Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit

Bu prosedürün genel amacı, vajinal mantar yükünü ölçmek için bir araç olarak vajinal kandidiyazisin deneysel hayvan modelinin kullanılmasıyla ilişkili spesifik prosedürel sorunları göstermek ve ayrıca immünolojik ve histolojik testler gibi spesifik deneylerde vajinal veya lenfoid hücrelerin kullanılmasıdır. Bu, ilk olarak östrojenle tedavi edilen fareler üzerinde vajinal aşılama tekniğinin gösterilmesiyle sağlanacaktır. Daha sonra, fareye ötenazi yapıldıktan sonra, kandida'yı kurtarmak için vajinal bir lavaj yapılacaktır.

Daha sonra vajinal doku ve/veya vajinal drenaj lenf düğümleri çıkarılacaktır. Lavaj sıvısı, vajinal epitel hücreleri ile ilişkili kandidayı göstermek için mikroskobik olarak görüntülenebilir veya vajinal mantar yükünü ölçmek için agar üzerine kaplanabilir. Hücresel fraksiyonun bir smear'ı, epitel hücreleri ve lenfoid hücreleri boyamak için de kullanılabilir.

Bu nedenle, bu tekniği göstermenin temel avantajı, vajinitin hayvan modelini kullananların bunu en verimli ve etkili şekilde yapabilmeleridir. Ve teknik aracılığıyla cevaplanan anahtar sorular vajinit ve ekoloji alanındadır ve konak immün yanıtları, hücresel dağılım, ilaçların etkinliği, immünoterapötik etkinlik ve ayrıca bağışıklamanın etkileri ve tekniğin gösterilmesi gibi temel soruları cevaplar. Bugün laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak, junco yano, Beta estradiol enjeksiyonu uyguladıktan üç gün sonra bir fareyi C albicans ile enfekte etmek.

Fareyi kavraması için düz bir gRED yüzey üzerinde sabitleyerek başlayın. Ardından kuyruğun tabanını iki parmağınızla tutun ve vajinal açıklık size bakacak şekilde kalçayı yukarı doğru kaldırın. Pipet ucunu vajinal lümenin yaklaşık beş milimetre derinliğine yerleştirin ve 20 mikrolitreye kadar aşı süspansiyonunu pipetleyin.

Faredeki sıkıntıyı en aza indirmek için bu adımı mümkün olduğunca hızlı ve nazikçe tamamlayın. İstenilen kuluçka döneminden sonra, hayvanı tesisinizin protokolüne göre ötenazi yapın. Ardından iki parmağınızla fareyi kuyruğun tabanından aşağı doğru tutun, böylece vajinal açıklık bir pipetle açığa çıkar.

Vajinal lümene 100 mikrolitre steril PBS yerleştirin ve tekrarlanan aspirasyon ve ajitasyon ile lavaj yapın. Pipet ucu hücrelerle tıkanırsa, engelleyici hücreleri dağıtın ve kalan PBS ile tahrip etmeye devam edin. Lavaj sıvısını bir mikro santrifüj tüpünde toplayın.

Vajinal lavaj işleminden sonra fareyi sırt üstü yatırın ve kasık bölgesini %70 etanol ile doyurun. Bir çift forseps kullanarak, vajinal açıklık açığa çıkacak şekilde idrar deliğini yukarı doğru kaldırın. Vajinal lümene bir çift kavisli forseps yerleştirin ve forseps ile sıkı bir tutuş sağlarken rahim ağzını bulun.

Rahim ağzını vajinal boşluktan çıkarın, vajinal açıklığın tabanındaki vajinayı eksize edin ve ardından rahim ağzını cerrahi makasla vajinadan çıkarın. Vajinal doku kıvrılmış olduğundan, orijinal oryantasyonu korumak için ters çevirin veya hayvan sırtındayken lomber düğüm eksizyonu için yanal bir kesi yaparak bir tabaka halinde açın. Karnı% 70 etanol ile doyurun.

Alt karın bölgesinden başlayarak göğse doğru yanal bir kesi yapın ve her iki elinizde bir çift forseps kullanarak iç organları açığa çıkarın. Bağırsakları yukarı doğru hareket ettirin, böylece merkezi kan damarları görünür hale gelir. İnferior vena cva ve abdominal aortu bulun.

Abdominal aorta komşu, renal orijin ve ortak iliak arterlerin yaklaşık yarısında yer alan bir çift lomber lenf nodu tanımlanabilir. Bu lenf bezleri elastik dokusu ile görsel olarak yağ dokusundan ayırt edilebilir ve yağ dokusuna göre daha açık ve opak renklidir. Ayrıca, enfekte hayvanlarda aşılanmamış hayvanlara kıyasla belirgin şekilde daha büyüktürler.

Hayvanlar, düğümün altına mikro forseps yerleştirerek lenf düğümlerini eksize ettiler ve daha sonra onları çevreleyen dokudan ayırmak için yavaşça yukarı çektiler. Dokuyu eksize ettikten sonra, lenf düğümlerini yaklaşık 10 mililitre Hank'in dengeli tuz çözeltisi içeren steril bir cam Petri kabının içine yerleştirilmiş steril bir tel örgü ekrana aktarın. Lenfoid hücreleri izole etmek için yazılı protokole bakın.

En az dört gün önce aşılanan farelerden alınan vajinal lavaj sıvısının hücresel fraksiyonları, tipik olarak, burada ıslak montaj mikroskobu ile gösterildiği gibi, kandida epitel hücreleri ve hücresel infiltratlardan oluşur. Candida, mayanın yanı sıra PHA'nın varlığı ile de tanımlanabilir. Burada vajinal lavaj sıvısının smear preparatları lekelenir.

Epitel hücrelerini incelemek için pap smear tekniğinin kullanılması ve traclear loblar tarafından tanımlanabileceği gibi, ana hücreleri nötrofil olan lökositlerin sızması. Aşılanmamış farelerde varsa çok az nötrofil tespit edilir. Bu şekil vajinal mantar yükünün bir örneğini göstermektedir.

Vajinal lavaj sıvısı belirli zaman noktalarında toplanır ve CFU sayımı için kültürlenir. Bu örnekte, sıvı aşılamadan sonraki beşinci günde toplandı, seri olarak seyreltildi, kaplandı ve 48 saat boyunca inkübe edildi. Koloniler daha sonra sayılır ve vajinal mantar yükü hesaplanır, vajinal kolonizasyon veya kandida enfeksiyonu östrojenle tedavi edilen aşılanmış farelerde haftalarca devam eder.

Kandida, östrojenle tedavi edilmeyen aşılanmış farelerde vajinal kolonizasyon kuramazken, östrojenle tedavi edilen aşılanmamış fareler zaman boyunca kandida için negatif kalır. Ek olarak, vajinal lavajlar her zaman noktasında ayrı farelerde bir kez veya anestezi altında aynı farelerde uzunlamasına yapılabilir. Bu prosedürü denerken, vajina travmasını önlemek için hayvanları güvenli bir şekilde dizginlemeyi unutmamak ve vajinal dokuları çıkarırken doğru vajinal mantar yükü elde etmek için lütfen iyice lavaj yapmak için gereken zamanı ayırın.

Susuz kalmalarını önlemek için hala PBS kullanın ve lütfen lenf düğümlerini çıkarırken ve lenf bezi hücrelerini işlerken büyük damarlara ve arterlere zarar vermemeye dikkat edin, hücre canlılığını korumak için onları buz üzerinde veya dört derecede tutun. Bu videoyu izledikten sonra, vajinal mantar yükünü tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek ve spesifik immünolojik veya histolojik testler için vajinal veya lenfoid dokuları eksize etmek için kandida vajinitinin deneysel fare modelini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.