Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu prosedürün genel amacı, yaprak içindeki canlı hücrelerin daha net görüntülerini elde etmek için bitki yapraklarındaki hava boşluklarının neden olduğu biyolojik görüntülerin bozulmasını en aza indirmektir. Yaprak sulu bir montaj ortamına monte edilirse ve bir florofor bir lazer tarafından uyarılırsa, turuncu ile gösterilen doku içindeki birçok doldurulmamış hava boşluğu ve kırılma indisindeki değişiklikler, elde edilen görüntüde dokunun derinliklerinden gelen sinyalin gücünü sınırlar. Yaprak bunun yerine floro deline veya PFD başına monte edilirse, floroforun ortaya çıkan lazer uyarımı daha az zayıflar ve yayılan sinyallerin daha iyi iletilmesine izin verir.

Sonuç olarak, PFD montaj ortamı ile taramalı lazer konfokal mikroskopinin kullanılması, sulu bir montaj ortamı kullanıldığında mümkün olanın iki katından daha fazla bir derinlikte bitki yaprağı içindeki canlı hücrelerin net görüntülerini verir. Bu tekniğin, yaprakların ve sulu ortamların sabitlenmesi veya monte edilmesi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, mezo dolgu içindeki kırılmayı azaltması ve sorunlu hale gelen yaprağın daha derinlerindeki canlı hücrelerin daha doğru görüntülenmesini sağlamasıdır. Bu yöntem, mezo dolgunun ele alınması, hücre biyolojisi ve in vivo sinyalleşme, yaprakların patojenler tarafından kolonizasyonu ve patojen dolgusu Etkileşimleri gibi bitki bilimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, ancak bu yöntem temel bitki biyolojisi hakkında fikir verebilir.

İçgörü spiralleri veya omurgalı akciğeri gibi hava sahası açısından zengin diğer yüksek derecede kırıcı dokulara da uygulanabilir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan Yaprak Dağı'na Dr.George Littlejohn olacak. PFD'deki numuneler, poli dimetil Sloane veya P-D-M-S-P-D-M-S'nin gaz geçirgen bir contası ile bir mikroskop lamı hazırlayarak başlar, deneysel gereksinimlere göre uyarlanmış bir oda sağlamak üzere kalıplanabilen viskoelastik bir polimerdir.

Hava dolu bir şişede küçük bir hacimde PFD'yi çalkalayarak PFD'yi hava ile dengeleyin. Bu, daha sonra PFD'den hava köpürtülerek, PFD'yi açık bir Petri kabına boşaltarak ve bütün bir fideyi veya tüketim yaprağını sıvı üzerinde beş dakika boyunca yüzdürerek de elde edilebilir. Doku, vitrifiye dokuyu anımsatan yarı saydam hale gelmelidir.

Yapraklar, aydınlatma koşullarına ve kullanılan dokunun yaşına bağlı olarak PFD'ye maruz kalmadan öncekinden daha koyu veya daha açık görünebilir. Son olarak, PDMS odasını aero eşitlenmiş PFD ile doldurun ve doku örneklerini inkübasyon Petri kabından PDMS odasına dikkatlice aktarın. Slaytı bir kapak, kayma ve resim ile kapatın.

Deneysel gereksinimlere göre, ay yaprakları rekombinant yeşil floresan proteini veya GFP'nin bir süspansiyonunda beş dakika inkübe edildi. PFD'de, PFD inkübe edilmiş yaprak örneklerinin mikroskobik incelemesi, hava boşluklarının çoğunun PFD'de asılı rekombinant GFP ile sular altında kaldığını göstermektedir. GFP yeşil renktedir ve kırmızı klorofil, loto floresansını temsil eder ve mezo dolgu hücrelerini delirir.

PFD ile inkübasyon sırasında yaprağın sular altında kaldığı açıktır, ancak ara sıra hava ceplerinin kalabileceği açıktır Su, bu koşullar altında yaprağı su basmaz. Burada, sitozole lokalize olan YFP'nin bir varyantı olan Venüs'ü ifade eden bir opsys yaprağı inkübe edilir ve hava, su veya PFD lazer taramasına monte edilir. Numunelerin konfokal mikroskobu, görüntüleme derinliğinde yaklaşık iki kat artışla PFD'nin hava ve suya göre bir avantajını göstermektedir.

PFD ve suyu karşılaştırırken Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş ila 10 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü uygularken, periferik delin'in oje ve Teflon'u çözdüğünü, ancak silikon gresi ile uyumlu olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bitki yapraklarının hücrelerinde görüntülemeyi iyileştirmek için fluro delin başına bir montaj ortamı olarak nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Unutmayın ki, floro delin başına toksik olmasa da, bu prosedürü gerçekleştirirken standart güvenlik uygulamalarının benimsenmesini öneririz.