İki Kurbağa Sperm Chemoattraction saptamak için Tahliller Türleri

Burada, iki bölmeli deney düzeneği kullanılarak sperm kemoatraksiyonunu değerlendirmek için iki farklı yöntem açıklanmaktadır. Aktive edilmiş kurbağa spermleri, öncelikle 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirilmiş, gözenekli membran tabanlı insertlere dağıtılır. Ardından spermler yerleştirildiğinde, bir kemoatraktan gradiyenti başlatmak için kuyucuğun tabanına dikkatlice bir kemoatraktan eklenir.

Ardından, hücrelerin kemotaktik gradyana yanıt olarak gözenekli membrandan geçmelerine zaman tanımak için spermler inkübe edilir. Son olarak, insert çıkarılır ve iki bölmeli deney düzeneğinde kuyruğun tabanına göç etmiş olan spermler hemositometre ile sayılır. Nihayetinde, sperm kemoatraktanlarının aktivitesi, örneğin zigman odası takip deneyi için doz-yanıt eğrisi analizi ile karşılaştırılabilir ve nicelendirilebilir.

Önce bir lamellen, silikon yağı kullanılarak zigman haznesine uygulanır ve mikroskobun dairesel açıklığının üzerine ters şekilde yerleştirilir. Ardından, haznenin bir tarafı aktive edilmiş kurbağa spermi ile doldurulur. Sonrasında, diğer taraf kemoatraktan çözeltisi ile doldurulur.

Beş dakika sonra kemotaktik gradyan oluşur ve bu aşamada, spermlerin gradyan boyunca yüzüşleri videoya kaydedilebilir. Nihayetinde, zigmund odası takip deneyinden elde edilen görüntüler, spermlerin hızını ve bir kemo atraktan gradyanına yanıt olarak spermlerin kemokinetik modellerini ve hareket yörüngelerini belirlemek için analiz edilebilir. Sperm kemotaksisini tespit etmeye yönelik bu iki yöntem birbirini tamamlayıcıdır ve farklı veri türleri üretirler.

İki odacıklı analiz, spermlerin gözenekli bir membrandan geçmesine olanak tanıyarak, kemotaktik bir çekiciye karşı sperm yanıtının miktarının belirlenmesini sağlar. İki odacıklı analizin görsel gösterimi kritiktir; çünkü başlangıçtaki sperm ve kemotaktik çekici ekleme adımları ile sondaki sperm ve insertlerin çıkarılma adımları, mikro pipetin hassas bir şekilde konumlandırılmasını gerektirir. Zigmund odacığı analizi, bir kemotaktik gradyanda yüzen spermleri kaydetmek için video kullanır.

Bu, hız ve yön gibi dinamik parametrelerin belirlenmesine olanak tanır. Zigmund odası takip analizinin iki odalı analize göre temel avantajı, sperm yüzmesinin bir dizi dinamik parametre ile görselleştirilebilmesi ve analiz edilebilmesidir. Bir ucuna delikler açarak ve karşı ucundan şırınga ve iğne ile tampon çözelti enjekte ederek spermleri kurbağa testisinden yıkayarak çıkarın.

Sperm hücrelerini kurbağa testislerinden yıkadıktan sonra, toplanan hücre sayısını hemositometre ile tahmin edin. Ardından, stok sperm süspansiyonunu, mililitre başına 2 × 10⁷ hücrelik bir sperm yoğunluğu elde edecek şekilde oosit Ringer tamponu ile seyreltin. Beş mikrolitre spermi F1 tamponu ile 1:10 oranında seyreltip hareketleri faz kontrast optiği kullanarak gözlemleyerek sperm motilitesini değerlendirin.

Sıradaki mikro pipet ile, plastik 24 kuyucuklu doku kültürü plağının her bir kuyucuğuna 700 µL F1 tamponu ekleyin. Ardından, gerçekleştirilecek her bir analiz için, sperm motilitesini osmotik şok ile aktive etmek amacıyla, 100 µL sperm süspansiyonunu oda sıcaklığında bir mikro santrifüj tüpünde 900 µL F1 tamponu ile seyreltin. 12 mm dış çaplı ve 12 µm gözenek boyutlu bir inserti, tamponla dolu bir kuyucuğun içine, insert yerleşiminin merkez dışı olduğundan ve bir kenarda boşluk kaldığından emin olarak yerleştirin.

Ardından, uç kısmıyla kesilmiş bir mikropipet kullanarak 400 µL hareketli aktif spermi derhal kuyucuğa aktarın; sperm süspansiyonunu insertin duvarına uygulayarak insertin altındaki filtreye doğru akmasını sağlayın. Sonra, kemoatraksiyon ajanının 50 µL'sini plakanın her bir kuyucuğundaki kuyucuk ile merkez dışı insert arasındaki boşluğa dikkatlice mikropipetle ekleyin.

Damlanın, kuyucuğun yan duvarı ile tabanının birleştiği noktaya bırakılmasına dikkat edin. Pipeti, sisteme herhangi bir rahatsızlık vermeden geri çekin. Tüm analizler hazırlandıktan sonra.

İlk başlatılan analizin inkübasyonu 50 dakika tamamlanana kadar plakayı oda sıcaklığında bekletin. Ardından, ilk analizden sonra, inserti bir elinizle dikkatlice sabitleyin. Üst bölmedeki sperm süspansiyonunun çoğunu veya tamamını mikro pipetle çekerek analizi durdurun.

Sperm üst hazneden aktarıldıktan sonra, eki hemen çıkarın ve atın. Şimdi, dibe çöken spermleri tekrar süspansiyona getirmek için her kuyucuktaki sperm süspansiyonlarını karıştırın. Ardından, her kuyucuktaki sperm süspansiyonunun tamamını ayrı mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Son konsantrasyonu %0,5 hacim/hacim olacak şekilde formaldehit ekleyin. Her tüpteki fikse edilmiş spermleri çöktürün. On saniyelik basmalı düğmeyi kullanarak, kişisel bir mikrosantrifüjde döndürün.

Ardından, her tüpteki süpernatantın 100 µL'si hariç geri kalanını uzaklaştırın ve peleti bu hacimde yeniden süspande edin. Sonra, sperm süspansiyonundan 20 µL alarak distile su ile 1/10 oranında dilüe edin ve spermleri bir hemositometre ile sayın. Dik bir mikroskobun 40x objektifi kullanılarak gerçekleştirilen iki bölmeli analiz, doz-yanıt çalışmaları veya çekiciler arasındaki karşılaştırmalar için uygun olan kantitatif sonuçlar sağlar.

Örnekte, kurbağa yumurtası suyu, kırmızı sembollerle gösterildiği gibi sperm çeken bir kemoatraktan içerir. Sperm kemoatraktan dozu artırıldığında, yumurta suyu gözenekli membrandan geçen sperm sayısında önce bir artış ve ardından bir azalma meydana getirir. Buna karşılık, beyaz sembollerle temsil edilen sığır serum albümini, aynı doz aralığında çok az etki göstermiştir.

Zigman odası deneyi başlamadan önce, ters mikroskop istasyonunun video kaydı için hazır olduğunu onaylayın. Mikroskobu kurun. Saniyede yedi kare görüntü almak için kamera kontrol yazılımını başlatın.

Kameranın gözlem platformuna odaklandığından ve görüntünün bilgisayar monitörüne gönderildiğinden emin olun. Ardından, mikroskobik alanın gözlem platformu genişliğinin büyük kısmını veya tamamını kapsadığını kontrol edin. Daha sonra, oosit ringer tamponu içerisinde bir kurbağa sperm süspansiyonu ve F1 tamponu ile uygun konsantrasyona seyreltilmiş bir kemoatraktan hazırlayın ve her ikisini de kullanıma kadar buz üzerinde saklayın.

Ardından, temiz ve kuru bir zigmund haznesiyle başlayın. Her bir trth'nin dış kenarından yaklaşık beş milimetre uzaklıkta ve kenara paralel olacak şekilde, mikropipet kullanarak yaklaşık dört µL silikon yağı şeklinde bir hat oluşturun. Daha sonra, silikon yağının her bir trth'nin dış kenarına eşit şekilde yayılmasını sağlayarak, haznenin üzerine 22 x 40 mm'lik bir kapatma camı yerleştirin.

Şimdi hazneyi ters çevirin ve mikroskop tablasındaki büyük dairesel açıklığın üzerine yerleştirin. Kapatma camının tablaya temas etmediğinden emin olarak, oda sıcaklığında 1:10 oranında F1 tamponu ile karıştırarak oosit ringer tamponu içindeki xap sperminin 20 µL'sini aktive edin. Ucu kesilmiş bir mikropipet kullanarak, motilitesi aktive edilmiş spermden derhal 70 µL çekin.

Ardından mikropipet düşük bir açıyla tutularak uç yan açıklığa yerleştirilir. Kılcal hareket yoluyla trth ve köprü doldurulur. Daha sonra, xap spermlerinin sınırlı bir hareketlilik ömrü olduğu için, karşı trth de aynı şekilde bir kemoatrakte solüsyonu kullanılarak doldurulur.

Üç dakika içinde video kaydına başlayın ve beş dakika boyunca devam edin. Zigman odacığı takip analizi, kemoçekici bir gradyan içinde yüzen spermlerin video mikroskobisi ile incelenmesine olanak tanır. Bu film, gözlem platformunda yüzen spermlerin kaydını göstermekte olup, yörüngeleri bu diyagramda gösterildiği gibi kırmızı ile izlenmektedir.

Sperm yörüngeleri, her biri bir okla belirtilen ve ardışık video kareleri arasındaki sperm hareketini temsil eden segmentlerden oluşur. Yörünge segmentleri, bireysel spermlerin yüzme davranışlarını ortaya çıkarır ve daireler ile dönüşler gibi kalıpları vurgular. Bu veriler kullanılarak, her bir segmentin hızı ve yönü veya bir yörüngedeki ya da bir yörünge grubundaki tüm segmentlerin özellikleri belirlenebilir.

Örneğin, net doğrusal mesafe. Bir yörüngenin başlangıcını sonuna bağlayan vektörün bir x ekseni bileşeni vardır ve burada kırmızıyla gösterildiği gibi x ekseniyle theta açısı yapar; bir kemoatraktan gradyanı mevcut olduğunda theta azalmalı ve x ekseni boyunca kat edilen mesafe artmalıdır. Bu değişiklikler, spermlerin kemoatraktana doğru, gradyan boyunca yukarıya doğru yüzme eğilimi gösterdikleri anlamına gelir. Her iki analizle de çalışırken, sperm ve kemoatraktanın her bir cihaza uygun şekilde yüklenmesine dikkat edilmesinin, sperm performansında tekrarlanabilir kemotaktik gradyanlar elde etmek için kritik olduğunu unutmamak önemlidir.