Name: Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, kraniyofasiyal mezenşime yüklü makromolekülleri elektroporasyonla aktarma yöntemini. Xenopus laevis embriyolarında canlı görüntüleme ile kraniyofasiyal gelişimi in vivo çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Nancy Papalopulu ve Boyan BONEV Xenopus elektroporasyon ile yardım için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, eleştirel okuma, Jeremy Green ve John Liu laboratuar verdikleri destek için yararlı tartışmalar ve üyeleri Wallingford Marc Dionne teşekkür ederim. Bu çalışma BBSRC (BB/E013872/1) ve Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) KJL hibe tarafından finanse edildi.

Bölüm 1A. Ekipman Mikroskop: düşük güç amacı ile dik stereo diseksiyon kapsamı <ul><li> Gerilim / Pulse Generator: BTX ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi </li><li> Pipet çektirmesi: P-87 Mikropipet Çektirme (Sutter Instrument Company, CA) </li><li> Manipulator: kaba, ya da kombine kaba ve ince hazırlık bağlı. </li><li> Mikropipet sahibi: Güzel Bilim Araçları </li><li> Elektrot: ev yapımı </li><li> Elektroporasyon kamara: ev yapımı </li></ul> L-şekilli elektrotlar: <ol><li> Yüksek saflıkta 8 cm 0.4 mm tungsten tel (Goodfellow) ve orta noktasında yapıştırmayın kesin 1ml şırınga kullanarak bir macun (Blu-Tack). 4 cm tungsten tel L şekline bend ucu ve şırınga ucu açık bırakın, ucundan 1 cm (Şekil 1A). </li><li> Ucu sonuna kadar uzunluğu 0.5 mm boyutlarında kesin. Tonun ucu elektrot uçtur. </li><li> Şırıngaya aşırı tungsten tel paralel ve elektrot nabız jeneratörü bağlamak için onu kullanabilirsiniz. </li><li> Bir çift elektrot verme işlemi tekrarlayın. </li><li> DC kablolar üzerinden kare dalga darbe jeneratörü elektrotları takın. </li></ol> Elektroporasyon kamara <ol><li> Hat alt ~ 5 mm non-toksik hamuru ile 90 mm çanak. </li><li> Elektroporasyon medya ile çanak doldurun. </li><li> No: 5 saatçilik forseps T-şekilli bir kuyu (Şekil 2) bölmek. ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm ve kısa ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm uzun iyi ölçmelidir. Elektroporasyon bulaşık yıkanır ve tekrar kullanılabilir. </li></ol> Bölüm 1B. Reaktifler DNA veya tahsil makromoleküllerin <ul><li> Mikropipetler: 1 mm genişliğinde 4 "uzun borosilikat cam kapilerleri (TEFE, TW100-F) </li><li> Kültür medya: Normal Amfibi Medya (NAM) </li><li> &gt; 10 X stoğu: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> 4 ° C'de Otoklav ve mağaza </li><li> 1 X NAM: 10x stok, tampon 0.1 mM NaHCO 3 ve 0.2 mM Na 3 PO 4 ile seyreltilir. </li></ul></li><li> Xenopus laevis tetarlar, sahne 28 </li></ul> DNA hazırlığı: <ol><li> Ifade plazmid standart protokolleri kullanarak hazırlayın. </li><li> Nükleaz serbest H 2 0 1 mcg / ml final konsantrasyonda DNA tekrar </li></ol> * PCS2 gibi güçlü bir CMV organizatörü içeren vektörler, başarı vardı + [16]. Soy analizi için, biz genellikle son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda yeşil floresan proteininin (pCS2 GFP) kodlayan DNA içerir. [0.1-3 mg / ml arasında DNA konsantrasyonları da test edildi. Biz bulduğu konsantrasyonları 0.8 mg / ml verimsiz etiketli hücre altında, daha fazla DNA konsantrasyonları ise 2 mg / mu; l elektroporasyon verimliliğini artırmak vermedi]. Morfolino oligonükleotid hazırlanması: (Not:. Pratisyenler fluoresceinated gerekir (3'-carboxyfluorescein değiştirilmiş) veya başka bir ücret) <ol><li> Süspanse edin morfolino oligonükleotidler (MOS) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> nükleaz serbest H 2 0 2 mM konsantrasyonda). </li><li> Isı kısım stok solüsyonu 65 ° C'de 5 dakika. </li><li> Son konsantrasyonu 0.5 mM nükleaz ücretsiz su sulandırınız. </li></ol> * 0.1-1mm MO çözümleri test edildi. 0.5 mM MO çözümler birçok mezenkimal hücreler elektroporasyon için yeterli oldu. Mikropipetler <ol><li> Borosilikat cam kılcal damarlar (1 mm genişliğinde, 4 "uzun, TEFE yok. TW100-F) mikropipetler hazırlayın. Mikropipetler hazırlamak, 8-12 mm uzunluğunda konik ve ince uçlu iğne çektirmesi kullanın. </li><li> Crush ucu ~ 2 mmucundan, forseps kullanarak pürüzlü bir duraklama. </li></ol> Medya <ol><li> Kuluçka medya: 1x stok taze 3 / 4 Normal Amfibi Medya (NAM) hazırlayın. 0.025 mg / ml gentamisin ekleyin. </li><li> Elektroporasyon medya: yukarıdaki gibi,% 0.1 Benzocaine (Sigma, 06.950). </li></ol> 2. Elektroporasyon Mikropipet kurulum <ol><li> Mikropipet ~ 1 ul enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. </li><li> Mikromanipülatör mikropipet Güvenli ve mikroenjektör (Picospritzer II) ekleyin. </li><li> Masa üstü ile 50 ° açı mikropipet. </li><li> Enjeksiyon basıncı 20 PSI olarak ayarlayın. </li><li> Puls başına 30 nl enjekte mikropipet kalibre edin. </li></ol> Tadpole hazırlık <ol><li> 5 dakika elektroporasyon medya kuluçka aşamasında 28 Xenopus larvaları anestezisi. </li><li> Elektroporasyon medya ile dolu elektroporasyon odasına anestezi larva transferi. Pozisyonu embriyoUzun içinde baş, aşağı dorsal tarafına ve ventral tarafta maruz T kavşak aittir. Kafa, kuyruk göre biraz yüksek olmalıdır. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe hamuru çevreleyen ile larva güvenli. (Not:. Larva güvenli değilse, seğirme ve elektroporasyon sırasında elektrot ile irtibata Bu durumda yüz dokular ciddi hasar görecek olması, tetra atmak) </li></ol> Elektroporasyon <ol><li> Mikropipet ucu hemen çimento bezi ve arka yüz mezenşimin içine yerleştirin. </li><li> 30 nl çözüm mezenşimin içine enjekte edilir. </li><li> Mikropipet geri çekin. </li><li> Hızla embriyonun kafası (Şekil 3) paralel elektrot uçları aynı hizaya getirin. </li><li> 8 50 ms, 20mV kare darbeleri uygulayın. </li><li> Elektrotlar geri çekin. </li><li> Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde larva serbest ve 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml gentamisin transfer. </li><li> 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml overn tetarlar inkübe edilmelidir.ight, ya da daha uzun. </li><li> 24 saat sonra floresan mikroskobu ile verimli elektroporasyon Ekran embriyolar. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Floresan moleküllerin electroporated embriyoların kullanımı kolay tarama sağlar. Şekil 4 14.5 inkübe MO electroporated tetarlar ~ 12, 48 ve 96 saat sonra elektroporasyon tipik bir parti, ° C Floresan mikroskobu kullanarak, katille elektroporasyon sonra hemen görüntülenebilmekte ve elektroporasyon sonra birkaç gün süreyle devam edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, floresan aşamada 46 (~ 5 gün sonra) zayıf açıktır. Kıkırdaklar, floresan farklılaşma (~ St 42) başladıktan sonra dramatik bir şekilde azalır, ancak MO floresan gibi faringeal endoderm gibi diğer hücre tiplerinde daha güçlü devam. Floresan mikroskopi oligonükleotidler kıkırdak dahil olmak üzere birçok kraniyofasiyal dokular dahil olduğunu gösterir. Oligonükleotid floresans cgenellikle başın iki tarafında doku görüntülenebilmekte. Bu büyük olasılıkla elektroporasyon önce gevşek kraniyofasiyal mezenşimin boyunca enjeksiyon solüsyonu hızlı difüzyon nedeniyle. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> Şekil 1 Homemade elektrotlar. L-şekilli tungsten tel, toksik olmayan kil veya macun kullanarak 1 ml şırınga eklenir. (A) elektrot terminus, 5 mm. (B) Termini paralel olarak, bir çift elektrot takın. Elektrotlar DC kabloları ile darbe jeneratörüne bağlı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> Şekil 2 Elektroporasyon kamara. (A) hamuru ile kaplı 90 mm çanak medya ve No 5 saatçilik forseps ile oyulmuş bir T-şeklindeki haznesi ile doludur. (B) uzun kenarı 2 mm X 2 mm X10 mm boyutlarındakısa önlemleri 2 mm X 2 mm x 5 mm iken. Embriyonun baş T-kavşak, ventral tarafta aittir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> Şekil 3 şematik gösteren elektroporasyon prosedür. St 28 larva ventral yüzü yukarı, elektroporasyon odasında yerleştirilir. Mikropipet yüz mezenşimin yatan çimento bezi içine yerleştirilir. Enjekte edilir. Mikropipet kaldırılır ve L-şekilli elektrotlar kafa paralel yan hizalanır. Sekiz 50 ms, 20 mV kare darbeleri uygulayın. Elektrotlar geri çekin. Istenilen safhalarında tetarlar büyütün. Pratisyenler veya floresan mikroskobu kullanarak GFP ifade görselleştirin. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> Şekil 4 Temsilcisi tetarlar 12 (A), 48 (B) ve 96 (C) saat elektroporasyon (sırasıyla aşamaları 30, 34 ve 44). (A-B ") Floresan MO geyik kraniyofasiyal mezenşimin içinde görüntülenebilmektees 30 ve 34. Floresans aşamada 44 (ok ucu, C'-C ") az kıkırdaklar tespit edilebilir. Gut yüksek autofluorescent.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
<li>Falk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Electroporation+in+vivo+within+the+Intact+Developing+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).</li>
<li>Kuriyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tsukushi+controls+ectodermal+patterning+and+neural+crest+specification+in+Xenopus+by+direct+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+BMP4+and+X-delta-1+activity.+Development%22%5BJournal%5D)">Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation.</a> of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).</li>
<li>Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+effective+gene+knock-down+in+early+chick+embryos+using+morpholinos+but+not+pRFPRNAi+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors.</a> Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).</li>
<li>Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> Embo. J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Price, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+neuron+pool+sorting+by+differential+expression+of+type+II+cadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins.</a> Cell. 109, 205-216 (2002).</li>
<li>Grossin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+rat+articular+cartilage+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation.</a> Faseb. J. 17, 829-835 (2003).</li>
<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
<li>Takahashi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+cathepsin+K+in+synovium+leads+to+progression+of+osteoarthritis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis.+Rheum%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits.</a> Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var.

Bu video, Xenopus iribaşların yüz mezenşimin elektroporasyon aracılı gen teslim fizibilite göstermiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bize daha sonraki zaman noktalarında belirli dokuları hedef sağlayan genin fonksiyonu manipüle erken gelişimsel etkileri atlayabilir. Çalışmalar bize electroporated hücrelerin yanı sıra ilgi proteinlerin hücre özerk gereksinimleri soy incelemek için izin, heterojen toplumlarda kraniyofasiyal mezenkimal hücreler etkilenmiş olabileceğini göstermektedir. Canlı görüntüleme ile birlikte, biz kraniyofasiyal gelişimi sırasında, zaman içinde gen fonksiyonunu incelemek için bu yaklaşımı kullanabilirsiniz. Bu yeni bir yöntem organogenez çalışma Xenopus tractability vurgulamaktadır. Biz genel olarak bu yöntem de morfolojilerinden ve diğer dokulara farklılaşma çalışma adapte edilebilir olduğunu tahmin ediyoruz.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

kraniofasial mezenşimin, elektroporasyon

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporasyon, hassas zaman noktalarında dokulara ve hassas yerlerde DNA ve diğer ücret makromoleküllerin teslim etkili bir yöntemdir. Örneğin, elektroporasyon Xenopus sinir ve retina gelişimini incelemek için büyük bir başarı ile kullanılan, tavuk ve fare 1-10. Ancak, tüm bu çalışmalarda, araştırmacılar yumuşak dokuların hedefleyen çalışmalar olduğunu not etmek önemlidir. Kraniyofasiyal gelişim ile ilgilenen, çünkü biz bir yöntem yüz mezenşimin hedef uyarladı. Edebiyat aradı, biz, bizim için sürpriz, kıkırdak dokusu içine başarılı gen transferi çok az raporlar bulundu. Bu çalışmaların çoğu, gen terapisi çalışmaları, chondrogenic hücre hatları içine siRNA veya protein teslimat, ya da artrit 11-13 hayvan modelleri gibi . , Tavuk ya da fare gibi diğer sistemleri, yüz mezenşimin elektroporasyon zorlu olmuştur (kişisel HABERLEiyonlar, Kraniofasial Geliştirme Bölümü, KCL). Biz Xenopus procartilaginous ve kıkırdak dokulara elektroporasyon daha iyi çalışması olabileceği varsayımında bulunduk. Çalışmalarda, biz yüz kıkırdaklar gen transferi yüz primordium hala kıkırdak farklılaşması önce yumuşak doku oluşur erken evrelerinde (28), verimli bir şekilde oluşur. Xenopus kraniyofasiyal gelişim analizi için çok erişilebilir omurgalı sistemi. Xenopus embriyoların en erken aşamalarında analizler sağlayan, dışarıdan döllenmiş ve canlı tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme yanı sıra annelere 14 yeniden kolaylaştırılması Kraniofasial yapıları nedeniyle daha kolay görünür Xenopus başka herhangi bir omurgalı modeli daha, öncelikle. Dışarıdan gelişmekte olan omurgalı modeller arasında, Xenopus larvaları di daha büyük ve daha kolay olarak Xenopus zebrafish daha kraniyofasiyal analizi için daha yararlı .ssect ve gelişmekte olan yüz bölgesine balık eşdeğer bölgesi dışında görüntüleme için daha erişilebilir. Buna ek olarak, Xenopus zebrafish (~ 100 milyon yıl yakın) 15 daha insanlar için evrimsel olarak yakın. Son olarak, bu aşamada, Xenopus tetarlar şeffaf ve floresan proteinlerle veya moleküller eşzamanlı ifade gelişmekte olan kıkırdaklar daha kolay görsellik sağlayacaktır. Biz bu yaklaşımı bize daha hızlı ve verimli bir şekilde in vivo model sistem bir aday molekülleri test etmek için izin olacağını tahmin ediyoruz.

Kraniofasial kıkırdaklar diğer dokuları ile yakın temas içinde gelişir ve canlı hayvan işlemek için zordur. Elektroporasyon erken embriyonik etkileri atlayarak kraniyofasiyal iskeletin büyüme sırasında moleküler araçlar sunmak için kullanıyor. Bu yaklaşım, aday moleküllerin etkin bir şekilde test etmek için bize izin verecek<em&gt; In vivo.</em

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Elektroporasyon, DNA ve diğer yüklü makromoleküllerin belirli zaman noktalarında ve belirli bölgelerdeki dokulara iletilmesi için etkili bir yöntemdir. ...

Bu prosedürün genel amacı, yüklü makromolekülleri kranial fasiyal mezenşime elektro-operasyonla aktarmaktır. Bu işlem, öncelikle anestezi altındaki 28. evre embriyonun elektroporasyon haznesine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, yüklü makromolekülleri içeren solüsyonun C kraniofasiyal mezenşime mikroenjeksiyonla verilmesidir.Bunu hemen ardından, yüklü nükleotidlerin hücrelere aktarılmasını sağlayan bir elektrik akımı uygulaması takip eder. Prosedürün son adımı, elektropore edilmiş dokunun floresan mikroskobi ile görüntülenmesidir. Sonuç olarak, kranial fasiyal dokulardaki değişimleri gösteren bulgular elde edilebilir.Bu sonuçlar, floresan, mikroskopi veya immünohistokimya kullanılarak in vivo veya fikse edilmiş dokularda analiz edilebilir. Elektroporasyonun, mikroenjeksiyon ve mutasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, moleküler araçlarımızın doku ve zamansal kontrolüdür; prosedürümüzü bugün laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Jackie Tabler gösterecektir. Bu prosedür için gerekli olan L-şekilli elektrot çifti, yüksek saflıkta 0,4 mm tungsten telden yapılır; her bir elektrot için önce telden sekiz cm kesin.Ardından, tungsten telin orta noktasına mavi yapışkan hamur (blue tack) gibi bir macun kullanarak bir mililitrelik şırıngayı sabitleyin ve şırınganın ucundan itibaren dört santimetre telin açıkta kalmasını sağlayın. Ucun sonundan bir santimetre geriden L şeklinde bükün. Uç kısmını, sonu 0,5 santimetre uzunluğunda olacak şekilde kesin.Bu uç, şırıngaya paralel olarak uzanan fazla tungsten telin bulunduğu elektrot terminalidir. Bu uç, ikinci elektrot oluşturulduktan sonra elektrot darbe jeneratörünü bağlamak için kullanılacaktır. Elektrot terminal I paralel olarak ve bir santimetre ara ile uzanacak şekilde, elektrot çiftini bant kullanarak birbirine sabitleyin.Son olarak, elektrotları DC kablolar aracılığıyla bir kare dalga pulse jeneratörüne bağlayın. Özel yapım elektroporasyon haznesini hazırlamak için, 90 milimetrelik bir kabın tabanını yaklaşık beş milimetre kalınlığında toksik olmayan plaster scene modelleme kili ile kaplayın. Kabı, plaster scene'i tamamen örtecek şekilde elektroporasyon medyası ile doldurun.Ardından, elektroporasyon kuyucuğunu oluşturmak için alçı sahneye T şeklinde bir kuyucuk oymak üzere beş numara saatçi pensi kullanın. Kuyucuğun uzun kenarı yaklaşık 2 mm x 2 mm x 10 mm, kısa kenarı ise 2 mm x 2 mm x 5 mm ölçülerinde olmalıdır. Bu işlem için kullanılan mikropipetler silikat cam kılcal borulardan yapılmıştır.Sekiz ila 12 milimetre uzunluğunda konik bir yapıya ve ince bir uca sahip mikropipetler hazırlamak için bir iğne çekici kullanın; mikropipeti kurmak için pens yardımıyla ucun yaklaşık iki milimetre üzerinden ezerek pürüzlü bir kırılma oluşturun. İlk olarak, pipeti, bu demonstrasyonda floresan işaretli oligonükleotidler içeren yaklaşık bir mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ile doldurun. Ardından, mikropipeti bir mikromanipülatöre sabitleyin ve mikropipeti masa yüzeyinden 50 derecelik bir açıyla konumlandırın.Enjeksiyon basıncını 20 PSI'a ayarlayın ve mikropipeti darbe başına 30 liter enjekte edecek şekilde kalibre edin. Elektroporasyona hazırlık için, bir evre 28 xeno larvaesini beş dakika boyunca inkübe ederek anestezi altına alın. Anestezi altındaki iribaşıyı, %0,1 Benzocaine içeren normal amfibi medyumu olan elektroporasyon ortamında elektroporasyon odasına aktarın.Burası elektroporasyon medyası ile doldurulmuştur. Prosedürün en zor kısmı, mikro pipeti iribaşa yerleştirmektir. Bu nedenle başarıyı sağlamak için embriyoyu gerçekten sıkıca sabitlemeniz ve mikro enjeksiyondan sonra akımı hızla uygulamanız gerekir.Embriyoyu, baş kısmı T eklemine gelecek şekilde uzun kuyucuğun içine yerleştirin. Dorsal tarafı aşağıda ve ventral tarafı açık olacak şekilde, baş kısmı pens yardımıyla kuyruk kısmına oranla hafifçe yükseltilmelidir; ardından iribaş, çevredeki alçı sahne ile kuyucuğa nazikçe sabitlenmelidir. Elektroporasyon sırasında yüzey dokularında ciddi hasarlara yol açabilecek seyirmelerin önlenmesi için iribaşın sabitlenmesi önemlidir.Bu prosedüre başlamak için, mikro pipet ucunu hemen çimento bezinin arkasına ve fasiyal mezenşime yerleştirin. Mezenşime 30 nanolitre çözelti enjekte edin ve mikro pipeti geri çekin. Elektrot uçlarını hızla embriyonun başına paralel olarak hizalayın ve sekiz adet 50 milisaniyelik 20 milivoltluk kare dalga pals uygulayın.Ardından elektrotları pens yardımıyla geri çekin. İstavozu kuyucuktan dikkatlice çıkarın. Daha sonra bir pipet kullanarak istavozu, 0,025 mg/mL konsantrasyonda üç çeyrek NOM içeren ortama aktarın.Gentamycinli irbaşlar, bu besiyerinde gece boyunca veya 24 saatin ardından daha uzun süre inkübe edilebilir. Elektroporasyonun etkinliğini belirlemek için irbaşlar floresan mikroskobu ile taranır. Floresan moleküllerin kullanımı, elektropore edilmiş embriyoların kolayca taranmasını sağlar.Bu şekil, elektroporasyondan yaklaşık 48 ve 96 saat sonra, sırasıyla 30, 34 ve 44. evrelerdeki tipik bir morf oligonükleotid elektropore edilmiş iribaç grubunu göstermektedir. Floresan işaretli morf oligonükleotidler, 30. ve 34. evrelerde kranial fasyal bölgede görselleştirilebilir.44. evrede, beyaz ok uçlarıyla belirtilen kıkırdaklarda floresan tespit edilebilir. Yüksek düzeyde otofloresan olan bölge bağırsaktır. Bu prosedürün ardından, elektro hücrelerin soy ağacının yanı sıra ilgilenilen proteinler için moleküler gereklilikleri takip edebiliriz.Bu yaklaşım, kraniofasiyal gelişim sırasında gen fonksiyonunu zaman içinde incelemek için canlı görüntüleme teknikleriyle birleştirilebilir.

electroporation-of-craniofacial-mesenchyme

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek hücreli elektroporasyon (SCE), in vivo hazırlıkları da dahil olmak üzere sağlam doku içindeki tek tek hücrelerin içine DNA veya diğer makromoleküller teslim sağlayan özel bir tekniktir. Xenopus laevis larva bozulmamış beyin içinde nöronların bir floresan boya veya plazmid DNA SCE için burada ayrıntılarıyla prosedür.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler...

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Pial yüzey artan bir ilgi alıyor MSS benzersiz bir ata bölgesi. Burada, detay değiştirilmiş elektroporasyon yöntemi kullanarak bu progenitör bölgenin hızlı genetik manipülasyon için bir yöntemi biz. Bu prosedür, hücre soyları ve hücre farklılaşması dahil sinyal yollarının hücresel ve moleküler araştırmalar için kullanılabilir ve kız hücrelerin kaderini ve özellikleri ortaya çıkarmak için.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Burada, kraniyal levator auris longus (LAL) kasının in vivo elektroporasyonu ve denervasyonunu birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu prosedür, kas kaynaklı proteinlerin nöromüsküler sinapsın rejenerasyonundaki potansiyel rolünün incelenmesini sağlar.

Kranial Levator Auris Longus İskelet Kasının Kombine İn Vivo Elektroporasyonu ve Kısa Süreli Reinnervasyonu

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyon ile akut genetik manipülasyonunu sunuyoruz. Bu kortikal organoid modeller, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğinden, insan kortikal gelişiminin, nörogelişimsel bozuklukların ve kortikal evrimin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağladığından, enjeksiyona özellikle uygundur.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Öğrenin, kraniyofasiyal mezenşime yüklü makromolekülleri elektroporasyonla aktarma yöntemini. Xenopus laevis embriyolarında canlı görüntüleme ile kraniyofasiyal gelişimi in vivo çalışın.

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet