Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Bu deneysel yöntem, floresan bazlı yöntemler kullanılarak kanser ve iskelet kası hücrelerinde mağaza tarafından işletilen kalsiyum girişinin veya SOCE'nin özelliklerini ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu, hücre içi kalsiyum konsantrasyonuna duyarlı olan canlı hücrelerde URA iki'nin floresansının kaydedilmesiyle elde edilir. Ek olarak, kalsiyum konsantrasyonuna duyarsız dalga boyunda manganez ilavesiyle floresan söndürme oranı ölçülür, bu da SOCE'yi incelemek için SOCE'nin aktivasyonunu doğrudan yansıtır.

Yapısal olarak özelleşmiş iskelet kası hücrelerinde kaslar parçalara ayrılır ve derisi yüzülür. Kas lifleri hazırlanır. Lifler daha sonra düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri ile muamele edilir ve iç floresansları izlenir.

Bu yöntemler, SOCE'nin hem uyarılamayan hücrelerde hem de iskelet kaslarında kademeli aktivasyon ve hücre içi kalsiyum deposu içeriğine sıkı bağlanma ile var olduğunu göstermektedir. Bu floresein bazlı tekniğin elektrofizyoloji, yama klanı gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, kullanımının uygun olması ve hücre popülasyonu çalışmasına veya yüksek verimli taramaya uygulanabilmesidir. Ritüel metrik ortam ve mag koni testi için doğru estetisyen S'yi kullanmak önemlidir.

Bu nedenle, her bir cihazın kalibrasyonu çok önemlidir çünkü her cihaz farklıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi, tek kas liflerinin mekanik deri işleminin öğrenilmesi zor olduğundan, özel bir uygulamalı eğitim, mikro diseksiyon tekniklerinin derinlemesine anlaşılması ve öğrenilmesi, dikkatli gözlem ve gerçekten iyi bir hasta dozu gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir. Kalsiyum bağlama ve kalsiyum üç URA iki için uyarma dalga boyları üç 40 ve üç 80 nanometre olmasına rağmen, kalsiyum ölçümü için URA iki'nin en iyi oran dinamik aralığı, belirli bir mikroskop sistemindeki diğer dalga boylarında ortaya çıkabilir.

Dalga boylarındaki bu tür kaymalar, ek çeşitli optik bileşenlerle optik yoldaki değişikliklerden kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, her sistem için ISO spastik noktası da değişir. Bu nedenle, bu dalga boylarını spektrum taraması ile belirlemek önemlidir.

Alternatif olarak, Ming taraması, nihai değer kalsiyum konsantrasyonundan bağımsız olacak şekilde herhangi iki dalga boyunda sadece bir floresan ile kaydedilebilir. Kültürlenmiş K Ys SE bir 50 hücreyi, RFP'yi eksprese eden ve 48 saat boyunca HRNA'ya karşı spesifik olarak veya I birine veya karıştırılmış bir dizi içeren plazmitlerle transekte ederek başlayın. Kesilmiş hücreleri cam tabanlı tabaklarda büyütün.

Daha sonra ortamı çıkarın ve hücreleri dengeli bir tuz çözeltisi veya BSS ile durulayın. Durulamadan sonra, iki mikromolar RA 2:00 içeren bir mililitre BSS ekleyin ve tabağı 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede tutun. Hücre içi URA 2:00 formunun URA ikiye dönüşmesine izin vermek için hücreleri 15 dakika oda sıcaklığına koyun.

Daha sonra plakayı mikroskop altında BSS ile iki kez yıkayın. Görselleştirme modunda, RFP'yi ifade eden hücreleri seçin. Emisyon dalga boyu 510 nanometre ve uyarma dalga boyları 350 ve 390 nanometre olarak ayarlanmış uyarma oranı modunu seçin.

Oran üçüncü pencerede görüntülenir. Ardından, kaydedin. Seçilen hücreler önceden belirlenmiş dalga boylarında floresan yayılırken, hücreler dört farklı çözelti ile perfüze edilir.

Benzer şekilde, KYSE bir 50 hücresi ferra two ile yüklenir ve kayda tabidir. Uyarma oranı modunda, önceki prosedürden farklı olarak, ISO spastik nokta 360 nanometre, uyarma dalga boyu olarak seçilir. Ardından, hücreler beş farklı BSS çözeltisi ile parfümlenirken floresansı 360 ve 390 nanometrede aynı anda kaydedin.

Bu protokol için, C iki C 12 hücresi, bir fare miyojenik hücre hattı, cam tabanlı tabaklar üzerinde birleşene kadar kültürlenmeli ve daha sonra% 2.5 at serumu içeren farklılaşma ortamında miyo tüplerine farklılaştırılmalıdır. C iki C 12 myo tüpünü BSS çözeltisinde son konsantrasyonu beş mikromolar RA 2:00 ile yükleyin ve 40 dakika inkübe edin. Daha sonra, kas kasılmalarını ve bunların neden olduğu hareket artefaktlarını inhibe etmek için 20 mikro azı dişi ve benzo p toluen smide veya BTS'den oluşan son bir konsantrasyon ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve tüm çözeltilerde BTS olarak kalın. Sonraki yük dört. Tuz çözeltilerini perfüzyon sistemine dengeleyin.

Daha önce açıklandığı gibi. Her bolluk sırasında, seçilen hücrelerin floresansını 360 ve 390 nanometrede kaydedin. Bu seride, magnezyum iyonunun söndürülmesini izlemek için magnezyum ve thap argen birlikte uygulanır.

Endoplazmik retikulum kalsiyum depoları tükenirken. Ekstansör digitorum longus veya EDL kasını incelemek için, ötenazi yapılmış bir farenin bacağını yanal olarak konumlandırın ve cildi ayak bileği bölgesinden dize kadar çıkarın. EDL'yi ortaya çıkarmak için dokudaki yüzeysel kas katmanlarını kesin ve sağlam EDL kasını serbest bırakmak için hem üst hem de alt tendonları kesin.

Tendonların uzunluğunu mümkün olduğu kadar uzun tutmak önemlidir. Şimdi herhangi bir kasılmayı önlemek için, EDL'yi stereo mikroskop altında 0.1 milimolar EGTA içeren ve kalsiyum içermeyen bir T yol solüsyonuna aktarın. Diz yerleştirme tendonlarını iki yarıya zorlayın ve EDL kasını iki demete bölün.

Sekiz demet elde edilene kadar işlemi tekrarlayın. Herhangi bir demetten tendonlar kaybolursa, demeti atın. Daha sonra, bir EDL demeti şeridinin her iki tendonunu da kavrayın ve şeridi, her iki tarafta tendon dokusu ile birlikte üç veya dört ayrılmış Tek kas lifi bozulmadan kalana kadar dikkatlice gerin.

Cam tabanlı bir tabağa bir damla kalsiyum içermeyen tyro tamponu koyun. EDL şeritlerini düz bir şekilde tabağın üzerine yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla çözeltiyi hızlı bir şekilde çıkarın. Ardından, suya dayanıklı bant kullanarak her iki tendonu da sıkıca bantlayın.

Lifi önce kalsiyumsuz solüsyonla, ardından iki kez 2.5 milimolar kalsiyum solüsyonuyla yıkayın. Lif hiper kasılır ve hasar fark edilirse, lifi atın, seçilen sağlıklı kas liflerini bir numaralı yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın ve ardından beş dakika boyunca modifiye edilmiş hücre içi deri kaplama solüsyonunda yıkayın. Bir pim tutucuya tutturulmuş bir tungsten iğnesi kullanarak, elyafı bir stereo mikroskop altında mekanik olarak kaplayın, lifler enine tübüllerde kalsiyum ile konjuge edilmiş beş n yolu yeniden mühürleyecek ve hapsedecektir.

Sağlam tek sağlam kas lifleri veya en azından bu tür liflerin hala bir miktar tendonu olan demetlerini elde etmek, bence, bu liflerin son deney odasına her zaman çok zor olan transferinin izlediği en zorlu adımlardan biridir. Bu işlem sırasında lifler aşırı büzülebilir veya bu işlem sırasında kırılabilirler. Bu nedenle, sağlıklı liflere sahipseniz, mekanik cildin kendisi SR'yi yüklemek çok daha kolay olacaktır. Lifleri ve kaplama solüsyonunu 20 mikromolar akışla beş N inkübe edin.

Boyanın tamamen esterleştirilmesini sağlamak için kapsamlı yıkama ve iki numaralı yıkama solüsyonu ve 30 dakikalık ek inkübasyon ile inkübasyonu takip edin. Lifler daha sonra ilgilenilen bölgelerden 60 x objektifli bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilebilir. Elyaf SR yükleme SR Tükenme çözeltileri ile perfüze edilirken her boyanın floresansını aynı anda kaydedin.

KYS, SE bir 50 hücredeki SOCE aktivitesi, hücre içi kalsiyum ölçümü kullanılarak incelendi. Hücreler, RFP ve kısa bir saç tokası ile kodlandı, RNA, OR I'a karşı bir geni kodladı, bu da A-S-O-C-E kanalını kodlayan kontrollere kıyasla, siyah iz devirme veya I bir ekspresyon SOCE aktivitesinin azalmasına neden oldu, SOCE ve KYC bir 50 hücre de manganez söndürme testi ile doğrulandı. TG ER kalsiyum depolarını tamamen tükettikten sonra, manganez bolluğu önemli bir floresan azalmasına neden oldu.

URA iki sinyal kaybının daha dik eğimi, daha aktif bir SOCE'yi gösterir. Bu nedenle, iki A PB ile muamele edilmiş hücredeki yavaş floresan azalması, SOCE aktivitesinin bu bileşik tarafından bloke edildiğini gösterir. Manganez söndürme oranları, söndürmenin doygunluk olmadan hala doğrusal aralıkta olduğu ilk 10 saniyeden itibaren belirlendi, kültürlenmiş kas hücrelerinde benzer bir manganez söndürme testi yapıldı.

Bu durumda, manganez tg ile birlikte uygulandı. TG, SR kalsiyum depolarını tüketirken, floresan söndürme eğimi, maksimum hızına ulaşana kadar kademeli olarak değişti. Sigmoidal eğri, bu deneysel koşullar altında SOCE'nin kademeli aktivasyonunu gösterdi.

Konfokal görüntüleme altında, TT bölmesinde beşinci yol ve kalıbın derili lif sıkışması, kırmızı kanalda görüldüğü gibi karakteristik memeli çift modelini gösterdi. SR'nin akış beş NM ile yüklenmesinden sonra, tipik noktalanmış SR paterni, TTSR yükleme çözeltisi ile derili elyafın bolluğu üzerine yeşil kanalda görüldü, hem beş N hem de beş akışın floresan yoğunluğu, SR tükenme çözeltisi ile bolluk üzerine artmıştır, SR bölmesindeki floresan seviyeleri ve TT bölmesi azalmaya başlamıştır. Bu, sırasıyla SR kalsiyum deposu tükenmesi ile SOCE aktivasyonu arasında bir eşleşme olduğunu gösterdi.

Bu videoyu izledikten sonra, ilk canlı, gerçekten sağlıklı, sağlam kas liflerini nasıl elde edeceğinizi gerçekten iyi anlamış olmalısınız. Onlar, size etkili bir cilt süreci sağlamak için uçlarında yeterli tendona sahip olmaları gerekir, bu da sonuçta deneycinin inanılmaz bir avantaja sahip olan fizyolojik bir hazırlığa sahip olmasını sağlayacaktır. Bu çalışmada kullanılan tüm floresan stillerinin genellikle ışığa duyarlı olduğunu ve bu işlem yapılırken karanlık bulaşıkta yükleme ve karanlık odada yıkama gibi önlemlerin her zaman uygulanması gerektiğini unutmayın.

Bu teknikte ustalaşmak birkaç saat içinde yapılabilir. Önerdiğimiz şey, mekanik sıska adımlarla daha yüksek bir başarı yüzdesi sağlamak için önce birkaç sağlam elyafın elde edilmesi ve ayrıca bu elyafları bir gecede kültürlemek istiyorsanız, geliştirildikten sonra. Bu teknik, kanser hücrelerinin büyümesi ve ölümünde mağaza tarafından işletilen kalsiyum girişinin rolünü araştırmak için kalsiyum sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların yolunu açtı.

Kasta fizyolojik ve patolojik fonksiyon.