Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Bu videoda, kinaz ve fosfataz aktiviteleri, Forrester Rezonans Enerji transferi veya perde kullanılarak hücre döngüsü boyunca izlenmektedir. Burada, kinaz benzeri bir polo veya LK bir aktivite probunun bir ucuna yerleştirilmiş camgöbeği floresan proteini CFP'ye ve diğer ucuna yerleştirilmiş sarı floresan proteini YFP'ye sahiptir. Bu prob U2 OS hücrelerine transfekte edilir.

Daha sonra, G iki iki M geçişi sırasında LK bir hedefin fosforilasyon durumunu incelemek için, TRANSFECTED U2 OS hücreleri zaman atlamalı floresan görüntülemeye tabi tutulur. OBP ve YFP yakın olduğunda ve CFP uyarıldığında, enerji YFP'ye aktarılır ve YFP kabulü tespit edilebilir. Bununla birlikte, prob fosforile olduğunda, proteindeki doğrulayıcı bir değişiklik CFP ve YFP'yi ayırır.

Şimdi, CFP uyarıldığında, güçlü bir CFP emisyonu ve sadece zayıf bir YFP emisyonu tespit edilir, hem CFP hem de YFP uyarımından sonra YFP emisyonunun oranının ölçülmesi, PLK bir aktivitesinin G iki'de arttığını ve mitoz sırasında zirve yaptığını gösterir. Bu nedenle, bu tekniğin standart geometrik filmleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücre döngüsünün filme alma koşulları veya bir probun ifadesi tarafından bozulmamasına özel dikkat gösterilmesidir. Bu yöntem, belirli kinazların veya fosfatazların nerede ve ne zaman aktive edildiği gibi hücre döngüsü alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, hücre döngüsü tarafından düzenlenen enzimler hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre proliferasyon deneyleri gibi unres koşullarının gerekli olduğu diğer sistemlere de uygulanabilir. İnsan hücre döngüsünü izlemek için, U2 OS hücreleri fret tabanlı bir PK bir aktivite probu ile transfekte edilir. Standart bir kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi kullanılarak, hücreler en az yedi gün boyunca saf misin içinde seçilir.

Bu, probu ifade eden hücre popülasyonunu zenginleştirir ve hücre döngüsünü ciddi şekilde etkileyen toksik ekspresyon seviyelerine veya ekspresyon seviyelerine sahip hücre sayısını sınırlar. Kararlı klonlar daha sonra CFP'nin sınırlı seyreltme ekspresyonu ile seçilir ve daha sonra YFP, tüm hücrelerde yaklaşık olarak aynı oranda bulunduklarını doğrulamak için incelenir. Bazı hücreler sadece CFP içeriyorsa veya bu durumda muhtemelen YFP rekombinasyonu meydana gelmişse, homolog rekombinasyona daha az eğilimli bakteriler kullanarak plazmit preparatını tekrarlayın, örneğin iki hücre daha sonra plazmidi doğrusallaştırır ve transfeksiyonu tekrarlayın.

Hücreler probu stabil bir şekilde ifade ettikten sonra, bağlandıktan ve %30 ila 50 birleştikten sonra 1,5 numaralı cam tabanlı tabaklara tohumlayın. Ortamı CO2'den bağımsız ve fenol kırmızısı içermeyen bir ortamla değiştirin, hücreleri motorlu bir epi floresan mikroskobuna monte edin, Sıcaklık kontrolü 37 santigrat dereceye ayarlanmışken. Mikroskop, CFP ve YFP uyarma ve emisyon filtreleri ile donatılmalıdır.

CFP ve YFP'yi izlemek için uygun bir ROIC aynası ve gerekli çözünürlük için uygun bir objektif. Burada 20 x NA 0.75 hava hedefi kullanılır. İletilen ışığı kullanarak hücreleri odak noktasına getirin.

Bu noktada floresan ışığı kullanmayın çünkü hücre döngüsünü bozabilecek bir stres tepkisine neden olur. Fototoksisiteyi önlemek için, bükülmeyi gerekli hücre altı çözünürlüğe izin veren mevcut maksimum değere ayarlayın. Bu deney için çekirdeği ve sitoplazmayı ayırt etmek mümkün olmalıdır.

Kısa bir pozlama süresi ayarlayın ve yüksek nötr yoğunluklu bir filtre yerleştirin. Ardından 12 veya 16 bitlik bir test görüntüsü elde edin YFP uyarma ve emisyonunu kullanarak, pozlama süresini ve nötr yoğunluk filtrelerini, bir hücredeki ortalama yoğunluk yaklaşık olarak arka plan yoğunluğuna ve minimum ve maksimum arka plan yoğunlukları arasındaki farkın beş katına eşit olacak şekilde ayarlayın. Görüntülerin doygun olmadığını doğrulamak için, örnek görüntünün floresan yoğunluğunu inceleyin.

Hücreler mitoza girdiğinde yoğunluk farklılıklarına izin vermek için görüntüdeki maksimum yoğunluk dinamik aralığın yarısından az olmalıdır. Ardından, CFP uyarma ve YFP emisyon filtrelerini kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Pozlama koşullarını odaklamak ve optimize etmek için kullanılan bölgeler hariç olmak üzere, kesitli hücrelere sahip birden çok bölge seçin.

Bu prosedürler bir stres tepkisi başlatmış olabileceğinden, maksimum yoğunluğun tüm hücrelerdeki dinamik aralığın yarısından daha az olduğundan emin olun. Yazılıma, YFP uyarımı, YFP emisyonu ve CFP uyarımı kullanarak her 45 dakikada bir iki görüntü elde etmesi talimatını verin. YFP emisyon filtreleri.

Ayrıca, deneyin toplam uzunluğunu hücre döngüsünün süresini aşacak şekilde ayarlayın. Her şey ayarlandıktan sonra, alım tamamlandıktan sonra görüntü almaya başlayın, alınan görüntüleri açın ve mitozdan mitoza kadar hücre döngü süresini izleyin. Burada transfekte edilmiş probu eksprese eden hücreler için, hücre döngü süresi kabaca 20 ila 25 saatti.

Bunu, kullanılan hücre tipinin kontrol verileriyle karşılaştırın. Hücre döngü süresi referans zamanlamalarına karşılık geliyorsa, fret analiz edilebilir. Zamanlama doğrulandıktan sonra görüntüler analiz edilebilir.

Analiz, mikroskopiye adanmış çoğu yazılım tarafından gerçekleştirilebilir. Burada, image j freeware rate plus eklentisi ile birlikte kullanılır. Görüntüleri Görüntü J'de açarak analize başlayın.Görüntüler çok renkli yığın biçimindeyse, tek tek kanalları bir hiper yığına dönüştürerek ayırın Görüntü seçerek.

Sonra hiper yığın, ardından yığın hiper yığına. Hiper yığına dönüştür penceresi açılır ve ayarlar görüntülenir, Tamam'ı tıklatın. Görüntü şimdi altında iki kaydırma çubuğu ile görüntülenecektir.

Görüntüleri tek kanal yığınlarına bölmenin yanında, görüntüye tıklayın ve hiper yığın boyutsallığı azalt'ı seçin. Bu, küçültme penceresini açacak, çerçevelerin ve kaynağı koru'nun seçili olduğundan emin olacaktır. Ardından Tamam'ı tıklayın.

Yalnızca bir kanal içeren yeni bir görüntü görünecektir. İkinci kanalla yeni bir görüntü elde etmek için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, son görüntülerin görsel netliğini artırmak için YFP uyarma YFP emisyon yığınını seçin.

İşleme tıklayın, ardından matematiğe tıklayın. Ardından çarpın Çarpma penceresi açıldığında, YFP uyarma YFP emisyon yığınını üç ile çarpmak için üç girin. Adım isteğe bağlıdır ve oranların sıfır ile bir arasında olmamasını sağlar.

Ardından, görüntü J araç çubuğunda, serbest el aracını seçin. Daha sonra YFP uyarımında, YFP emisyon yığınında, hücrelerden yoksun, ancak yatırım getirisini ROI yöneticisine eklemek için ölçülecek bir hücreye yakın olan bir alanda bir ilgi alanı veya ROI çizin, analiz araçlarına tıklayın. Ardından ROI yöneticisi.

ROI yöneticisi penceresi görünecektir. YFP uyarma YFP emisyon yığınındaki ROI'nin ortalama yoğunluğunu ölçmek üzere ROI koordinatlarını kaydetmek için ekle'ye tıklayın. Analiz et'e tıklayın, ardından ölç'ü seçin.

Sonuçlar penceresi açılacaktır. CFP uyarma YFP emisyon yığınını seçin. Ardından ROI yöneticisinde ROI'ye çift tıklayın ve ölçümü tekrarlayın.

Ölçüm, sonuçlar penceresine eklenir. Bu işlemi birden çok zaman noktasında tekrarlamak için yığındaki diğer yerlere kaydırın. Sonuçlar penceresindeki ölçümleri karşılaştırarak, ilgilenilen hücreye yakın arka plan yoğunluklarının film boyunca benzer olduğunu doğrulayın.

Ölçümleri minimum yoğunluğu içerecek şekilde ayarlamak için analize tıklayın, ardından ölçümleri ayarla'ya tıklayın ve minimum ve maksimum gri değeri belirtin. Daha sonra ölçüm alternatiflerini gösteren bir pencere açılacaktır. Parlaklığı ve kontrastı gerektiği gibi ayarladıktan sonra, bir hücrenin çoğunu kaplayan bir ROI çizin ve her iki yığındaki minimum yoğunluğu ölçün.

Ardından, bu sefer arka plan yerine bir hücre kullanarak daha önce olduğu gibi ölçümler yapın. Sonuçlar bölümlerindeki değerleri kullanarak, ölçülen minimum yoğunluk ile arka plan yoğunluğu arasındaki farkı hesaplayın ve ikiye bölün. Bu, bir kırpma değerinin açılma oranına ve belirli eklentilere göre bir başlangıç tahmini sağlar.

Sonra oran artı. Daha sonra perde oranı için, CFP uyarma YFP emisyon S yığınını seçin veya fosforilasyon üzerine perde verimliliğinin azaldığı probları görselleştiren ters fret oranı için seçin. Ölçülen arka plan yoğunluklarını ve kırpma değerlerini eklemek için YFP uyarma YFP emisyonu S yığınını seçin.

Sonuç penceresindeki değerleri kullanın ve bunları oran artı penceresine yapıştırın. Elde edilen oran yığınının ölçeklemesini ayarlayın ve oran değişikliklerini görselleştirmek için uygun bir arama tablosu uygulayın. PLK bir aktiviteyi izleyen fret tabanlı bir prob eksprese eden U2 OS hücreleri, bu videoda anlatıldığı gibi 60 saat boyunca filme alındı.

Bu görüntü, yavru hücrelerin bölünmeleri de dahil olmak üzere 50 fret prob eksprese eden hücrenin kümülatif mitotik girişini göstermektedir. Probu eksprese eden hücrelerin çoğu, 20 ila 25 saat arasında bir hücre döngüsü süresi ile çoğalır, bu da probun görüntüleme koşullarının ve ekspresyon seviyelerinin hücre döngüsü zamanlamasını etkilemediğini gösterir. Bir hücreyi dört bölünme boyunca takip eden ters çevrilmiş fret oranının yanlış bir renk temsili, önemli ölçüde gürültü olmasına rağmen, PK bir aktivitesinin G iki'de arttığı ve mitoz sırasında zirve yaptığı bir eğilimin görüldüğünü göstermektedir.

Ham veriler ortalama filtrelendiğinde ve bir grafik olarak sunulduğunda, etkinlik zirveleri arasındaki süreyi tahmin etmek kolaydır. Bu şekil, grafikten önceki görüntülerde gösterilen hücrenin ters çevrilmiş perde oranının nicelleştirilmesini göstermektedir. Aktivasyonun zamanlaması tahmin edilebilir ve burada görülebileceği gibi, probun fosforilasyonu, fosforilasyonun mitozda zirve yapmasından yaklaşık dört saat önce görünür hale gelir.

Bu prosedürü denerken, hücreleri stressiz bir durumda tutmak önemlidir, bu nedenle bu, ışığa maruz kalmayı en aza indirerek ve sıcaklık veya pH'daki değişiklikleri en aza indirerek yapılır. Bu yöntemin bir hücredeki kinaz ve fosfataz aktivitesi arasındaki dengeyi izlediğini hatırlamak da önemlidir. Bu prosedür, bu kinazların ve fosfotaların yukarı akış düzenleyicilerini tanımlamak için RNA girişimi veya inhibitör ekranları ile birleştirilebilir.