Name: Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde depo çalışan kalsiyum girişini floresan göstergelerle ölçme yöntemini. Bu teknik, kanser ve iskelet kası hücrelerinde SOCE dinamiklerini yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz okuma ve bu yazının düzenleme için Dr Nuh Weisleder teşekkür ederim. Bu çalışma MB 0535555N ZP, XZ için Amerikan Kalp Derneği SDG2630086, ve Ulusal Sağlık Enstitüleri RC2AR058962-01 MB için Araştırma Fonları UMDNJ 62-09 Vakfı tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ca + 2-bağlayıcı ve Ca2 + serbest Fura-2 uyarma dalga boyları sırasıyla, 340 nm ve 380 nm olmasına rağmen, Ca 2 için Fura-2 iyi oranı dinamik aralığı + konsantrasyonunun ölçülmesi belirli bir başka dalga boylarında oluşabilir mikroskop sistemi. Bu tür değişimler dalga boyunda genellikle farklı optik bileşenlerin ilavesi ile optik yol üzerinde değişikliklere bağlı bulunmaktadır. Bu çalışmada, Fura-2 için uyarma dalga Fura-2 floresans spektral analizi yaparak 350 nm ve 390 nm olarak belirlendi. Dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan arasında bir denge, gelen sitozolüne sonuçlar intraselüler Ca2 + seviyesi intraselüler Ca2 + serbest bırakma, hücre dışı Ca2 + giriş yanı sıra, ER ve plazma membranında Ca2 + dışlama mekanizmasıdır. Hücre içi Ca 2 + sürümü ve Ca 2 + extr gelen tek yönlü SOC-aracılı Ca 2 + akını izole etmek içinusion, Mn 2 + soğutmadan test kullanılabilir. Mn 2 + SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilmek için bilinen ama yüzey membran ekstrüzyon veya Ca 2 ER alımı + pompaları geçirmeyen edilir. Bu nedenle, flöresan söndürmesiyle SOCE aktivasyon derecesi tahmin hücrelerin içine tek yönlü Mn 2 + akısı bir ölçüm temsil eder. Mn 2 + soğutmadan deneyi gibi dalga boyunda, isosbestic noktada gerçekleştirilir Fura-2 floresans yoğunluğunu Ca2 + konsantrasyonu bağımsızdır. Edilir Her sistem için isosbestic noktası spektrum taraması ile tespit edilir. Alternatif olarak, Mn 2 + soğutmadan son değere Ca2 + konsantrasyonu 13 bağımsız şekilde herhangi iki dalga boyunda ayarlanmış floresans tarafından kaydedilebilir. Iskelet kaslarında SOCE faaliyet zamansal ve mekansal bilgi almak için, simultane ölçüm tekni sağlayan bir çift boya yöntemi, istihdamSOCE aktivite ve SR Ca 2 tenli yetişkin memelilerin EDL kas liflerinin + içerik nt. SR Ca 2 değişimler arasındaki ilişki + içeriği ve SOCE aktivite SR Ca 2 tükenmesi + depolama SOCE aktivasyon eşiği ve duyarlılık göstermek için çizilebilir. TT-yükleme çözüm ek Ca 2 T-tubul yüklemek için optimize edilmiştir + ve T-tubul ve SR-yükleme çözüm priming için maksimal SR Ca 2 + yükleme teşvik etmek ve ayrıca T-tubul yüklemek için tasarlanmıştır ~ 500 uM Ca 2 ile +. FCCP TT / SR-yükleme çözümü ve mitokondri gelen etkileri ortadan kaldırmak için SR-tüketen bir çözüm bulunur.

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Bulaşık </td><td> MatTek Corp </td><td> P35G-1,5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C&#39;de, DMSO içinde çözülmüş ışıktan korunan conta sızdırmaz, </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, mühür sıkı, l korunmaktadıright </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, mühür sıkı ve ışıktan korunmalıdır </td></tr><tr><td> Kuvars Küvet </td><td> Starna Hücreleri </td><td> 3-S-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzil-p-toluen sülfonamid (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Ekipman: <ol><li> Bir spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): ksenon ark lambası, bilgisayar kontrollü yüksek hızlı rastgele erişim monokromatör, küvet tabanlı emisyon monokromatör, Nikon TE-200 ters floresans MikroskopE, S Fluor 40x/1.30 yağlı objektif, PMT dedektörleri. </li><li> Argon lazer 453/477/488/514, HeNe lazer 543nm, Nikon TE2000 inverted mikroskop, 60X objektif (NA 1.4, yağ): Lazer Konfokal Mikroskobu (BioRad Radiance2100) tarama. </li><li> Bir büyütme gücü&gt; 100 (Zeiss STEMI SV11 Apo) ile bir stereomikroskop. </li></ol>

canlı hücreler mağaza çalışan kalsiyum giriş floresans tabanlı Ölçümü: kültür kanseri hücre gelen İskelet kası fiber

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Mağaza önceki kapasitif Ca 2 + girişi olarak adlandırılan, Ca 2 + girişi (SOCE) ameliyat, + tükenmiş endoplazmik retikulum (ER) veya sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2 + depolarının doldurulmasıdır hücre içine ekstraselüler Ca 2 akını için sıkı regüle mekanizmadır 1,2. Ca 2 + bir yerde ikinci bir haberci olduğu için, o SOCE çoğalması, apoptoz, gen transkripsiyonu ve motilite dahil, hücresel süreçlerin çeşitli önemli rol oynar görmek şaşırtıcı değildir. Epitel hücreleri ve iskelet kasları dahil olmak üzere hemen hemen tüm hücre tipleri, içinde geniş görülmesi nedeniyle, bu yolu büyük ilgi 3,4 aldı. Ancak, farklı hücre tipleri ve fizyolojik fonksiyonu SOCE özellikleri heterojenite hala 5-7 net değil. SOCE fonksiyonel kanal özellikleri thi hakkında bilgi büyük bir gövde ise, yama klemp çalışmalarla ortaya edilebilirs yolu çünkü yüksek verimli tarama rahatlığının ve fizibilite floresans tabanlı hücre içi Ca 2 + ölçümleri ile elde edilmiştir. Bu raporun amacı, tek tabakalı hücreler, askıya hücreleri ve kas lifleri 5,8-10 içinde SOCE aktivasyonu ölçmek için bir kaç floresans tabanlı yöntemler özetlemektir. En yaygın olarak floresans bu yöntem kullanılır, doğrudan intraselüler Ca2 + dinamiği izlemek için F ve 340 nm oranlı metrik Ca2 + göstergesi Fura-2 F 380nm (emisyon dalga boyu için 510 nm) oranı kullanılarak bir. Hücre içi Ca2 + serbest bırakılması ve Ca arasından 2 yönlü SOCE aktivitesini izole etmek için + ekstrüzyon, bir Mn 2 + soğutmadan assay sıkça kullanılır. Mn 2 + o yüzeye membran ekstrüzyon süreçlere veya Ca 2 tarafından ER uptake geçirmez iken SOCE yoluyla hücre içine nüfuz edebilir olduğu bilinmektedir + olan çok yüksek bir afiniteye wit nedeniyle pompalarh Fura-2. Bunun sonucu olarak, + hücrelerine ekstraselüler Mn 2 girişi ile indüklenen Fura-2 floresans soğutmadan SOCE 9 faaliyeti, bir ölçüm temsil eder. Oranlı metrik ölçümü ve Mn +2 soğutmadan deneyleri, bir hücre popülasyonunu modunda ya da tek hücrelerin canlandırmak için mikroskop tabanlı bir sistem içerisinde bir küvet bazlı spectrofluorometer üzerinde gerçekleştirilebilir. Tek hücre ölçümlerin avantajı gen manipülasyonu tabi tek tek hücrelerin genetik olarak modifiye edilmiş ya da mutasyon hücrelerinde çalışmaları sağlayan GFP veya RFP gazetecilere kullanılarak seçilebilir olmasıdır. Yapısal olarak özel bir iskelet kasında SOCE arasında zamanmekansal özellikleri aynı anda iki düşük afinite Ca 2 floresans izlenerek kabuklu kas fiberler elde edilebilir SR ve bu gibi flüoresan 5N olarak kas fiberin özel bir bölme, hedeflenen + göstergeleri Rhod- transvers tübüller 9,11,12 olarak 5N.

Mağaza çalışan Ca ölçüde<sup&gt; 2 +</sup&gt; Giriş (SOCE) floresan Ca kullanılarak izlenebilir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Göstergeleri. Mn<sup&gt; 2 +</supKültür hücreleri ve kas lifleri bu tür göstergeler testler SOCE bir&gt; su verme. Mekanik tenli kas liflerinin konfokal görüntüleme ile SOCE uzaysal ve zamansal çözünürlüğe izin veren bir tekniği de tarif edilir.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Daha önce kapasitif Ca2+ girişi olarak adlandırılan depoya bağımlı Ca2+ girişi (SOCE), hücre dışı Ca2+'nın hücre içine akışını sağlayan ve sıkı bir şekilde düzenlenen bir mekanizmadır...

Bu deneysel yöntem, kanser ve iskelet kası hücrelerinde depoya bağımlı kalsiyum girişinin (SOCE) özelliklerini floresan tabanlı yöntemler kullanarak ortaya çıkarmak için kullanılır. Bu, hücre içi kalsiyum konsantrasyonuna duyarlı olan URA two'nun canlı hücrelerdeki floresansının kaydedilmesiyle gerçekleştirilir. Ayrıca, SOCE'yi incelemek amacıyla, kalsiyum konsantrasyonuna duyarsız dalga boyunda mangan eklenmesiyle oluşan floresan sönümlenme hızı ölçülür ve bu durum doğrudan SOCE aktivasyonunu yansıtır.Yapısal olarak özelleşmiş iskelet kas hücrelerinde, kaslar diseke edilir ve deri kılıflarından arındırılır. Kas lifleri hazırlanır. Daha sonra lifler düşük afiniteli kalsiyum indikatörleri ile işleme tabi tutulur ve iç floresanları izlenir.Bu yöntemler, SOCE'nin hem uyarılmayan hücrelerde hem de iskelet kaslarında, dereceli aktivasyonla ve hücre içi kalsiyum deposu içeriğiyle sıkı bir eşleşme ile mevcut olduğunu göstermektedir. Floresein tabanlı bu tekniğin elektrofizyoloji, patch clamp gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, kullanımının kolay olması ve hücre popülasyonu çalışmalarına veya yüksek kapasiteli taramalara uygulanabilmesidir. Ritüel metrik ortam ve mag koning analizi için doğru estetiklerin kullanılması önemlidir.Her cihaz farklı olduğu için bireysel cihaz kalibrasyonu kritik öneme sahiptir. Tekli kas liflerinin mekanik deri hazırlama süreci; özel bir uygulamalı eğitim, mikro diseksiyon tekniklerinin derinlemesine anlaşılması ve öğrenilmesi, dikkatli gözlem ve ciddi bir sabır gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi hayati önem taşır. Başlamadan önce, URA two floresans ölçümü için mikroskop düzeneğini kalibre edin. Kalsiyum bağlama ve kalsiyum üç URA two için eksitasyon dalga boyları 340 ve 380 nanometre olsa da, belirli bir mikroskop sisteminde kalsiyum ölçümü için en iyi URA two oran dinamik aralığı diğer dalga boylarında gerçekleşebilir.Dalga boylarındaki bu kaymalar, eklenen çeşitli optik bileşenlerle birlikte optik yolun değişmesinden kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, her sistem için ISO spastik noktası da farklılık göstermektedir. Bu nedenle, bu dalga boylarının spektrum taraması ile belirlenmesi önemlidir.Alternatif olarak, Ming taraması, final değerinin kalsiyum konsantrasyonundan bağımsız olacağı şekilde herhangi iki dalga boyunda sadece floresan ile kaydedilebilir. RFP eksprese eden plazmidler ve ya I one'a karşı spesifik HRNA ya da rastgele bir sekans içeren kültüre edilmiş K Ys SE one 50 hücrelerini 48 saat boyunca transfekte ederek başlayın. Transfekte edilen hücreleri cam tabanlı kaplarda büyütün.Ardından besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri dengeli tuz çözeltisi veya BSS ile durulayın. Durulama işleminden sonra, iki mikromolar RA 2:00 AM içeren bir mililitre BSS ekleyin ve kabı 40 dakika boyunca 37 degrees Celsius'ta tutun. Hücre içi URA 2:00 AM formunun URA ikiye dönüşmesini sağlamak için hücreleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.Ardından, plakayı mikroskop altında iki kez BSS ile yıkayın. Görselleştirme modunda, RFP eksprese eden hücreleri seçin. Emisyon dalga boyu 510 nanometre, eksitasyon dalga boyları ise 350 ve 390 nanometre olarak ayarlanmış eksitasyon oranı modunu seçin.Oran üçüncü pencerede görüntülenir. Ardından, hücreler dört farklı çözelti ile perfüze edilirken seçilen hücrelerin önceden belirlenmiş dalga boylarındaki floresan değerlerini kaydedin.Benzer şekilde, KYSE-150 hücreleri ferra-2 ile yüklenir ve kayda tabi tutulur. Eksitasyon oranı modunda, önceki prosedürün aksine, eksitasyon dalga boyu olarak ISO spastik nokta 360 nm seçilir. Ardından, hücreler beş farklı BSS çözeltisi ile perfüze edilirken 360 ve 390 nm'deki floresan eş zamanlı olarak kaydedilir.Bu protokol için, bir fare miyojenik hücre hattı olan C2C12 hücreleri, cam tabanlı kaplarda konfluens seviyesine gelene kadar kültüre edilmeli ve ardından %2,5 at horseserumu içeren diferansiyasyon ortamında miyotüplere diferansiye edilmelidir. C2C12 miyotüplerini, BSS çözeltisi içinde 5 µM final konsantrasyonundaki RA 2:00 AM ile yükleyin ve 40 dakika inkübe edin. Ardından, kas kasılmalarını ve bunlardan kaynaklanan hareket artefaklarını inhibe etmek için 20 µM final konsantrasyonunda benzo p toluene smide veya BTS ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve tüm çözeltilerde BTS'yi koruyun. Ardından, perfüzyon sistemine dört adet dengeli tuz çözeltisi yükleyin.Daha önce açıklandığı gibi. Her perfüzyon sırasında, seçilen hücrelerin floresansını 360 ve 390 nanometrede kaydedin. Bu seride, magnezyum iyonu sönümlenmesini izlemek için magnezyum ve thap argen birlikte uygulanır.Endoplazmik retikulum kalsiyum depoları tükenirken. Extensor digitorum longus veya EDL kasını diseke etmek için, ötanize edilmiş bir farenin bacağını yan tarafa gelecek şekilde konumlandırın ve ayak bileği bölgesinden dize kadar olan deriyi kaldırın. EDL'yi açığa çıkarmak için yüzeysel kas doku tabakalarını kesin ve sağlam EDL kasını serbest bırakmak için hem üst hem de alt tendonları kesin.Tendon uzunluğunu mümkün olduğunca korumak önemlidir. Şimdi, herhangi bir kasılmayı önlemek için, bir stereo mikroskop altında EDL'yi 0.1 millimolar EGTA içeren ve kalsiyum barındırmayan bir T road solüsyonuna aktarın. Diz insersiyon tendonlarını ikiye ayırın ve EDL kasını iki demet şeklinde bölün.Sekiz demet elde edilene kadar işlemi tekrarlayın. Herhangi bir demetten tendon kaybı olursa, o demeti atın. Ardından, bir EDL demet şeridinin her iki tendonunu tutun ve her iki tarafında tendon dokusu kalmış üç veya dört ayrı tek kas lifi sağlam kalana kadar şeridi dikkatle gerin.Cam tabanlı bir kaba bir damla kalsiyumsuz tyro tamponu ekleyin. EDL şeritlerini kabın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla çözeltiyi hızlıca uzaklaştırın. Ardından, her iki tendonu suya dayanıklı şeffaf bant kullanarak sıkıca sabitleyin.Lifi önce kalsiyum içermeyen çözeltiyle, ardından iki kez 2.5 millimolar kalsiyum çözeltisiyle yıkayın. Lifin aşırı kasılması ve hasar görmesi durumunda lifi atın; seçilen sağlıklı kas liflerini bir numaralı yıkama çözeltisiyle üç kez yıkayın ve ardından beş dakika boyunca modifiye hücre içi benzeri skinning çözeltisinde bekletin. Bir iğne tutucuya takılı tungsten iğne kullanarak lifi stereo mikroskop altında mekanik olarak skinning işlemine tabi tutun; lifler yeniden kapanacak ve transvers tübüllerde kalsiyum ile konjuge edilmiş road five n'yi hapsedecektir.Kanaatimce, sağlıklı, tek ve bütün kas lifleri veya en azından hala bir miktar tendonun bağlı olduğu bu tip lif demetleri elde etmek, ardından gelen ve her zaman çok zor olan bu liflerin nihai deney odasına transferi ile birlikte en zorlu adımlardan biridir. Bu işlem sırasında lifler aşırı kasılabilir veya hatta kopabilir. Bu nedenle, sağlıklı liflere sahipseniz, mekanik skinleme işlemi çok daha kolay olacaktır. SR'yi yüklemek için lifleri 20 µM flow five N am içeren skinleme solüsyonunda inkübe edin.İnkübasyonu, yıkama çözeltisi numara iki ile kapsamlı yıkamalarla ve boyanın tamamen de-esterifikasyonunu sağlamak için 30 dakikalık ek bir inkübasyonla takip edin. Ardından, fiberler ilgi duyulan bölgelerden 60 x objektifli bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilebilir. Fiber, SR yükleme ve SR boşaltma çözeltileriyle perfüze edilirken her bir boyanın floresanını eş zamanlı olarak kaydedin.KYS, SE one 50 hücrelerindeki SOCE aktivitesi, hücre içi kalsiyum ölçümü kullanılarak incelenmiştir. Hücreler, RFP ve A-S-O-C-E kanalını kodlayan OR I one genine karşı kısa bir saç tokası (short hairpin) RNA ile birlikte kodlanmış olup, siyah iz ile temsil edilen kontrollerle karşılaştırılmıştır; OR I one ekspresyonunun susturulması, SOCE aktivitesinde azalma ile sonuçlanmıştır. KYC one 50 hücrelerindeki SOCE, manganez sönümleme deneyi ile de doğrulanmıştır. TG, ER kalsiyum depolarını tamamen tükettikten sonra, manganez perfüzyonu belirgin bir floresan azalmasına yol açmıştır.URA iki sinyal kaybının daha dik eğimi, daha aktif bir SOCE'ye işaret eder. Bu nedenle, iki A PB ile işlem görmüş hücrelerdeki yavaş floresan azalması, SOCE aktivitesinin bu bileşik tarafından bloke edildiğini gösterir. Manganez sönümleme hızları, sönümlemenin henüz doygunluğa ulaşmadan doğrusal aralıkta olduğu ilk 10 saniyeden belirlenmiş olup, benzer bir manganez sönümleme analizi kültürlenmiş kas hücrelerinde gerçekleştirilmiştir.Bu durumda, manganez tg ile birlikte uygulanmıştır. TG, SR kalsiyum depolarını tüketirken, floresan sönümleme eğimi maksimum hızına ulaşana kadar kademeli olarak değişmiştir. Sigmoidal eğri, bu deneysel koşullar altında SOCE'nin kademeli aktivasyonunu göstermiştir.Konfokal görüntüleme altında, deri kaldırılmış (skinned) liflerdeki rhod5 ve dye'ın TT kompartmanındaki tutulumu, kırmızı kanalda görüldüğü üzere karakteristik memeli dublet paternini göstermiştir. SR'nin rhod5N ile yüklenmesinden sonra, deri kaldırılmış lifin TTSR yükleme çözeltisi ile perfüzyonunun ardından yeşil kanalda tipik noktasal SR paterni görünür hale gelmiştir; rhod5N ve flow5n'nin floresans yoğunluğu SR tüketim çözeltisi ile perfüzyon üzerine artmıştır ve SR kompartmanı ile TT kompartmanındaki floresans seviyeleri azalmaya başlamıştır. Bu durum, sırasıyla SR kalsiyum deposunun tükenmesi ile SOCE aktivasyonu arasında bir etkileşim olduğunu göstermiştir.Bu videoyu izledikten sonra, ilk olarak canlı, gerçekten sağlıklı ve bozulmamış kas liflerinin nasıl elde edileceği konusunda oldukça iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Etkili bir temizleme işlemi yapmanıza olanak tanımak için uçlarında yeterli tendon bulunması gerekir; bu da nihayetinde deney yapan kişinin inanılmaz bir avantaja sahip, fizyolojik olarak anlamlı bir preparata sahip olmasını sağlayacaktır. Bu çalışmada kullanılan tüm floresan boyaların genellikle ışığa duyarlı olduğunu unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken karanlık kaplarda yükleme yapmak ve karanlık odada yıkama yapmak gibi önlemler her zaman uygulanmalıdır.Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, işlem birkaç saat içinde tamamlanabilir. Mekanik ayırma adımlarında daha yüksek bir başarı yüzdesi elde etmek ve ayrıca geliştirme sonrası bu fiberleri gece boyunca kültüre etmek isterseniz, öncelikle birkaç adet sağlam fiber elde etmenizi öneririz. Bu teknik, kalsiyum sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların, kanser hücrelerinin büyüme ve ölümündeki depo operatörlü kalsiyum girişinin rolünü incelemelerine yol açmıştır.Kastaki fizyolojik ve patolojik fonksiyon.

fluorescence-based-measurement-store-operated-calcium-entry-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Kaynak: Heredia, D. J., et. al. Fare diyaframının üçlü sinapsında hücreye özgü kalsiyum sinyalinin ex vivo görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video floresan görüntülemeyi göstermektedir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik bir farede nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) kalsiyum dinamikleri. Bir NJM, frenik sinir ile diyaframdaki floresan etiketli asetilkolin reseptörleri ile tanımlanır. Aynı anda birden fazla sinyali görselleştirmek için bir görüntü ayırıcı...

Transgenik Bir Farenin Diyaframındaki Nöromüsküler Kavşaklarda Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Doğrudan kalsiyum kıvılcım ölçülmesi için bir yöntem aşağıda tarif edilmiştir, Ca2 + elementer birim sağlam iskelet kas lifleri Sarkoplazmik retikulumdan bırakın. Bu yöntem, izole kas lifleri riyanodin reseptörü, Ca2 + serbest ozmotik stres-kaynaklı tetikleme kullanır. Dinamikleri ve hücre içi Ca 2 + sinyalizasyon homeostatik kapasitesi sağlığı ve hastalıkları, kas fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Bu yöntem çift optogenetik ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri görüntü bazal sitosolik kalsiyum düzeyleri ve model organizma C. elegansvücut duvarı kasları uyarılmış kalsiyum geçici değişiklikler için bir yol sağlar.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Bu makale, fare üçüncü metatarsalının doku düzeyinde mekanik yüklenmesine yanıt olarak gömülü osteositlerin mekanik olarak indüklenen kalsiyum sinyalini in vivo gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için intravital bir görüntüleme yaklaşımının gerçekleştirilmesini açıklamaktadır.

Fare Osteositlerinde Yüke Bağlı Kalsiyum Sinyal Dinamiklerini İncelemek için Floresan İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Öğrenin, canlı hücrelerde depo çalışan kalsiyum girişini floresan göstergelerle ölçme yöntemini. Bu teknik, kanser ve iskelet kası hücrelerinde SOCE dinamiklerini yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Daha fazla video keşfet