Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Bu prosedürün genel amacı, yüklü makro molekülleri kraniyal fasiyal mezenşime elektro olarak çalıştırmaktır. Bu, önce anestezi uygulanmış bir evre 28 embriyosunun elektroporasyon odası içine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, yüklü makromoleküller içeren çözeltiyi C kraniyofasiyal mezenşimine mikro enjekte etmektir.

Bunu hızlı bir şekilde bir elektrik akımının uygulanması takip eder, böylece yük nükleotidleri başka hücrelere sokar. İşlemin son adımı, elektroporasyonlu dokuyu floresan mikroskobu ile görselleştirmektir. Sonuç olarak, kraniyal yüz dokularındaki değişiklikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu sonuçlar in vivo veya floresan, mikroskopi veya immünohistokimya kullanılarak sabit dokuda analiz edilebilir. Elektroporasyonun mikroenjeksiyon ve mutasyon gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, moleküler araçlarımızın doku ve zamansal kontrolüdür ve bugünkü prosedürümüzü gösteren Jackie Tabler, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olacak. Bu prosedür için gerekli olan L-Şekilli elektrot çifti, ilk olarak telin sekiz santimetresini kesen her elektrot için yüksek saflıkta, 0.4 milimetre tungston telden yapılmıştır.

Daha sonra mavi yapışma gibi bir macun kullanmak, tungsten telinin orta noktasında bir mililitrelik bir şırıngayı etkiler ve şırınganın ucundan dört santimetre tel açıkta kalır. Ucu uçtan bir santimetre L şeklinde bükün. Ucu, ucu 0,5 santimetre uzunluğunda olacak şekilde kesin.

Bu uç, fazla tungsten telini şırıngaya paralel olarak çalıştıran elektrot terminalidir. İkinci elektrot yapıldıktan sonra elektrot darbe üretecini bağlamak için kullanılacaktır. Elektrot çiftini bant kullanarak birbirine sabitleyin, böylece elektrot terminali I bir santimetre aralıklarla paralel olarak çalışır.

Son olarak, elektrotları DC kabloları aracılığıyla bir kare dalga darbe üretecine bağlayın. Özel yapım elektroporasyon odasını hazırlamak için, 90 milimetrelik bir tabağın altını yaklaşık beş milimetre toksik olmayan alçı sahne modelleme kili ile kaplayın. Çanağı, alçı sahnesini daldırarak elektroporasyon ortamı ile doldurun.

Ardından, elektroporasyonu oluşturmak için alçı sahnesinde T şeklinde bir kuyu oymak için beş numaralı saatçinin forsepsini kullanın. Kuyunun uzun kenarı yaklaşık iki milimetre x iki milimetre x 10 milimetre ölçmeli ve kısa kenarı iki milimetre x iki milimetre x beş milimetre olmalıdır. Bu prosedür için mikro pipetler silikat cam kılcal damarlardan yapılmıştır.

Sekiz ila 12 milimetre uzunluğunda konik ve ince uçlu mikropipetler hazırlamak için bir iğne çektirme kullanın, forseps kullanarak ucu uçtan yaklaşık iki milimetre ezin ve mikro pipeti ayarlamak için pürüzlü bir kırılma oluşturun. İlk olarak, bu gösteride floresan olarak etiketlenmiş oligonükleotidler içeren yaklaşık bir mikrolitre enjeksiyon çözeltisi ile doldurun. Ardından, mikro pipeti bir mikro manipülatöre sabitleyin ve mikro pipeti masa üstünden 50 derece açıyla açın.

Enjeksiyon basıncını 20 PSI'ye ayarlayın ve mikropipeti nabız başına 30 litre enjekte edecek şekilde kalibre edin. Elektroporasyona hazırlanırken, 28. aşama kseno larvalarını beş dakika kuluçkaya yatırarak anestezi altına alın. % 0.1 Benzokain içeren normal amfibi ortamı olan elektroporasyon ortamında, anestezi uygulanmış kurbağa yavrusunu elektroporasyon odasına aktarın.

Bu, elektroporasyon ortamı ile doldurulur. Prosedürün en zor kısmı, mikro evcil hayvanı kurbağa yavrusuna yerleştirmektir. Bu nedenle, başarıyı sağlamak için embriyoyu gerçekten sıkı bir şekilde sabitlemeniz ve ardından mikro enjeksiyondan sonra akımı hızlı bir şekilde uygulamanız gerekir.

Embriyoyu uzun kuyu içine yerleştirin, böylece baş T kavşağında durur. Sırt tarafı aşağı ve ventral tarafı açıkta, kafa forseps kullanılarak kuyruğa göre biraz yükseltilmeli, kurbağa yavrusunu çevreleyen sıva sahnesi ile kuyuya nazikçe sabitleyin. Yüz dokularında ciddi hasara neden olabilecek elektroporasyon sırasında seğirmesini önlemek için kurbağa yavrusunu sabitlemek önemlidir.

Bu işleme başlamak için, mikro pipet ucunu çimento bezinin hemen arkasına ve yüz bezine yerleştirin. Mezenşime 30 nanolitre çözelti enjekte edin, mikro pipeti geri çekin. Elektrot uçlarını embriyonun başına paralel olarak hızlı bir şekilde hizalayın ve sekiz adet 50 milisaniye 20 milivolt kare darbe uygulayın.

Ardından forseps kullanarak elektrotları geri çekin. Kurbağa yavrusunu kuyudan dikkatlice serbest bırakın. Ardından, kurbağa yavrusunu mililitre başına 0.025 miligram ile üç çeyrek nom'a aktarmak için bir pipet kullanın.

Gentamisin kurbağa yavruları bu ortamda gece boyunca veya 24 saat sonra daha uzun süre inkübe edilebilir. Verimli elektroporasyon için floresan mikroskobu ile kurbağa yavrularını tarayın. Floresan moleküllerin kullanılması, elektroporasyonlu embriyoların kolay taranmasını sağlar.

Bu şekil, elektroporasyondan yaklaşık 1248 ve 96 saat sonra tipik bir morf oligonükleotid elektroporasyonlu kurbağa yavrusu grubunu göstermektedir. Sırasıyla 30, 34 ve 44. aşamalarda. Floresan morf oligonükleotidler, 30. ve 34. aşamalarda kraniyal yüz ölçümü içinde görüntülenebilir.

Evre 44'te, beyaz ok uçları ile gösterilen kıkırdaklarda floresan tespit edilebilir. Yüksek otofloresan alan bağırsaktır. Bu prosedürü takiben, elektro hücrelerin soyunu ve ilgilenilen proteinler için moleküler gereksinimleri izleyebiliriz.

Bu yaklaşım, kraniyofasiyal gelişim sırasında zaman içinde gen fonksiyonunu incelemek için canlı görüntüleme teknikleriyle birleştirilebilir.