Name: Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Keşfedin Rift Vadisi Ateşi virüsü MP-12 suşu NSs mutasyonlarını ters genetik yöntemiyle üretmeyi. Bu teknik, canlı zayıflatılmış aşı adaylarının geliştirilmesine katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hibe sayısı 5 Mükemmellik Batı Bölge Merkezi (WRCE) yoluyla U54 AI057156-07, 1 R01 AI08764301-A1 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Üniversitesi&#39;nde bir iç finansman Sealy Aşı Geliştirme Merkezi tarafından finanse edildi Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

RVFV için genetik sistemleri Ters T7 organizatörü 2,4,5 veya 3 fare veya insan 4 pol-I organizatörü kullanılarak çeşitli gruplar tarafından geliştirilmiştir. Bu yazıda, rekombinant RVFV MP-12 suşları, 15 stabil bir şekilde ifade T7 RNA polimeraz BHK/T7-9 hücreleri kullanarak oluşturmak için bir protokol açıklar. BHK/T7-9 hücrelerin durumuna göre farklılıklar viral geri kazanım verimliliği, plazmid miktarı, transfekte hücreleri ve benzeri numarası. Biz her zaman, deneyler için ...

<table border="1"><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM)-alfa </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun değiştirilmiş asgari temel orta </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modifiye Kartal Orta (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Cellgro </td><td> 30-240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Tryptose fosfat broth </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Noble Agar </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Aerosol sıkı kapak </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.33 nötral kırmızı çözüm </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF hücreleri </td><td> InvivoGen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin G </td><td> InvivoGen </td><td> Ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> ant-zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Quanti-Mavi </td><td> InvivoGen </td><td> rep-qb1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 hücreler 15 </td><td> Gifu Üniversitesi, Japonya </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero E6 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

rift vadisi ateşi virüsü aşı güvenliği ve etkinliği artırmak İçin mp-12 gerinim nss gen işleyin ters genetik kullanma

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Hemorajik ateş, nörolojik bozukluklar veya insanlarda körlüğe ve yüksek oranda kürtaj ve geviş getiren hayvanların 1 fetal malformasyon neden Rift Vadisi ateşi virüsü (RVFV), bir HHS / USDA seçin ajan ve 3 patojen bir risk grubu örtüşüyor olarak sınıflandırılmıştır. Bu, aile Bunyaviridae cinsi Phlebovirus ait ve bu ailenin en şiddetli üyelerinden biridir . 2006 yılından bu yana RVFV MP-12 aşı suşu 2,3 ZH548 ve ZH501 dahil olmak üzere yabani tip RVFV suşları 4-6, yanı sıra pek çok ters genetik sistemler geliştirilmiştir . MP-12 suşu (risk grubunda 2 patojen ve non-select ajan olan) birkaç kendi mutasyonlar M ve L-segmentleri oldukça zayıflatılmış, ancak hala fonksiyonel bir virülans kodlar öldürücü G-segment RNA 3 taşır faktörü, NSS. Effic çoğaltır rMP12 C13type (C13type) NSS ORF silme-kare% 69 taşıma, bilinen tüm NSS fonksiyonları yoksunient VeroE6 hücrelerinde MP-12 tip I IFN eksik yok. NSS, interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 dahil olmak üzere, ev sahibi transkripsiyon kapatma indükler ve post-translasyon seviyesinde çift sarmallı RNA-bağımlı protein kinaz (PKR) bozulması teşvik 9,10 IFN-beta transkripsiyonel IFN-alfa interferon düzenleyici faktör 3 (IRF-3), NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1), IFN-beta ve IFN-alpha/beta reseptör bağlayıcı (IFNAR) upregüle transkripsiyonu uyarır NSS IFN-beta gen dahil olmak üzere ana transkripsiyon bastırma viral replikasyon yanıt, bu ISGs gen upregulations engeller ise, ev sahibi antiviral aktivite gösteren genler veya diğer interferon uyarılan genlerin (ISGs) 11, rağmen IRF-3, NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1) RVFV7 tarafından aktif hale getirilebilir. . Böylece, NSS, daha da azaltmak için MP-12 ve IFN-beta bastırma fonksiyonu kaldırılarak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını barındıran geliştirmek için mükemmel bir hedef. Burada, Rekombinant bir MP-12 kodlaması mutasyona uğramış NSS üretmek için bir protokol tanımlayan ve IFN-beta mRNA sentezini bastırmak için fonksiyonu olmayan NSS mutantlar tanımlamak için bir tarama yöntemi bir örnek oluşturmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık önemli rol ek olarak, tip I IFN, dendritik hücreler ve adaptif immün yanıt 12-14 indüksiyon olgunlaşması için çok önemlidir . Böylece, NSS mutantlar tip I IFN inducing daha da zayıflatılmış, ama aynı zamanda onları aşılama yaklaşımlar için ideal bir aday yapar yabani tip MP-12, daha teşvik edici bir konak bağışıklık yanıtlarını daha verimlidir.

Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

İnsanlarda hemorajik ateş, nörolojik bozukluklar veya körlüğe; hayvanlarda ise yüksek oranda abortus ve fetal... neden olan Rift Vadisi ateşi virüsü (RVFV)...

Bu prosedür, ters genetik yöntemiyle mutasyona uğramış NSS kodlayan rekombinant Rift Valley ateşi virüsü MP 12 suşu üretmekte ve aşı geliştirme için fenotipleri karakterize etmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, T7 RNA polimerazı stabil olarak eksprese eden Bhk T7 hücrelerinde bir transfeksiyon sistemi kullanılarak rekombinant MP 12 suşu mutantları geri kazanılır; ardından geri kazanılan rekombinant MP 12 suşu mutantları Vero E6 hücrelerinde amplifiye edilir ve amplifiye edilen MP 12 mutantları plak deneyi ile titre edilir. Prosedürün son adımı, mutant NS proteinlerinin interferon alfa veya beta supresyonu eksikliği açısından taranmasıdır.Nihayetinde, elde edilen sonuçlar, bir ters genetik sistem aracılığıyla Rift Vadisi Ateşi için canlı atenüe aday aşıların hazırlanmasını kolaylaştırabilir. Bu tekniğin, kimyasal azot kullanımı veya seri pasaj yoluyla viral genoma rastgele mutasyonlar eklemek gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genetik sistem kullanılarak viral genoma hedeflenmiş mutasyonlar ekleyebilme yeteneğidir. Bu yöntem, aşı adaylarının immunojenitesinde temel etken olan NSS'nin önemi gibi vadi ateşi aşıları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Genellikle bu yönteme yeni başlayan kişiler zorluk çekeceklerdir çünkü rift valley fever virus, tıpkı form hedef bloklarında olduğu gibi, blokların görselleştirilmesi için optimize edilmiş bir teknik gerektirir. Viral geri kazanım ve hidratasyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve bu yönteme yönelik adım adım bir protokol rapor edilmediğinden, bu yöntemin görsel demonstrasyonu kritik öneme sahiptir. Altı santimetrelik kaplar kullanarak, T7 RNA polimerazı stabil şekilde eksprese eden T79 bebek hamster böbrek hücrelerini yerleştirin ve %70 ila 80 hücre konfluensine ulaştığında hücreleri bir inkübatöre koyun; medyumu higromisin B içermeyen tamamlayıcı MEM alpha ile değiştirin. Bir saat içinde rift valley fever virus geri kazanımı için transfeksiyon işlemine başlayın.Tam uzunlukta viral RNA ekspresyonu için viral genomik RNA'ları kodlayan bir plazmit seti ve viral protein ekspresyonu için viral gen Açık okuma çerçevelerini kodlayan ikinci bir set oluşturun. Şimdi 1,5 mililitrelik bir tüpe 385 mikrolitre Optum içine 30 mikrolitre transit LT one ekleyin. Kısa süre vorteksleyin ve beş dakika inkübe edin.Oda sıcaklığında, elde edilen lipozomları pipetleme yöntemiyle nazikçe karıştırılmış 10 microgram plazmit setlerine yavaşça ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin; ardından transfeksiyons karışımını damla damla bhk T seven nine hücrelerine ekleyin ve 24 saat boyunca inkübe edin. Kültür süpernatantını komple MEM alpha ile değiştirin ve dört gün daha kültürleyin. Kültür süpernatantlarını 50 milliliter'lik bir tüpe toplayın ve santrifüj ile hücre döküntülerini uzaklaştırın.Şimdi süpernatantları vidalı kapaklı beş mililitrelik kriyotüplere aktarın ve sonraki deneyleri kolaylaştırmak için bu P0 virüs stokunu -80 °C'de saklayın. P0 virüsünü interferon alfa ve beta genleri olmayan hücrelerde çoğaltmak için, komple DMEM içerisinde %80 konfluenceye ulaşmış Vero E6 kültürlerini büyütün, besiyerini seyreltilmiş P0 virüsü ile değiştirin ve bir saat boyunca inkübe edin.İnokülümü çıkarın ve Vero E6 hücrelerinin sitopatik etkisi belirginleşene kadar üç ila dört gün boyunca 10 mililitre komplet DMEM içinde kültüre edin. Supernatanı daha önce açıklanan şekilde hasat edin ve örnekleri E6 P1 olarak adlandırın; altı kuyucuklu plaklar kullanarak Vero E6 hücrelerini komplet DMEM içinde %80 konfluense ulaşana kadar büyütün. Vero E6 hücrelerindeki medyumu aspire edin ve E6 P1 virüs preparatının on katlık seri dilüsyonlarından 400 mikrolitre ekleyip bir saat boyunca inkübe edin.Bu sırada, agar overlay tüpü için iki adet 15 mililitrelik tüp hazırlayın. A tüpü yedi mililitre %1,2 noble agar (su içinde) içermelidir ve B tüpü yedi mililitre 2x complete MEM ve %10 trip dose fosfat tamponlu besiyeri içermelidir. Su banyolarında 15 dakika beklettikten sonra, B tüpünün içeriğini A tüpüne boşaltın ve bunları karıştırmak için bir pipet kullanın. Viral inokülümü, A ve B tüplerinin bire bir karışımından her kuyucuk için iki mililitre olacak şekilde değiştirin. Hücreleri üç ila dört gün boyunca kültüre etmeye devam edin.A tüpüne %1,2 noble agar, iki kat complete MEM ve nötral kırmızı ekleyerek auger kaplamasını hazırlayın; B tüpüne de aynısını ekleyin ve üçüncü bir tüpü nötral kırmızı olarak etiketleyin. A tüpünü 42 °C'lik bir su banyosuna, diğer iki tüpü ise 15 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ardından, A tüpünden 7 mL, B tüpünden 7 mL ve 0,5 mL nötral kırmızıyı birlikte karıştırın. Karışımdan 2 mL'lik miktarları altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa paylaştırın ve plağı gece boyu inkübe edin. Şimdi mililitre başına düşen platform oluşum birimlerinin sayısını belirleyin. C57 wild type fare embriyonik fibroblastları, NF kappa B ve IRF 3 veya 7 tarafından indüklenebilenle salgılanan bir embriyonik alkalen fosfataz geni kodlar.Burada, doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının tetiklediği sızıntı aktivitesini analiz ediyoruz; 12 kuyucuklu plaklardaki alt konfluent hücreleri, ya NS mutasyonları içeren rekombinant MP 12 ya da MP 12 kontrolü ile enfekte edip bir saat boyunca inkübe edin. İnokulumu uzaklaştırın, her kuyucuğa bir mililitre complete DMEM ekleyin ve 14 saat boyunca kültüre edin. Sızıntı analizi için kültür süpernatantlarını toplayın; 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 200 µL quantum blue ve her örnekten 50 µL ekleyin, plakayı kapatın ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Bir plaka okuyucu kullanarak 650 nanometrede OD'yi ölçün. Rift Valley ateşi virüsü, MP 12 suşunun NSS segmentine kıyasla SM ve L segmentleri olarak adlandırılan üç parçalı negatif anlamlı bir RNA genomuna sahiptir. C 13 tipinin açık okuma çerçevesi %69 oranında kısaltılmıştır. Genellikle, ters genetik sistem, mililitre başına 10⁶ PFU'dan daha yüksek titreye sahip canlı rekombinant MP 12 virüsleri ve C 13 tipi virüsler üretir.14 saatlik enfeksiyon sonrası, mock enfekte hücrelerle karşılaştırıldığında, N'S fonksiyonlarından yoksun olanlar büyük bulanık plaklar oluştururken MP 12 çeşitli boyutlarda berrak plaklar oluşturmuştur. MP 12 ile enfekte edilen C 57 vahşi tip meth hücreleri kültürde seep seviyesini artırmamaktadır.Buna karşılık, C 13 tipi enfeksiyon, enfeksiyon sonrası 14. saate kadar artan düzeyde sızıntıya neden olur; fare ISG 56 mRNA'sına özgü bir RNA probu kullanılarak yapılan northern blot analizleri, N'S ekspresyonu yokluğunda ISG 56 mRNA'sının yukarı regülasyonunu doğrulamaktadır. Fare immünizasyonu ve nötralize eden antikor testi gibi bir yöntem olarak bu prosedürün izlenmesi, NSS mutantının immünojenitesi gibi soruların araştırılmasını sağlayabilir. Bu teknik, Valley Ateşi alanındaki araştırmacıların, enfekte hücrelerde ve hayvanlarda yapısal olmayan gen fonksiyonlarını keşfetmelerine yol açmıştır.Bulaşıcı virüslerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle her zaman önlem alın. AOL'leri solumaktan kaçının. Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant MP 12 suşlarının nasıl geri kazanılacağı ve titre edileceği ile interferon alfa beta baskılama fonksiyonu eksik olan NSS mutantlarının nasıl taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik...

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

Burada, Japon ensefalit virüsünün pozitif sarmallı genomik RNA'sının tam uzunlukta bir cDNA'sını içeren bulaşıcı bir bakteriyel yapay kromozom oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, diğer pozitif sarmallı RNA virüslerinin işlevsel bir cDNA'sını oluşturmak için kullanılabilir, bu da onu virüs biyolojisini incelemek için güçlü bir genomik araç haline getirir.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Vaccinia virüsü (W), yaygın olarak biyomedikal araştırmalar ve insan sağlığının iyileştirilmesi kullanılmıştır. Bu makalede, bir CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak VV genom düzenlemek için basit, yüksek verimli bir yöntem açıklanır.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.

Rekombinant kuş Herpesvirus vektörleri ile CRISPR/Cas9 üreten gen düzenleme

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak "scarless" rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.

Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil

Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.

Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik

Keşfedin Rift Vadisi Ateşi virüsü MP-12 suşu NSs mutasyonlarını ters genetik yöntemiyle üretmeyi. Bu teknik, canlı zayıflatılmış aşı adaylarının geliştirilmesine katkı sağlar.

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Daha fazla video keşfet