Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu prosedürün genel amacı, yaprak içindeki canlı hücrelerin daha net görüntülerini elde etmek için bitki yapraklarındaki hava boşluklarının neden olduğu biyolojik görüntü bozulmalarını en aza indirmektir. Yaprak sulu bir montaj ortamına yerleştirilirse ve bir florofor lazerle uyarılırsa, turuncu ile gösterilen doku içindeki birçok boş hava alanı ve kırılma indisi değişiklikleri, sonuç görüntüsünde dokunun derinliklerinden gelen sinyalin gücünü sınırlar. Bunun yerine yaprak per florodelinen veya PFD ile monte edilirse, floroforun lazer uyarımı daha az zayıflar ve yayılan sinyallerin daha iyi iletilmesini sağlar.

Sonuç olarak, PFD montaj ortamı ile birlikte taramalı lazer konfokal mikroskobinin kullanılması, bitki yaprağı içindeki canlı hücrelerin, sulu bir montaj ortamı kullanıldığında mümkün olan derinliğin iki katından fazlasında net görüntülerini sağlar. Bu tekniğin fiksasyon veya yaprakların montajı ve sulu ortamlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mezofil içindeki kırılmayı azaltması ve yaprağın daha derinlerinde yer alan ve görüntülenmesi sorunlu olan canlı hücrelerin daha doğru şekilde görüntülenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem; mezofil, hücre biyolojisi ve in vivo sinyal iletiminin ele alınması, patojenlerin yaprakları kolonize etmesi ve patojen etkileşimleri gibi bitki bilimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve temel bitki biyolojisine dair içgörüler sağlayabilir.

Bu yöntem, aynı zamanda iç kulak sarmalları veya omurgalı akciğeri gibi hava boşluğu açısından zengin olan diğer yüksek kırılma indeksli dokulara da uygulanabilir. Bu prosedürü laboratuvarımdan Dr. George Littlejohnle birlikte To Mount Leaf örnekleri üzerinde göstereceğiz. PFD örnekleme işlemi, polidimetilsiloksan veya P-D-M-S'den oluşan gaz geçirgen bir conta ile mikroskop lamı hazırlayarak başlar; P-D-M-S, deneysel gereksinimlere uygun bir hazne sağlamak amacıyla kalıplanabilen viskoelastik bir polimerdir.

Küçük bir miktar PFD'yi hava dolu bir şişede çalkalayarak PFD'yi hava ile dengeleyin. Bu işlem, PFD içinden hava kabarcıkları geçirilerek de gerçekleştirilebilir; ardından PFD'yi açık bir Petri kabına boşaltın ve bütün bir fideyi veya kesilmiş bir yaprağı beş dakika boyunca sıvının yüzeyinde bekletin. Doku, vitrifiye dokuyu anımsatacak şekilde yarı saydam hale gelmelidir.

Işıklandırma koşullarına ve kullanılan dokunun yaşına bağlı olarak, yapraklar PFD maruziyeti öncesine göre daha koyu veya daha açık görünebilir. Son olarak, PDMS haznesini aero-eşitleştirilmiş PFD ile doldurun ve doku örneklerini inkübasyon Petri kabından PDMS haznesine dikkatlice aktarın. Lamı bir kapatma lamı ile kapatın ve görüntüleyin.

Deneysel gerekliliklere göre, aylık yapraklar beş dakika boyunca rekombinant yeşil floresan protein veya GFP süspansiyonunda inkübe edilmiştir. PFD mikroskobik incelemesinde, PFD ile inkübe edilmiş yaprak örneklerinin çoğundaki hava boşluklarının PFD içinde süspande olan rekombinant GFP ile dolduğu görülmektedir. GFP yeşil renktedir; kırmızı ise klorofili, otofloresansı ve mezofil hücrelerini temsil etmektedir.

PFD ile inkübasyon sonrası yaprağın tamamen sıvıyla dolduğu ancak yer yer hava ceplerinin kalabildiği görülmektedir. Bu koşullar altında su, yaprağı tamamen doldurmaz. Burada, sitozole yerleşen bir YFP varyantı olan Venus'ü eksprese eden opsys yaprakları; hava, su veya PFD içinde inkübe edilip yerleştirilmiş ve lazer tarama uygulanmıştır. Örneklerin konfokal mikroskobu, PFD'nin hava ve suya kıyasla, görüntüleme derinliğinde yaklaşık iki katlık bir artışla avantaj sağladığını göstermektedir.

PFD ve su karşılaştırıldığında, bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde beş ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, perflorodelinle nail varnish ve Teflon'un çözündüğünü, ancak silikon gresi ile uyumlu olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bitki yaprak hücrelerindeki görüntülemeyi iyileştirmek için bir montaj ortamı olarak perflorodelin kullanımını iyi bir şekilde kavramış olmalısınız.

Per fluoro delin toksik olmasa da, bu prosedür gerçekleştirilirken standart güvenlik uygulamalarının benimsenmesini önerdiğimizi unutmayın.