Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Bu deneysel yöntem, kanser ve iskelet kası hücrelerinde depoya bağımlı kalsiyum girişinin (SOCE) özelliklerini floresan tabanlı yöntemler kullanarak ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu, hücre içi kalsiyum konsantrasyonuna duyarlı olan URA two'nun canlı hücrelerdeki floresansının kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca, SOCE'yi incelemek amacıyla, kalsiyum konsantrasyonuna duyarsız dalga boyunda mangan eklenmesiyle oluşan floresan sönümlenme hızı ölçülür ve bu durum doğrudan SOCE aktivasyonunu yansıtır.

Yapısal olarak özelleşmiş iskelet kas hücrelerinde, kaslar diseke edilir ve deri kılıflarından arındırılır. Kas lifleri hazırlanır. Daha sonra lifler düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri ile işleme tabi tutulur ve iç floresanları izlenir.

Bu yöntemler, SOCE'nin hem uyarılmayan hücrelerde hem de iskelet kaslarında, dereceli aktivasyonla ve hücre içi kalsiyum deposu içeriğiyle sıkı bir eşleşme ile mevcut olduğunu göstermektedir. Floresein tabanlı bu tekniğin elektrofizyoloji, patch clamp gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, kullanımının kolay olması ve hücre popülasyonu çalışmalarına veya yüksek kapasiteli taramalara uygulanabilmesidir. Ritüel metrik ortam ve mag koning analizi için doğru estetiklerin kullanılması önemlidir.

Her cihaz farklı olduğu için bireysel cihaz kalibrasyonu kritik öneme sahiptir. Tekli kas liflerinin mekanik deri hazırlama süreci; özel bir uygulamalı eğitim, mikro diseksiyon tekniklerinin derinlemesine anlaşılması ve öğrenilmesi, dikkatli gözlem ve ciddi bir sabır gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi hayati önem taşır. Başlamadan önce, URA two floresans ölçümü için mikroskop düzeneğini kalibre edin. Kalsiyum bağlama ve kalsiyum üç URA two için eksitasyon dalga boyları 340 ve 380 nanometre olsa da, belirli bir mikroskop sisteminde kalsiyum ölçümü için en iyi URA two oran dinamik aralığı diğer dalga boylarında gerçekleşebilir.

Dalga boylarındaki bu kaymalar, eklenen çeşitli optik bileşenlerle birlikte optik yolun değişmesinden kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, her sistem için ISO spastik noktası da farklılık göstermektedir. Bu nedenle, bu dalga boylarının spektrum taraması ile belirlenmesi önemlidir.

Alternatif olarak, Ming taraması, final değerinin kalsiyum konsantrasyonundan bağımsız olacağı şekilde herhangi iki dalga boyunda sadece floresan ile kaydedilebilir. RFP eksprese eden plazmidler ve ya I one'a karşı spesifik HRNA ya da rastgele bir sekans içeren kültüre edilmiş K Ys SE one 50 hücrelerini 48 saat boyunca transfekte ederek başlayın. Transfekte edilen hücreleri cam tabanlı kaplarda büyütün.

Ardından besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri dengeli tuz çözeltisi veya BSS ile durulayın. Durulama işleminden sonra, iki mikromolar RA 2:00 AM içeren bir mililitre BSS ekleyin ve kabı 40 dakika boyunca 37 degrees Celsius'ta tutun. Hücre içi URA 2:00 AM formunun URA ikiye dönüşmesini sağlamak için hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Ardından, plakayı mikroskop altında iki kez BSS ile yıkayın. Görselleştirme modunda, RFP eksprese eden hücreleri seçin. Emisyon dalga boyu 510 nanometre, eksitasyon dalga boyları ise 350 ve 390 nanometre olarak ayarlanmış eksitasyon oranı modunu seçin.

Oran üçüncü pencerede görüntülenir. Ardından, hücreler dört farklı çözelti ile perfüze edilirken seçilen hücrelerin önceden belirlenmiş dalga boylarındaki floresan değerlerini kaydedin.

Benzer şekilde, KYSE-150 hücreleri ferra-2 ile yüklenir ve kayda tabi tutulur. Eksitasyon oranı modunda, önceki prosedürün aksine, eksitasyon dalga boyu olarak ISO spastik nokta 360 nm seçilir. Ardından, hücreler beş farklı BSS çözeltisi ile perfüze edilirken 360 ve 390 nm'deki floresan eş zamanlı olarak kaydedilir.

Bu protokol için, bir fare miyojenik hücre hattı olan C2C12 hücreleri, cam tabanlı kaplarda konfluens seviyesine gelene kadar kültüre edilmeli ve ardından %2,5 at horseserumu içeren diferansiyasyon ortamında miyotüplere diferansiye edilmelidir. C2C12 miyotüplerini, BSS çözeltisi içinde 5 µM final konsantrasyonundaki RA 2:00 AM ile yükleyin ve 40 dakika inkübe edin. Ardından, kas kasılmalarını ve bunlardan kaynaklanan hareket artefaklarını inhibe etmek için 20 µM final konsantrasyonunda benzo p toluene smide veya BTS ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve tüm çözeltilerde BTS'yi koruyun. Ardından, perfüzyon sistemine dört adet dengeli tuz çözeltisi yükleyin.

Daha önce açıklandığı gibi. Her perfüzyon sırasında, seçilen hücrelerin floresansını 360 ve 390 nanometrede kaydedin. Bu seride, magnezyum iyonu sönümlenmesini izlemek için magnezyum ve thap argen birlikte uygulanır.

Endoplazmik retikulum kalsiyum depoları tükenirken. Extensor digitorum longus veya EDL kasını diseke etmek için, ötanize edilmiş bir farenin bacağını yan tarafa gelecek şekilde konumlandırın ve ayak bileği bölgesinden dize kadar olan deriyi kaldırın. EDL'yi açığa çıkarmak için yüzeysel kas doku tabakalarını kesin ve sağlam EDL kasını serbest bırakmak için hem üst hem de alt tendonları kesin.

Tendon uzunluğunu mümkün olduğunca korumak önemlidir. Şimdi, herhangi bir kasılmayı önlemek için, bir stereo mikroskop altında EDL'yi 0.1 millimolar EGTA içeren ve kalsiyum barındırmayan bir T road solüsyonuna aktarın. Diz insersiyon tendonlarını ikiye ayırın ve EDL kasını iki demet şeklinde bölün.

Sekiz demet elde edilene kadar işlemi tekrarlayın. Herhangi bir demetten tendon kaybı olursa, o demeti atın. Ardından, bir EDL demet şeridinin her iki tendonunu tutun ve her iki tarafında tendon dokusu kalmış üç veya dört ayrı tek kas lifi sağlam kalana kadar şeridi dikkatle gerin.

Cam tabanlı bir kaba bir damla kalsiyumsuz tyro tamponu ekleyin. EDL şeritlerini kabın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla çözeltiyi hızlıca uzaklaştırın. Ardından, her iki tendonu suya dayanıklı şeffaf bant kullanarak sıkıca sabitleyin.

Lifi önce kalsiyum içermeyen çözeltiyle, ardından iki kez 2.5 millimolar kalsiyum çözeltisiyle yıkayın. Lifin aşırı kasılması ve hasar görmesi durumunda lifi atın; seçilen sağlıklı kas liflerini bir numaralı yıkama çözeltisiyle üç kez yıkayın ve ardından beş dakika boyunca modifiye hücre içi benzeri skinning çözeltisinde bekletin. Bir iğne tutucuya takılı tungsten iğne kullanarak lifi stereo mikroskop altında mekanik olarak skinning işlemine tabi tutun; lifler yeniden kapanacak ve transvers tübüllerde kalsiyum ile konjuge edilmiş road five n'yi hapsedecektir.

Kanaatimce, sağlıklı, tek ve bütün kas lifleri veya en azından hala bir miktar tendonun bağlı olduğu bu tip lif demetleri elde etmek, ardından gelen ve her zaman çok zor olan bu liflerin nihai deney odasına transferi ile birlikte en zorlu adımlardan biridir. Bu işlem sırasında lifler aşırı kasılabilir veya hatta kopabilir. Bu nedenle, sağlıklı liflere sahipseniz, mekanik skinleme işlemi çok daha kolay olacaktır. SR'yi yüklemek için lifleri 20 µM flow five N am içeren skinleme solüsyonunda inkübe edin.

İnkübasyonu, yıkama çözeltisi numara iki ile kapsamlı yıkamalarla ve boyanın tamamen de-esterifikasyonunu sağlamak için 30 dakikalık ek bir inkübasyonla takip edin. Ardından, fiberler ilgi duyulan bölgelerden 60 x objektifli bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilebilir. Fiber, SR yükleme ve SR boşaltma çözeltileriyle perfüze edilirken her bir boyanın floresanını eş zamanlı olarak kaydedin.

KYS, SE one 50 hücrelerindeki SOCE aktivitesi, hücre içi kalsiyum ölçümü kullanılarak incelenmiştir. Hücreler, RFP ve A-S-O-C-E kanalını kodlayan OR I one genine karşı kısa bir saç tokası (short hairpin) RNA ile birlikte kodlanmış olup, siyah iz ile temsil edilen kontrollerle karşılaştırılmıştır; OR I one ekspresyonunun susturulması, SOCE aktivitesinde azalma ile sonuçlanmıştır. KYC one 50 hücrelerindeki SOCE, manganez sönümleme deneyi ile de doğrulanmıştır. TG, ER kalsiyum depolarını tamamen tükettikten sonra, manganez perfüzyonu belirgin bir floresan azalmasına yol açmıştır.

URA iki sinyal kaybının daha dik eğimi, daha aktif bir SOCE'ye işaret eder. Bu nedenle, iki A PB ile işlem görmüş hücrelerdeki yavaş floresan azalması, SOCE aktivitesinin bu bileşik tarafından bloke edildiğini gösterir. Manganez sönümleme hızları, sönümlemenin henüz doygunluğa ulaşmadan doğrusal aralıkta olduğu ilk 10 saniyeden belirlenmiş olup, benzer bir manganez sönümleme analizi kültürlenmiş kas hücrelerinde gerçekleştirilmiştir.

Bu durumda, manganez tg ile birlikte uygulanmıştır. TG, SR kalsiyum depolarını tüketirken, floresan sönümleme eğimi maksimum hızına ulaşana kadar kademeli olarak değişmiştir. Sigmoidal eğri, bu deneysel koşullar altında SOCE'nin kademeli aktivasyonunu göstermiştir.

Konfokal görüntüleme altında, deri kaldırılmış (skinned) liflerdeki rhod5 ve dye'ın TT kompartmanındaki tutulumu, kırmızı kanalda görüldüğü üzere karakteristik memeli dublet paternini göstermiştir. SR'nin rhod5N ile yüklenmesinden sonra, deri kaldırılmış lifin TTSR yükleme çözeltisi ile perfüzyonunun ardından yeşil kanalda tipik noktasal SR paterni görünür hale gelmiştir; rhod5N ve flow5n'nin floresans yoğunluğu SR tüketim çözeltisi ile perfüzyon üzerine artmıştır ve SR kompartmanı ile TT kompartmanındaki floresans seviyeleri azalmaya başlamıştır. Bu durum, sırasıyla SR kalsiyum deposunun tükenmesi ile SOCE aktivasyonu arasında bir etkileşim olduğunu göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, ilk olarak canlı, gerçekten sağlıklı ve bozulmamış kas liflerinin nasıl elde edileceği konusunda oldukça iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Etkili bir temizleme işlemi yapmanıza olanak tanımak için uçlarında yeterli tendon bulunması gerekir; bu da nihayetinde deney yapan kişinin inanılmaz bir avantaja sahip, fizyolojik olarak anlamlı bir preparata sahip olmasını sağlayacaktır. Bu çalışmada kullanılan tüm floresan boyaların genellikle ışığa duyarlı olduğunu unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken karanlık kaplarda yükleme yapmak ve karanlık odada yıkama yapmak gibi önlemler her zaman uygulanmalıdır.

Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, işlem birkaç saat içinde tamamlanabilir. Mekanik ayırma adımlarında daha yüksek bir başarı yüzdesi elde etmek ve ayrıca geliştirme sonrası bu fiberleri gece boyunca kültüre etmek isterseniz, öncelikle birkaç adet sağlam fiber elde etmenizi öneririz. Bu teknik, kalsiyum sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların, kanser hücrelerinin büyüme ve ölümündeki depo operatörlü kalsiyum girişinin rolünü incelemelerine yol açmıştır.

Kastaki fizyolojik ve patolojik fonksiyon.