzün. Ardından, uygun bir protein saflaştırma sisteminde, bir mililitrelik bir HSA spheros kolonunu veya HSA ile eşleştirilmiş bir NHS aktive kolonunu, dakikada bir mililitre hızında 10 kolon hacmi çalışma tamponu ile dengeleyin. Dengeleme tamamlandığında, bakteriyel lizatı dakikada 0,5 mililitre hızla yükleyin, akış hızını tekrar dakikada bir mililitreye ayarlayın ve kolonu beş kolon hacmi çalışma tamponu, ardından beş kolon hacmi yıkama tamponu ile yıkayın.Örneği, dakikada 1 mL hızında elüsyon tamponu ile elüe edin ve fraksiyonları toplayın. Elüe olan pikten fraksiyonları seçmek için 280 nanometredeki absorbsiyonu izleyin. Daha ileri saflaştırma için, en yüksek protein konsantrasyonuna sahip fraksiyonları birleştirin, ardından iki kat seyreltin.Çalışma tamponunun hazır olduğundan ve pH değerinin nötr civarında olduğundan emin olun. Bu adım, proteinin Z domenine bağlanması için kritiktir. Gerekiyorsa, pH'ı yükseltmek için bir molar tris HCL pH sekiz ekleyin.Ardından, örneği dakikada 0.5 mililitre hızla, sure çalışma tamponu ile dengelenmiş bir mililitrelik yüksek tuzak MA sure kolonuna yükleyin. Akış hızı dakikada bir mililitreye yeniden ayarlandıktan sonra, kolon beş kolon hacmi sure çalışma tamponu ile yıkanır. Daha sonra, hassas hedef proteinler için proteinleri 0.2 molar asetik asit pH 2.7 ile elüe edin.EIT, toplama işlemi sırasında T tris eklenerek doğrudan nötralize edilebilir. Protein saflığını değerlendirmek için H-C-L-S-D-S sayfası kullanılabilir. A BDZ birindeki serbest bir sistein, indirgen olmayan koşullar altında ürünün dimerizasyonuna neden olabileceği için numunenin tamamen indirgenmesi önemlidir.Son adım olarak, saflaştırılmış ürünün moleküler ağırlığı, bir HSA kolonu ve ardından bir MA select sure kolonu kullanılarak uygulanan ortogonal protokol ile saflaştırmanın ardından kütle spektrometrisi ile analiz edilebilir. Çeşitli saflaştırma noktalarında toplanan farklı örnekler SDS page ile analiz edilmiştir. Örnekler arasında A BDZ one tag'in kendisinin yanı sıra; farklı çözünürlük sınıflarını, moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktaları temsil eden, AB DZ one ile füzyonlanmış üç farklı insan hedef proteini yer almıştır.Bir ile dört arasındaki şeritler, üç farklı AB DZ one füzyon proteini ve AB DZ one etiketinin kendisi için saflaştırma öncesindeki protein lizatlarını göstermektedir. Beş ile sekiz arasındaki şeritler, proteinlerin HSA saflaştırma basamağından elde edilen sonuçları göstermektedir. Son olarak, dokuz ile 12 arasındaki şeritler, final mAbs select Sure saflaştırma basamağından elde edilmiştir.Ek olarak, aynı kolonlar üzerinde ters sırada saflaştırılan aynı lizatlardan elde edilen örnekler burada analiz edilmiştir. Bir ile üç arasındaki şeritler saflaştırma öncesindeki lizatları gösterirken, dört ile altı arasındaki şeritler MAB Select Sure kolonundaki ilk saflaştırma adımından sonra alınmıştır. Yedi ile dokuz arasındaki şeritlerdeki yüksek saflıktaki ürünler, final HSA saflaştırmasının sonucudur.Sonuçlar, çift etiket kullanımının ve iki yüksek özgünlükteki saflaştırma adımının faydasını açıkça göstermektedir. Jellerden görülebileceği üzere, ilk saflaştırma adımından sonra makul bir saflık elde edilse de, takip eden adım, oldukça talepkar uygulamalar için çok uygun olan çok saf bir ürün sağlamaktadır. Bu yöntemin merkezinde yer alan saflaştırma adımı bir kez kavrandığında, birçok farklı uygulama için uygun, yüksek saflıkta bir rekombinant protein elde etmek amacıyla tek bir kişi tarafından birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir.Örneğin, bu prosedürün ardından saflaştırılmış biyomoleküller, bir kompleksin bağlanma gücü gibi soruları yanıtlamak amacıyla etkileşim çalışmaları gibi diğer uygulamalarda kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bu çift afinite etiketi kullanarak nasıl gerçekten saf bir protein ürünü elde edileceği konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

orthogonal-protein-purification-facilitated-small-bispecific-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

Kaynak: Becker, B. ve diğerleri. Mayada Risin Toksin A Zinciri (RTA) kaçakçılığı için gerekli hücresel bileşenleri belirlemek için basit bir floresans tabanlı raporlayıcı testi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, polihistidin etiketli bir rekombinant proteinin nikel bazlı affinite kromatografisi kullanılarak arıtılmasını göstermektedir. Anahtar adımları belirtir; bunlar arasında sonikasyon yoluyla bakteriyel lizizi, lizatın aydınlaştırılması ve filtrasyonu ile imidazol kullanılarak hedef proteinin...

 Rekombinant Bakteriyel Proteinin Arındırılması için Afinite Kromatografi Tekniği

Bu videoda, Clostridium difficile bakterilerinden histidin etiketli pirofosfokinaz enzimlerini saflaştırmak için nikel afinite kromatografisi tekniğini gösteriyoruz.

Nikel Afinite Kromatografisi Bazlı Protein Saflaştırması: Polihistidin Etiketli Rekombinant Proteinleri Bakteriyel Hücre Lizatından Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Bu protokol, eşsiz bir şekilde bölünebilir GST-tag ve küçük bir His-tag birleştirilmesiyle yeniden birleştirici proteinlerin saflaştırılmasını sağlayan bir yüksek verimli ve düşük maliyetli, küçük ölçekli protein saflaştırma yöntemi göstermektedir.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Tandem Afinite Saflaştırma (TAP) yöntemi, proteomik için başta ökaryotik olmak üzere hücresel ekstrakttan doğal kompleksleri izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, yapısal çalışmalar için doğal komplekslerin saflaştırılması için optimize edilmiş bir TAP yöntemi protokolü sunuyoruz.

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Öğrenin, rekombinant proteinleri iki adımlı afinite kromatografisi ile saflaştırma yöntemini. Küçük bispecifik etiket kullanarak yüksek saflıkta protein elde edin ve çeşitli uygulamalar için kullanın.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Daha fazla video keşfet