Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit
December 8th, 2011
Değerlendirilmesinde kullanılacak kilit teknikleri Candida Vajinit deneysel bir hayvan modeli anlatılmaktadır. Yöntemleri, lomber lenf düğümleri drenaj, vajinal örneklerin ve lenfositler hızlı toplama sağlayacaktır. Bu teknikler, kadın alt genital sistem diğer hastalıkların fare modelleri yol açabilir.
Bu prosedürün genel amacı, vajinal mantar yükünü ölçmek için bir araç olarak vajinal kandidiyazisin deneysel hayvan modelinin kullanılmasıyla ilişkili spesifik prosedürel sorunları göstermek ve ayrıca immünolojik ve histolojik testler gibi spesifik deneylerde vajinal veya lenfoid hücrelerin kullanılmasıdır. Bu, ilk olarak östrojenle tedavi edilen fareler üzerinde vajinal aşılama tekniğinin gösterilmesiyle sağlanacaktır. Daha sonra, fareye ötenazi yapıldıktan sonra, kandida'yı kurtarmak için vajinal bir lavaj yapılacaktır.
Daha sonra vajinal doku ve/veya vajinal drenaj lenf düğümleri çıkarılacaktır. Lavaj sıvısı, vajinal epitel hücreleri ile ilişkili kandidayı göstermek için mikroskobik olarak görüntülenebilir veya vajinal mantar yükünü ölçmek için agar üzerine kaplanabilir. Hücresel fraksiyonun bir smear'ı, epitel hücreleri ve lenfoid hücreleri boyamak için de kullanılabilir.
Bu nedenle, bu tekniği göstermenin temel avantajı, vajinitin hayvan modelini kullananların bunu en verimli ve etkili şekilde yapabilmeleridir. Ve teknik aracılığıyla cevaplanan anahtar sorular vajinit ve ekoloji alanındadır ve konak immün yanıtları, hücresel dağılım, ilaçların etkinliği, immünoterapötik etkinlik ve ayrıca bağışıklamanın etkileri ve tekniğin gösterilmesi gibi temel soruları cevaplar. Bugün laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak, junco yano, Beta estradiol enjeksiyonu uyguladıktan üç gün sonra bir fareyi C albicans ile enfekte etmek.
Fareyi kavraması için düz bir gRED yüzey üzerinde sabitleyerek başlayın. Ardından kuyruğun tabanını iki parmağınızla tutun ve vajinal açıklık size bakacak şekilde kalçayı yukarı doğru kaldırın. Pipet ucunu vajinal lümenin yaklaşık beş milimetre derinliğine yerleştirin ve 20 mikrolitreye kadar aşı süspansiyonunu pipetleyin.
Faredeki sıkıntıyı en aza indirmek için bu adımı mümkün olduğunca hızlı ve nazikçe tamamlayın. İstenilen kuluçka döneminden sonra, hayvanı tesisinizin protokolüne göre ötenazi yapın. Ardından iki parmağınızla fareyi kuyruğun tabanından aşağı doğru tutun, böylece vajinal açıklık bir pipetle açığa çıkar.
Vajinal lümene 100 mikrolitre steril PBS yerleştirin ve tekrarlanan aspirasyon ve ajitasyon ile lavaj yapın. Pipet ucu hücrelerle tıkanırsa, engelleyici hücreleri dağıtın ve kalan PBS ile tahrip etmeye devam edin. Lavaj sıvısını bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.
Vajinal lavaj işleminden sonra fareyi sırt üstü yatırın ve kasık bölgesini %70 etanol ile doyurun. Bir çift forseps kullanarak, vajinal açıklık açığa çıkacak şekilde idrar deliğini yukarı doğru kaldırın. Vajinal lümene bir çift kavisli forseps yerleştirin ve forseps ile sıkı bir tutuş sağlarken rahim ağzını bulun.
Rahim ağzını vajinal boşluktan çıkarın, vajinal açıklığın tabanındaki vajinayı eksize edin ve ardından rahim ağzını cerrahi makasla vajinadan çıkarın. Vajinal doku kıvrılmış olduğundan, orijinal oryantasyonu korumak için ters çevirin veya hayvan sırtındayken lomber düğüm eksizyonu için yanal bir kesi yaparak bir tabaka halinde açın. Karnı% 70 etanol ile doyurun.
Alt karın bölgesinden başlayarak göğse doğru yanal bir kesi yapın ve her iki elinizde bir çift forseps kullanarak iç organları açığa çıkarın. Bağırsakları yukarı doğru hareket ettirin, böylece merkezi kan damarları görünür hale gelir. İnferior vena cva ve abdominal aortu bulun.
Abdominal aorta komşu, renal orijin ve ortak iliak arterlerin yaklaşık yarısında yer alan bir çift lomber lenf nodu tanımlanabilir. Bu lenf bezleri elastik dokusu ile görsel olarak yağ dokusundan ayırt edilebilir ve yağ dokusuna göre daha açık ve opak renklidir. Ayrıca, enfekte hayvanlarda aşılanmamış hayvanlara kıyasla belirgin şekilde daha büyüktürler.
Hayvanlar, düğümün altına mikro forseps yerleştirerek lenf düğümlerini eksize ettiler ve daha sonra onları çevreleyen dokudan ayırmak için yavaşça yukarı çektiler. Dokuyu eksize ettikten sonra, lenf düğümlerini yaklaşık 10 mililitre Hank'in dengeli tuz çözeltisi içeren steril bir cam Petri kabının içine yerleştirilmiş steril bir tel örgü ekrana aktarın. Lenfoid hücreleri izole etmek için yazılı protokole bakın.
En az dört gün önce aşılanan farelerden alınan vajinal lavaj sıvısının hücresel fraksiyonları, tipik olarak, burada ıslak montaj mikroskobu ile gösterildiği gibi, kandida epitel hücreleri ve hücresel infiltratlardan oluşur. Candida, mayanın yanı sıra PHA'nın varlığı ile de tanımlanabilir. Burada vajinal lavaj sıvısının smear preparatları lekelenir.
Epitel hücrelerini incelemek için pap smear tekniğinin kullanılması ve traclear loblar tarafından tanımlanabileceği gibi, ana hücreleri nötrofil olan lökositlerin sızması. Aşılanmamış farelerde varsa çok az nötrofil tespit edilir. Bu şekil vajinal mantar yükünün bir örneğini göstermektedir.
Vajinal lavaj sıvısı belirli zaman noktalarında toplanır ve CFU sayımı için kültürlenir. Bu örnekte, sıvı aşılamadan sonraki beşinci günde toplandı, seri olarak seyreltildi, kaplandı ve 48 saat boyunca inkübe edildi. Koloniler daha sonra sayılır ve vajinal mantar yükü hesaplanır, vajinal kolonizasyon veya kandida enfeksiyonu östrojenle tedavi edilen aşılanmış farelerde haftalarca devam eder.
Kandida, östrojenle tedavi edilmeyen aşılanmış farelerde vajinal kolonizasyon kuramazken, östrojenle tedavi edilen aşılanmamış fareler zaman boyunca kandida için negatif kalır. Ek olarak, vajinal lavajlar her zaman noktasında ayrı farelerde bir kez veya anestezi altında aynı farelerde uzunlamasına yapılabilir. Bu prosedürü denerken, vajina travmasını önlemek için hayvanları güvenli bir şekilde dizginlemeyi unutmamak ve vajinal dokuları çıkarırken doğru vajinal mantar yükü elde etmek için lütfen iyice lavaj yapmak için gereken zamanı ayırın.
Susuz kalmalarını önlemek için hala PBS kullanın ve lütfen lenf düğümlerini çıkarırken ve lenf bezi hücrelerini işlerken büyük damarlara ve arterlere zarar vermemeye dikkat edin, hücre canlılığını korumak için onları buz üzerinde veya dört derecede tutun. Bu videoyu izledikten sonra, vajinal mantar yükünü tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek ve spesifik immünolojik veya histolojik testler için vajinal veya lenfoid dokuları eksize etmek için kandida vajinitinin deneysel fare modelini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, deneysel bir hayvan modeli kullanarak Candida vajinitini değerlendirmek için temel teknikleri açıklamaktadır. Yöntemler, vajinal örneklerin ve drenaj yapan bel lenf düğümlerinden lenfositlerin hızlı bir şekilde toplanmasını sağlar ve potansiyel olarak dişi alt genital sistemdeki diğer hastalıklar için fare modellerine yol açabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Mikrobiyoloji
- Immünoloji
Arka Plan
- Candida vajinit, dişi genital sistemi etkileyen yaygın bir durumdur.
- Bağışıklık tepkisini anlamak, tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
- Deneysel modeller, hastalık mekanizmalarının incelenmesine yardımcı olur.
- Vajinal kandidiaz spesifik tahliller kullanılarak ölçülebilir.
Çalışmanın Amacı
- Vajinal kandidiazı incelemek için prosedür tekniklerini göstermek.
- Deneysel bir modelde vajinal mantar yükünü ölçmek.
- Immunolojik tahlillerde vajinal ve lenfoid hücreleri kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Estrojenle tedavi edilen fareler üzerinde vajinal inokülasyon tekniği.
- Fare ötanazi edildikten sonra Candida'yı geri kazanmak için vajinal lavaj.
- Vajinal doku ve drenaj lenf düğümlerinin ekstraksiyonu.
- Lavaj sıvısının mikroskop altında incelenmesi ve agar üzerine yerleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Vajinal lavajdan Candida'nın başarılı bir şekilde kurtarılması.
- Agar plakalama kullanılarak mantar yükünün ölçülmesi.
- Boyama yoluyla epitelyal ve lenfoid hücrelerin tanımlanması.
- Modelin gelecekteki çalışmalar için uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Özellikle belirtilen teknikler, vajinal kandidiazı incelemek için sağlam bir yöntem sağlar.
- Bu model, dişi alt genital sistemdeki diğer hastalıklar için uyarlanabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, bu bulgulara dayanarak immünolojik tepkileri keşfetmek için ilerleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
