Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster
19 Aralık 2011
Özellikler için Fenotipik varyasyon cis-düzenleyici element (CRE) dizileri kontrol eden gen ekspresyonu mutasyonlar sonucu. Drosophila melanogaster kullanmak için türetilmiş yöntemler kantitatif değişiklikte ya da doğal olarak meydana gelen CRE türevleri aracılı gen ekspresyonu mekansal ve zamansal kalıplarının seviyelerini karşılaştırmak.
Bu prosedürün genel amacı, drosophila melan gastro metamorfik gelişimi sırasında aktif olan CIS düzenleyici elemanların veya CRE'nin gen düzenleyici aktivitelerini kantitatif olarak ölçmektir. Raportör transgenleri olarak Transgenik Olarak Dahil Edilmiş CRE hatları oluşturmak için sahaya özgü entegrasyon yöntemleriyle başlayın. Bir stereo mikroskop kullanarak, doğru gelişim aşamasının transgenik örneklerini elde edin.
Örnekleri dış bardan çıkarın ve bir cam mikroskoba monte edin. Konfokal mikroskobik analiz ile tüm montaj örneklerinde floresan raportör protein ekspresyonunun seviyesini ve modelini kaydetmek için slayta devam edin. Son olarak, Image J yazılım aracını kullanarak kaydedilen konfokal görüntüler için floresan raportör protein ekspresyonunun seviyesini ölçün.
Bu sonuçlar, düzenleyici unsura yardımcı olmak ve modifiye CRE versiyonları üzerinde daha fazla karşılaştırmalı gen ekspresyonu çalışmasını kolaylaştırmak için bir gen düzenleyici aktivite seviyesi atar. Bu prosedür, temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve gen düzenlemesi ve bu gen düzenlemesinin nasıl kodlandığı ile ilgilenir. DNA, gelişimsel ve evrimsel biyoloji gibi hissettiriyor.
Bu prosedür, drosophila melanogaster metamorfik gelişimi sırasında işlev gören cis düzenleyici unsurlar hakkında bilgi sağlamak için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, prensip olarak, diğer gelişim aşamalarında ve diğer meyve sineği türlerinde ve hatta diğer model organizmalarda işlev gören cis düzenleyici unsurlara uygulanabilir. Transgenik hatları genişletmek için, alternatif günlerde birkaç erkek ve dişi sinek içeren iki şişe ayarlayın.
Sinekleri şişelerden birinden yeni bir şişeye aktarın. Bunu bir hafta boyunca tekrarlayın. İki haftanın sonunda, transgenik meyve sineklerinin larvadan yetişkin gelişim aşamalarına kadar değiştiğini doğrulayın.
ER oluştuğunda üçüncü instar larva aşamasının sonunda örnekleri evrelemeye başlayın. Örneğin, hareket etmediğini unutmayın. ER yumuşatılmış beyazdır ve küreler bu zaman noktasını belirtmekten kaçınmıştır.
Sıfır HAPF olarak. Metamorfozun uzunluğuna bağlı olarak evreleme için yarı saydam daireler olarak görünen, vücudun orta noktasına yakın iki taraflı olarak yerleştirilmiş gonadların varlığı ile erkekleri dişilerden ayırt eder. Sıfır HAPF'de, numuneleri nemli bir boya fırçası kullanarak taze bir şişeye aktarın.
Örneklerin kurumasını önlemek için bir parça Kim mendili ekleyin ve suyla nemlendirin. Şimdi, şişeyi istenen HAPF'ye kadar 25 santigrat derecede inkübe edin. Alternatif olarak, eşlik eden metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çeşitli morfolojik belirteçlerin varlığının ve konumunun tanımlanmasına dayalı olarak sıralama yoluyla numuneleri hazırlayın.
Laboratuvar bandı ile, yapışkan bant yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon tahtasına bir parça ambalaj bandı yapıştırın. Bir boya fırçasını ıslatın ve bir boya fırçası kullanarak numunelere nem uygulayın. Örnekleri bir Kim mendiline aktarın.
Numuneleri koli bandına aktarın ve sırt yüzeyi yukarı bakacak şekilde yapıştırın. Numunelerin 15 dakika kurumasını bekleyin. Forseps kullanarak ER'yi aşamalı olarak açın.
Ön veya permadan başlayın ve arka uca doğru ilerleyin. Daha sonra pui'yi bir mikroskop lamı üzerinde bir damla viskoz yağa aktarın ve numuneyi tüm montaj numuneleri için mikroskobik olarak değerlendirin. Numuneyi odak noktasına getirmek için Forex veya 10 x objektifi kullanın.
Konfokal mikroskop yazılımını kullanarak, foto ağartmayı önlemek için istenen floresan proteini için uyarma dalga boyunu ayarlayın. %5 ila %10'luk bir lazer yoğunluğuyla başlayınSinyal yeterince rahatsız ediciyse, sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için yoğunluğu gerektiği kadar artırın. Konfokal görüntüler için, CRE aktivitesinin kantitatif karşılaştırmaları için kalman ortalaması gibi tekrarlanan taramalardan elde edilen piksel ölçümlerinin ortalamasını alan yazılım ayarlarını etkinleştirin, floresansın en yoğun göründüğü C-kesitini kullanır.
Bir doygunluk uyarısı arama tablosuna geçin ve kanal voltajı kazancını ayarlayın ve birkaç pikselin doygun olduğu ayarlara kaydırın. Gerekirse, konfokal açıklığı ayarlayın. En uygun ayarlar belirlendikten sonra, Z ekseni boyunca bir dizi görüntü elde etmek için ZS taramasını çalıştırın.
Tarama tamamlandığında, görüntü yığınını bir projeksiyona dönüştürün ve bu görüntü dosyasını TIF formatında kaydedin. CRE aktivitelerinin kantitatif karşılaştırması için, tüm replikasyon örnekleri ve raportör transgen hatları için aynı konfokal ayarları kullanın. Image J programı ile yapılan deney için, değerlendirilecek bir TIFF görüntüsü başlatıldı.
Serbest seçim düğmesine tıklayın ve numunenin miktar tayininin istendiği alanı ana hatlarıyla belirtin. Bir piksel değeri istatistiği almak için analiz sekmesine tıklayın ve ardından ölç'ü seçin. Sonuçlar kutusundan ortalama piksel değeri puanını kaydedin.
Ayrıca, CRE'nin etkin olmadığı bir arka plan bölgesinden ikinci bir ortalama piksel değeri toplayın. Ayarlanmış bir ortalama piksel değeri elde etmek için, çoğaltılmış örnekler için piksel değeri istatistikleri oluşturmaya devam edin. Ardından, replika ayarlanmış ortalama piksel değerlerinden, A CRE için ortalama düzenleyici aktiviteyi belirleyin ve ayrıca ortalamanın standart hatasını hesaplayın.
Bu deney, transgenik çizgileri homozigot yapmak için beyaz kurtarma gözü fenotipinin yoğunluğunu kullanır. Bölgeye özgü transgen entegrasyonu için A TTP iniş bölgesi dizisine sahip bir beyaz gen mutant genetik arka planı kullanılır. Entegre vektör için hemizigot ve homozigot olan transgenik bireyler, kurtarılan göz rengi fenotipinin yoğunluğu ile entegre mini beyaz genin kopya sayısı ile ayırt edilir.
Daha sonra en koyu göz rengi fenotipine sahip erkek ve dişi sineklerin çaprazlanmasıyla homozigot çizgiler oluşturulur. Larvadan yetişkin bir meyve sineğine metamorfoz sırasında drosophila için metamorfik aşamayı belirlemek için morfolojik belirteçler kullanılır. Örnek, cinsiyeti belirlemek ve gelişim aşamasını yaklaşık olarak belirlemek için kullanılabilecek bir dizi stereotipik morfolojiden geçer. Burada.
Dimorfik element olarak adlandırılan A CRE'nin vahşi tip bir versiyonu, dişi puy'un ASIC abdominal segmentinde yüksek seviyelerde EGFP raportör ekspresyonuna neden olur. Bu CRE içindeki bir 13 baz çifti dizisinin, DSX transkripsiyon faktörü için bir bağlanma bölgesi olduğu bulundu ve bu dizinin in vivo önemi, bu bağlanma bölgesi mutasyona uğradığında CRE için düzenleyici aktivitenin ölçülmesiyle gösterildi. Kantitatif analizler, bu DSX bölgesinin mutasyonunun, burada kullanılan transgen ekleme bölgesi bağlamında düzenleyici aktiviteyi, vahşi tip ifadesinin artı veya eksi %3'üne düşürdüğünü göstermektedir.
Benzer karşılaştırmalar, örneğin kadın segmentindeki EGFP seviyeleri ile karşılaştırıldığında, spesifik CRE alelleri için veya ayrı türlerden otolog CRE'ler arasındaki düzenleyici aktiviteleri değerlendirir. D Melin gastrik Canin S suşu tarafından sürülen bir altı, D türü için otolog CRE'ler, uyarıcılar ve D willi, sırasıyla 75 artı veya eksi %4 ve sıfır artı veya eksi %0'a eşit düzenleyici aktivitelere sahiptir. RNA interferansı gibi prosedür yöntemleri, bu transkripsiyon faktörü genlerinin CYS düzenleyici elemanlarla nasıl etkileşime girdiğine dair ek soruları yanıtlamak için transkripsiyon faktörü genleriyle birlikte kullanılabilir.
Bu, geliştirilmesinden sonra BDT düzenleyici unsurları tarafından yönlendirilen floresan raportör protein ekspresyonunun artması ve azalması ile gösterilecektir. Bu prosedür, gen regülasyonu alanındaki araştırmacıların, cis düzenleyici eleman motiflerinin ve evrimleşmiş mutasyonların gen ekspresyonu üzerindeki işlevsel önemini keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Drosophila melanogaster'in metamorfik gelişimi sırasında cis-düzenleyici elemanların (CRE'ler) gen düzenleyici aktivitelerinin nicel ölçümüne odaklanmaktadır. Yöntemler, gen ekspresyon paternlerini analiz etmek için raporer transgenler içeren transgenik hatların oluşturulmasını içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genetik
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Cis-düzenleyici elemanlar (CREs), gen ekspresyonunda önemli bir rol oynar.
- Fenotip değişimi, CRE dizileri mutasyonlarından kaynaklanabilir.
- Drosophila melanogaster, gen düzenlemesini incelemek için bir model organizma olarak hizmet eder.
- CRE'leri anlamak, gelişim süreçleri hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- CRE'lerin gen düzenleyici aktivitelerini nicel olarak değerlendirmek.
- Gen ekspresyonunun mekansal ve zamansal desenlerini karşılaştırmak.
- Modifiye edilmiş ve doğal olarak meydana gelen CRE varyantlarını analiz için kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Transgenik hatlar oluşturmak için yer özgü entegrasyon yöntemleri.
- Doğru gelişim aşamasındaki örnekler elde etmek için stereo mikroskop kullanımı.
- Floresan raporer protein ekspresyonunu kaydetmek için konfokal mikroskop.
- ImageJ yazılımı kullanılarak ekspresyon seviyelerinin nicellendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Raporer transgenler içeren transgenik Drosophila hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesi.
- Elinden edilen gen ekspresyon paternleri üzerine nicel veriler.
- Belirli CRE varyantlarının düzenleyici aktiviteleri hakkında içgörüler.
- Metodolojinin gen düzenlemesini incelemede etkinliğinin gösterimi.
Sonuçlar
- Çalışma, Drosophila'daki CRE aktivitelerini analiz etmek için bir çerçeve sağlamaktadır.
- Bulgular, gelişim sırasında gen ekspresyonu düzenlemesini anlamaya katkıda bulunmaktadır.
- Metodoloji, CRE'leri içeren diğer genetik çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cis-regulatory element (CRE) activity in transgenic Drosophila enables precise interrogation of gene regulatory logic, supporting early discovery and target validation in genetic and developmental research. This approach enhances predictive confidence in functional genomics by enabling direct measurement of regulatory sequence effects, facilitating risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. The method's adaptability across developmental stages and model organisms positions it as a reusable capability for enterprise-scale R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of CRE function and regulatory logic in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by measuring the impact of specific mutations or sequence variants.
- Facilitates comparative analysis of orthologous or allelic CREs to clarify functional conservation or divergence.
- Provides direct evidence for target validation through measurable gene expression outputs.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized, reproducible workflows for CRE-driven reporter assays using site-specific integration.
- Delivers quantitative, image-based readouts suitable for downstream screening or comparative studies.
- Enables assay scalability and platform reuse across different CREs, developmental stages, or species.
- Supports reliable evaluation of genetic perturbations or compound effects on regulatory activity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns regulatory sequence function with phenotypic outcomes relevant to disease models or trait variation.
- Provides continuity from discovery-stage regulatory analysis to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement by quantifying the functional impact of regulatory mutations.
- Supports translational biomarker development by linking CRE activity to observable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, supporting both mechanistic and translational research objectives.
- Discovery Biology: Quantitative CRE analysis clarifies gene regulatory mechanisms and de-risks target selection.
- Screening: Standardized reporter assays enable reproducible, quantitative comparison of regulatory variants.
- Analytics: Image-based fluorescence quantification provides robust statistical outputs for condition comparison.
- Translational Research: Functional CRE assessment informs biomarker alignment and disease-relevant model development.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across genetic backgrounds, developmental stages, and model organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible quantitative assays for regulatory element function.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early functional validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets and regulatory variants.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic model generation and confocal imaging analysis.
- Depends on access to site-specific integration systems and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various developmental stages, species, and regulatory sequences with protocol adjustments.
- Quantitative outputs are contingent on consistent imaging settings and statistical analysis across replicates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Obtaining and Staging Metamorphic Flies
2:49
Steps to Remove Specimen from Puparium
3:33
Confocal Microscopic Evaluation of Reporter Gene Expression in a Whole Mount Sample
4:49
Quantifying cis-Regulatory Element Activity with ImageJ
5:34
Utility of Quantitative CRE Activity
7:34
Conclusion
