Name: Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, çok katmanlı BD Falcon Multi flask kullanarak memeli hücrelerini homojen ve yüksek verimle nasıl yetiştireceğinizi. Bu yöntem, geleneksel T175 flasklara göre 3-5 kat daha fazla hücre elde etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Protokol, hücre kültürü için Multi-şişeler kullanmak için <ol><li> Gemilerin hazırlanması ve hücre süspansiyonu ekleyerek <ol><li> Gerektiği gibi hücre büyüme ortamı hazırlayın. </li><li> Multi-Flask dikey çalışma yüzeyi (steril laminer akış kaput) yukarı bakacak şekilde kapağı ile yan hizaya getirin. <ol><li> Bu şişeler 3 ve 5-katlı formatları ve T-175 şişesi de benzer bir iş akış deseni kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Gevşetin ve kapaklarını çıkarın. 50 veya 100 mL pipet kullanarak balona ya da dökerek önceden ısıtılmış orta gerekli miktarda ekleyin. <ol><li> Multi-şişeler kapağı yukarı bakacak şekilde dik olarak yerleştirilir ≤ 10 ml geminin alt ulaşabilirsiniz Pipetler . Pipetler ≥ 10ml Çok Flask logo geçmiş, böylece damar medyanın büyük birimler eklemek için uygun bir portal sağlayan damar içine hemen ulaşabilirsiniz. </li></ol></li><li> Orta köpüren önlemek için, sıvı akışı fl izinÇok Flask kapak (logo tarafında) iç duvar boyunca ow. </li><li> 10 ml pipet ve kap şişeler kullanarak üst katmanı sayesinde büyüme ortama konsantre bir hücre stokunun hücre süspansiyonu ekleyin. İpuçları: - Ulaştırma inkübatör sitesine sepeti Multi-şişeler ve geri kalan adımları uygulayın. - Hücre ekim yoğunluğu, hücre tipi, orta ve kültür süresine ihtiyaç bağlı olarak değişecektir . Standart T-175 şişelerde kullanılan tohum yoğunluğu ve medya hacmi ile başlayın ve biçimi kullanılır Multi-Flask bağlı olarak 3 veya 5 ile çarpın. </li></ol></li><li> Hücre karıştırma <ol><li> Pozisyonu logosu bakacak şekilde dik tutun ve Multi-Flask sayacı 45 saat yönünde çevirin ° açı size dönük olacak şekilde karışımı bağlantı noktası ile karıştırın. </li><li> Aynı açıyla tutarak yavaşça üst tabaka sıvı kadar önden arkaya doğru (sizden uzağa boyun) Multi-Flask eğim tamamen downwar dreneds karışımı bağlantı noktası üzerinden. Karışımı port tarafı üzerinde özetleyin. </li><li> Aynı şekilde, orta karışımı bağlantı noktası üzerinden alt tabakadan üste doğru tamamen drene kadar nazikçe geri ön (size karşı boyun) Multi-Flask kaya. Adımlar 1.2.2 ve düzgün bir karışım sağlamak için 1.2.3 bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Karışım pozisyonlar (Adım 1.2.1) Multi-Flask getirin ve 1.3 adıma geçin </li><li> Alternatif olarak, hücre süspansiyonu Multi-Flask dışarıdan hazırlanan ve hücre süspansiyonu bir pipet kullanarak gemi veya yumuşak dökerek eklenebilir. <ol><li> Mix bağlantı noktası medya ile hücrelerin damar mix yapma imkanı verir ve dışarıdan büyük miktarda hücre süspansiyonları yapma ihtiyacını ortadan kaldırır . </li><li> Ayrıca, Multi-Flask katmanları arasında medya eşitleme sağlar </li></ol></li></ol></li><li> Sıvı, Denge <ol><li> Karıştırma / hücre süspansiyonu ekledikten sonra, yer Multi-Flask dikey düz bir çalışma yüzeyi üzerindeki sıvı hacim denklemleri eşitlemek içinlly tüm katmanları. </li></ol></li><li> Her bir tabaka haline Bölme sıvı <ol><li> Multi-Flask logosu ile size dönük olacak şekilde tutun ve katmanların her birine bir sıvı bölümü ile 45 ° açı saat yönünde çevirin. İpucu: - En iyi sonuç için düz bir çalışma yüzeyi, Adımlar 1,3-1,4 için kullanmak önemlidir. </li></ol></li><li> Taşıma <ol><li> Bir zamanlar medya hücre süspansiyonu içeren nakil Multi-Flask aynı 45 ° açı (saat yönünde) inkübatör içine karışımı bağlantı uzak medya ile Adım 1.4.1 olarak bölümlendirilmiş olduğundan emin olun. Bu pozisyon, bir mikroskop görüntülemek için inkübatör şişeler çıkarırken de uygundur. </li></ol></li><li> Inkübatör raf üzerine Multi-balon yerleştirilmesi <ol><li> Multi-Flask Holding 45 ° açı (saat yönünde, uzak mix-port), yavaşça bir karışımı portu uzak köşesinde kullanarak (inkübatör yüzeye yatay aşağı döndürmekPivot). Logo yukarı bakacak şekilde Multi-Flask yatırın. <ol><li> Falcon Multi-Flask tasarım damarları yığılmış olmasını sağlar ve onları sağlam bir istifleme kaburga yerde tutar. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre ve reaktifler Dağılımı <ol><li> Çalışma yüzeyinin düz Multi-Flask yerleştirdikten sonra hafifçe ileri geri ve yan yana rock ve her katman sıvı dökmemeye özen kültür yüzeylerinden eşit hücrelerini dağıtmak için. Matara yığını. <ol><li> Bu Flask optik olarak şeffaftır malzemeden üretilmiş olup, son kat hücreleri mikroskop altında kolayca görülebilir. </li></ol></li></ol></li><li> Medya döviz <ol><li> Aspire ederken logosu ile size dönük olacak şekilde sola doğru eğerek Multi-Flask (mix port tarafı). </li><li> Sonra eğme, sağa Multi-Flask, artık tüm medya aspire devam etmektedir. </li><li> Ekleyin ve uygun miktarda medya Adımlar 1,3-1,7 izleyin </li></ol></li></ol> 2.Multi-şişeler Hasat hücrelerle <ol><li> Hücreleri, çizgi Multi-şişeler dikey ilgimiz getirmek için her biri pozisyonlar (Adım 1.2.1) karıştırın. Şişeler medya Multi-Flask üst tabakası drenaj izin verecek şekilde boyun size bakacak şekilde yavaşça çevirin. </li><li> Karışımı limanı yakınlarında sıvı seviyesine ulaşana kadar boyun aracılığıyla 5 veya 10 ml aspire ucu yerleştirin. Bitkin orta aspire. </li><li> Disosiasyon reaktif / yıkama tamponu ekleyin ve Adım 1.2.1 'deki gibi pozisyon karıştırın getirmek, sonra devam edin ve aşağıdaki adımları 1,3-1,7 uygulayın. Büyüme orta / nötralize edici ajan ile nötralize hücre süspansiyonu ve bir tüp içine dökün VEYA hücreleri için drenaj şişesi gibi ters Geminin en üst tabakası ve 10 ml pipet kullanarak hücreleri toplamak. İpucu: al medya tam drenaj izin vermek için hücreleri veya reaktiflerin kurtarma geliştirmek pozisyonlar (Adım 1.2.1) karıştırmak için Multi-Flask getirmek, boyun operatöre doğru ters l katmanları üst tabakası. Multi-Flask ters kalırken, eğim Multi-Flask 45 ° açı (karışımı portu uzak) için saat yönünde. Kalan tüm reaktifler toplamak için bir pipet (1-10 ml) kullanın. </li></ol> 3. Falcon Multi-şişeler Önerilen çalışma hacmi Büyüme medya 3-Layer: Multi-Flask başına 75-150 ml 5-Layer: Multi-Flask başına 125-250 ml Disosiyasyon ajanı 3-Layer: Multi-Flask başına ≥ 15 ml 5-Layer: Multi-Flask başına ≥ 25 ml İpucu: standart T-175 matara kullanılan orta hacimli ile başlayın ve 3 veya 5 kez birim yüzey alanı başına bu mL aynı kalacak şekilde değerlendirilir Multi-Flask formatına bağlı ile çarpın. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Falcon Multi-Flask 1. Tasarım files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/&gt; Şekil 1: Multi-Flask Hücre Kültürü gemileri, 3 - 5-katmanlı ve ölçek sırasıyla 525 ve 875 cm 2 büyüme yüzey alanı sağlayan hücreleri istiflenebilir formatı . Pipet erişim ek ve içine ve dışına geminin hücreleri ve reaktiflerin çıkarılmasını kolaylaştırır. Mix-port varlığı, Multi-Flask tüm katmanlar arasında medya-damar hızlı karıştırma ve dengeleme sağlar. 2. Hücre Verimi Multi-Flask: Bu gemiler, 3-katmanlı ve 5 katlı formatları 3'e uygun ve T-175 şişe 5 kat yüzey alanı mevcuttur. Buna göre, ≥ 3 ve 5 kez (130 ± 6.8 x 10 6 ve 218 ± 23.6 x 10 6 hücre), BHK-21 numarası (bebek Hamster böbrek) hücreler, T-175 kıyasla büyümüş ve Multi-Flask kurtarıldı matara (43.2 ± 3.5 x 10 6 hücre; Fig.2A). U ortalama Hücre verimnit yüzey alanı 3 eşit miktarda idi - ve 5-katmanlı Multi-şişeler ve BHK-21 T-175 matara, LnCAP (insan prostat adenokarsinom hücre hattı), Hep-G2 (insan hepatokarsinoma hücre hattı), Ecopack 2-293 (insan böbrek hücre hattı) 48-96h hücre satıcısı (ATCC, Sigma ve / veya Clontech) tarafından önerilen büyüme ortamı (katman başına 35 ml) bir süre (Fig.2B) kültüre. Hücreler bir otomatik Vi-HÜCRE sayacı (1) numaralandırılır. <img alt="Şekil 2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg"> Şekil 2A: BHK-21 hücre sayısı üç ve beş kez büyüdü ve kurtarılan 3 - ve 5-katmanlı Multi-şişeler T-175 matara. Beklenen verim ortalama hücre verim kontrolü kullanılarak tespit edilmiştir T-175, üç ve beş kez 3 ile çarpılır şişeler ve 5 katmanlı Multi-şişeler sırasıyla (n = 4 matara / format). <img alt="Şekil 2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg"> Şekil 2B: cm2 başına Hücre verim, eşdeğer 3 - ve 5-katmanlı Multi-şişeler ve BHK-21, LnCAP, HepG2 ve EcoPack2-293 hücre için T-175 şişeler . Her çubuk, 4 ila 6 şişe anlamına temsil eder. BHK-21 hücreleri (11.000 cells/cm2), 72 saat, LnCAP hücreleri (20.000 cells/cm2) ve EcoPack2-293 hücrelerinde (~ 35.000 cells/cm2) için kültüre edildi 96 saat ve HepG2 hücreleri (25.000 hücre / cm 2 kültüre edildi ) 48 saat için hasattan önce kültüre edildi. 3. Multi-Flask katmanları arasında Medya dağıtım Hücre kültürü, orta (DMEM; Invitrogen) 5 katmanlı Çok şişeler (250 mL/5-layer gemi) eklenir ve protokol yukarıda açıklanan göre katmanlara bölünmüştür. Medya dağıtım bireysel katmanları dışarı pompalanır her katmanı ve medya üzerinde herhangi bir delik ile ölçüldü. Şekil 3'te gösterildiği gibi katman katman nispeten homojen olması için her katman kurtarıldı sıvı ağırlığı bulundu. Bunlar aşağıdaki gibidir: 510,8 ± 0.73, 50.3 ± 0.58, 50.21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gr). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg"> Şekil 3, her beş kat 5 kat Multi-Flask Tekdüzen medya dağıtım . Hücre kültürü ortamı dengelenmiş ve bireysel katmanların bölümlenmiş Multi-şişeler (250 ml/5-layer gemi) eklendi. Medya bireysel katmanların ve sıvı ağırlığı içine delinmiş deliklerden dışarı pompalanır her katmanı (n = 6 şişeler) kaydedildi. 4. Multi-Flask katmanları arasında Hücre dağıtım Hücreler Multi-Flask içinde eklenir ve karıştırılır. Biz boncuk (10μm, PolySciences Inc.) Kullanarak Multi-Flask katmanları arasında hücre simüle dağıtım boyutu hücrelere benzer. Boncuk süspansiyon üst tabaka ile 10 ml pipet kullanarak Multi-Flask damar içine eklenir ve azalan gibi damar medya ile karıştırılırYukarıdaki protokol ribed. Boncuk boncuk süspansiyonu bireysel katmanların dışarı pompalanır oldu içeren her katmanı ve sıvı delik dağıtımı ile ölçüldü. Her katman kurtarıldı Boncuk konsantrasyonu bir Coulter Sayaç okuma ve kaydedildi. 3-katmanlı Çoklu şişeler (Fig.4A) eşdeğer arası katmanlı boncuk dağılımları aşağıda gösterilmiştir. Mix-port, Multi-Flask katmanları arasında hücreler ve reaktiflerin homojen dağılımını sağlar. <img alt="Şekil 4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg"> Şekil 4A: 3-katmanlı bir Multi-Flask üç katmandan her Boncuk dağıtım . (Vol, Medya ses seviyesini 01:10: boncuk süspansiyonu hacim) boncuk süspansiyon (3,6 x10 6 / ml), Multi-şişeler içine dağıtılır orta eklendi ve karışık, dengeleme ve açıklanan protokolünü kullanarak bölümü adımları takip . Her bir katman (orta her katman üzerinde delikler aracılığıyla pompalanan) kurtarıldı Boncuk konsantrasyonu Coulter Sayım okunduer ve kaydedildi. Katmanı Multi-şişeler (n = 5 şişeler) - 3 arası katmanlı eşdeğer boncuk dağılımları aşağıda gösterilmiştir Aşağıda gösterildiği desteklenmiş büyüme medya 3-katmanlı Multi-şişeler&gt;% 80 izdiham yetiştirilen hücreler Ecopack 2-293 boyanma temsilcisi görüntüleri. Hücre mono tabakaları sabit ve kristal viole ile boyandı ve Multi-Flask katmanlar daha sonra kesildi ve görüntü (2) taranır . Not hücre desenlendirme Multi-Flask (Fig.4B) tüm katmanları üzerinde homojen oldu. Birden fazla hücre tipleri değerlendirilir (veriler gösterilmemiştir) ile benzer sonuçlar elde edildi. <img alt="Şekil 4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg"> Şekil 4B: Bu rakam, Multi-Flasks katmanları arasında homojen hücre büyüme göstermektedir . 3-katmanlı Multi-şişeler ve T-175&gt;% 80 izdiham büyüdü Ecopack-2-293 hücre sabit ve kristal viole ile boyandı. Multi-Flask damarları kesilmiştir ve her vitray tabaka tarandı. 5. Çoklu-Flask Hava kaynağı. BioProfile FLEX analizörü (3,4) (Nova Biyomedikal) 96 saat için EcoPack2-293 hücre kültürü kullanarak harcanan medya analizi, Multi-5-katmanlı şişeler vs T-175 matara (81,03 yetiştirilen hücreler hava doygunluk fark olmadığını ± 1.9 vs 83.4 ± 5.8% ortam O 2). <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg"> Şekil 5: Hava harcanan medya saturasyonu (% ortam O 2) 5-katlı Multi-şişeler vs T-175 matara önceden karıştırılmış medya benzer. EcoPack2-293 hücre yoğunluğu 35.000 hücre / cm 2 numaralı seribaşı ve medya analizi (n = 3 şişeler) önce 96 saat kültüre edildi.

<ol><li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+mesurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).</li>
<li>Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+growth+assay+for+epidermal+cell+cultures+by+their+crystal+violet+binding+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Dermatol.+Res%22%5BJournal%5D)">Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity.</a> Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).</li>
<li>Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Flux+analysis+of+CHO+cell+metabolism+in+the+late+non-growth+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).</li>
<li>Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+elevated+pCO2+and+osmolality+on+growth+of+cells+and+production+of+antibody%E2%80%93fusion+protein+B1%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 21, (2005).</li>
<li>Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+culture+medium+volume+on+cell+density+and+life-span+of+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts.</a> Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).</li>
<li>Flaherty, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlaherty%2C+P+%22Tips+and+Techniques+for+enhancing+your+cell+culture%22">Tips and Techniques for enhancing your cell culture</a>. , http://www.bdbiosciences.com/hotlines/webinars/ondemand/index.jsp (2009).</li>
<li>Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanyal%2C+S+%22Scaling+up+cells+in+BD+Falcon+Cell+Culture+Multi-Flasks%22">Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks</a>. , http://www.bdbiosciences.com/documents/multiflasks-SBSposter.pdf (2011).</li>
<li>DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+coordinately+modulates+liver+transcription+factors+and+hepatocyte+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology.</a> Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).</li>
<li>Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+of+%CE%B21+integrins+for+keratinocyte+migration+in+vitro+and+during+cutaneous+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair.</a> Dev. 129, 2303-2303 (2002).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Becton Dickinson, Biosciences Segment Discovery Laboratuvar Birimi çalışanları.

Bu çalışmada, Multi-Flask tasarım araştırmacılara sunduğu verimlilik artış göstermektedir. Multi-şişeler kullanarak optimum performans için yukarıda belirtilen adımları takip etmek önemli olmakla birlikte, bu protokolü en önemli gördüğü bazı kritik adımlar vardır. Bu bölünme Multi-Flask düz yazılan döşeme katmanları (iii) her birine sıvı bölümleme sonra saat yönünde 45 ° &#39;lik açıyla Multi-Flask taşıyan gemi, (ii) içinde karıştırın bağlantı noktasını kullanarak hücrelerin ve reaktifler karıştırma (i) inkübatör. Multi-Flask doğru kullanımı (5) T-175 şişeler için birbiriyle uyumlu bir ortamda kültüre her geminin içinde homojen bir hücre popülasyonu üretimine yol açar. Bu gemiler, T-175 şişesi de benzer bir ayak izi 3 ve 5 kat daha fazla hücre sağlar. 3 ve 5 katlı gemi, sırasıyla 525 ve 875cm 2, büyüme alanı sağlar ve alanı ve işçilik &#39;ın ikisinin de teklifkullanıcılara avings. Doku Kültürü Yüzey İşleme, böylece gerek kalmadan ölçek sağlayan standart şişeler ile karşılaştırılabilir yeniden optimize mevcut kültür koşulları, kalite, homojenlik veya hücreleri (6, 7) performans ödün. Bu aynı zamanda daha önce toplanan verileri ile karşılaştırılabilir sağlar. Bu gemiler aynı zamanda kollajen gibi reaktifler ile kaplı olabilir, hepatositler 8, kertainocytes 9, serum serbest medya yetiştirilen kök hücreler gibi bazı hücre tiplerinin eki, büyüme ve farklılaşma için özel bir alt tabaka sağlamak için poli-D-lizin, fibronektin formülasyonlar. Kaplama çözümler hücreleri kültür öncesinde kaplama çözümü etkili bir şekilde kaldırılması gibi değerli reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu ile kaldırılabilir. Multi-şişeler aralığı 25-50 ml katman başına çevirmek 0,142-0,287 ml / cm 2 kültür hücreleri önerilen en iyi medya hacmi. Çok katmanlı bir başka balon, t aksinekendi ürün sağlayan damar-damar karıştırma her bir geminin içinde ve katmanlar arasındaki hücreler ve reaktiflerin tekdüze dağılım olarak aynı zamanda hızlı bir karışımı-port sunuyor. Çeşitli hücre hatları, primer kültürlerinde ve kök hücre Multi-şişeler ile verimli bir şekilde büyütülüyor edilmiştir. Bu gemiler, yüksek kapasiteli tarama, aşı üretimi, viral vektör transfections ve hücre tedavisi gibi hücre çok sayıda talep uygulamalarında özellikle avantajlıdır. Zaman, mekan, emek ve daha az atık üretimi Tasarruf tek katmanlı gemiler geleneksel kültürlere karşı Multi-Flask önemli kazançlar. Biz kültürü 5 hasat hücrelerin sayısı yaklaşık üç kat, T-175, 3 kullanarak aynı alanda bulunan şişeler, 5-katlı Multi-şişeler. Bu avantaj, yer tasarrufu T-175, sadece bunlarla sınırlı değildir, ancak aynı zamanda diğer gemilere uzatılabilir: ortak laboratuar inkübatörler evler sığar bir standart silindir şişe aparatı ~ 4 rol850cm 2 yüzey alanı sağlar ler şişeleri her biri (2200 ml). Aynı bölgede, ~~ 20, 5-katlı Multi-şişeler böylece kültür hücreleri beş kat büyüme yüzey sağlayarak yerleştirilebilir. Ayrıca, &quot;Go Green&quot; farkındalık bir artış ile, atık oluşumunu azaltmak için seçenekleri son derece arzu edilir. Bu bağlamda,% 38, T-175 matara ve bu avantajlar ile karşılaştırıldığında Multi-şişeler kullanarak atık üretiminin azalması kurşun (5, T-175 matara, biri 5 katlı Multi-Flask ~ 400g ağırlığında iken ~ 640g ağırlığında) var atık depolama ve bertaraf maliyetleri ve kullanıcıya ekonomik tasarruf sonucu meydana gelen azalma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 3-katmanlı Doku Kültürü ile tedavi edilen 525cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BD Biosciences Hücre Kültürü - BD Falcon Multi-şişeler</a> </td></tr><tr><td> 5-katmanlı Doku Kültürü ile tedavi edilen 875cm 2 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ml pipet </td><td> BD Biosciences </td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10 ml pipet </td><td> BD Biosciences </td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5 ml pipetle aspire </td><td> BD Biosciences </td><td&gt; 357.501 </td></tr><tr><td> 50 ml Polipropilen konik boru </td><td> BD Biosciences </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T-175 şişesi Doku Kültürü ile tedavi edilen </td><td> BD Biosciences </td><td> 353028 </td></tr><tr><td> Gram Kristal menekşe </td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td> Sigma </td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> ATCC </td><td> 30-2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30-2003 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Tryptose Fosfat broth </td><td> Sigma </td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK-21 hücre </td><td> Sigma </td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> Hep-G2, LnCAP </td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> Ecopack 2-293 </td><td> Clontech </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Polistiren Boncuk </td><td> PolySciences Inc. </td><td> 24628-20 </td></tr><tr><td> Bio-Profil Flex Analyzer </td><td> Nova Biyomedikal </td><td></td></tr></tbody></table>

yeni çok katmanlı bir balon kullanarak memeli hücre kültürü Ölçeği-up

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Giderek artan sayıda hücre tabanlı uygulamalar çok sayıda hücre gerektirir. Hücrelerin çok sayıda gerektiğinde, küçük ölçekli genişleme sırasında yeterli tek katmanlı T-matara, kullanımı, hantal, zahmetli ve zaman alıcı olabilir. Bu ihtiyacı karşılamak için, yeni bir çok katmanlı hücre kültürü geminin performansını kolay ölçekli T-şişeler tek katmanlı hücre kolaylaştırmak için ele alınacaktır. T-175 matara göre 5 kat formatı ve sırasıyla kültür ve tam üç kurtarma ve hücre sayısı beş kat etkinleştirmek - 3 test şişeler mevcuttur. BD Multi-Flask önemli bir özelliği de, damar karıştırma her geminin katmanları içinde ve arasında hücreler ve reaktiflerin yanı sıra tekdüze dağılım ve sürekli olduğu bir ortamda kültüre olabilir hücreleri üretmek hızlı sağlar mix / dengeleme bağlantı noktası T-175 şişeler için uyum. C için bu Multi-şişeler tasarımı da sağlaronvenient pipet şişeler doğrudan reaktifler ve hücreler ekleyerek değerli hücreleri ve reaktiflerin yanı sıra etkin kurtarma için erişim ve dökme için bağlı kontaminasyon riskini azaltır. Dökme pipetleme tercih edilir uygulamalar için, tasarım, değerli hücreleri ve reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu sağlar.

Hücreler enstrümantal bir araştırma ve artan bir rol oynar ve yeni terapötikler keşfi ve geliştirilmesi. Eklenti bağımlı hücreler büyüyen ve hasat için daha verimli ve etkin şekilde hücreler daha fazla sayıda bu artan ihtiyacı. Doğru özellikleri ile çok katmanlı bir şişenin bu amaca hizmet edebilir.

Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up

Hücre tabanlı uygulamaların artan sayısı, yüklü miktarda hücreye ihtiyaç duymaktadır. Küçük ölçekli çalışmalar sırasında yeterli olan tek katmanlı T-flaskların kullanımı...

Bu prosedürün genel amacı, üç veya beş katmanlı BD Falcon Multi flasklar kullanılarak verimliliği artırılmış homojen hücrelerin nasıl büyütüleceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle flaska besiyeri eklenmesi ve ardından bir hücre süspansiyonu ile inoküle edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, içeriğin eşit şekilde dağılması için karıştırılması ve dengelenmesidir.Üçüncü adım, taşıma bölümünü ayırmak ve kabı inkübatöre düz bir şekilde yerleştirmektir. Son adım ise çok katmanlı flaskta büyütülen hücreleri hasat etmektir. Yeni bir hücre kültürü cihazı kullanıldığı için, çok katmanlı flaskın tüm katmanlarında homojen hücre büyümesi sağlanarak, T 1 75 flasklara kıyasla nihayetinde üç ve beş kat daha fazla hücre verimi elde edilebilir.İşlem basamaklarının kavranması zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak izlenmesi şiddetle önerilir. Hücrelerin ölçeklendirilmesi için üç veya beş katmanlı istiflenebilir formatta mevcut olan çoklu flask hücre kültür kapları, sırasıyla 525 ve 875 santimetrekare büyüme yüzey alanı sağlar; pipet erişimi ise hücrelerin ve reaktiflerin kaba eklenmesini ve kaptan çıkarılmasını kolaylaştırır. Karışım portunun varlığı, kap içi hızlı karıştırmaya ve besiyerinin çoklu flaskın tüm katmanlarında eşitlenmesine olanak tanır.Hücre kültürü için çoklu flask kullanmaya, kabı steril bir laminar akışlı kabin içerisinde dikey olarak yan tarafı üzerine yerleştirerek başlayın. Kapak kısmı yukarı bakacak şekilde, herhangi bir içerik eklemeden önce bu konumdayken çoklu flaskı etiketleyin, kapağı gevşetip çıkarın. 50 ila 100 mililitrelik bir pipet yerleştirin.Ardından, çoklu flaskın her katmanına doğrudan 35 milliliters önceden ısıtılmış hücre büyüme besiyeri ekleyin. Besiyerinin köpürmesini önlemek için, sıvı akışının çoklu flaskın iç kenar duvarı boyunca ilerlemesini sağlayın. Son olarak, 10 milliliter veya daha küçük kapasiteli bir pipet kullanarak.Konsantre hücre stokundan alınan deneysel hücre süspansiyonunu, üst katmandan büyüme besiyerine ekleyin ve hücrelerin besiyeri ile ters çevirerek karıştırılmasını sağlamak ve harici olarak büyük hacimlerde hücre süspansiyonları hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırmak için flaskın kapağını kapatın. Çoklu flaskı, logo size bakacak şekilde dik tutup kaldırın ve kabı saat yönünün tersine 45 derecelik bir açıya getirin. Ardından kabı aynı açıda tutun.Çoklu flaskı, üst katmandaki sıvı karıştırma portundan tamamen aşağı süzülene kadar, boynu dışarıya bakacak şekilde önden arkaya doğru nazikçe eğin. Hücrelerin medya ile yeterince karışmasını sağlamak için kabı karıştırma portu üzerinden döndürün ve bu işlemi tekrarlayın. Ardından çoklu flaskı tekrar karışık konuma getirin.Hücre süspansiyonunu karıştırdıktan sonra, sıvı hacmini tüm katmanlar boyunca eşit şekilde dağıtmak için çoklu flaskı düz bir çalışma yüzeyine dikey olarak yerleştirin. Son olarak, sıvıyı her bir katmana bölmek için, çokla flaskı daha önce olduğu gibi logosu size bakacak şekilde tutun ve kabı saat yönünde 45 derecelik bir açıyla döndürün.Sıvının karışım portundan uzak tutulmasına dikkat edin. Hücre süspansiyonu paylaştırıldıktan sonra, çoklu flaskı, besiyerinin karışım portundan uzak olduğu şekilde aynı 45 derecelik saat yönündeki açıda tutarak inkübatöre taşıyın; kabı bu açıda tutarken, karışım portunun aksi yönündeki köşeyi pivot noktası olarak kullanarak çoklu flaskı logosu yukarı bakacak şekilde inkübatör yüzeyine doğru yavaşça yatay olarak döndürün. Ardından, hücrelerin kültür yüzeylerine eşit şekilde dağılması için kabı nazikçe ileri geri ve yanlara doğru sallayın.Sıvıların katmanlar arasında dökülmemesine dikkat ederek kapları üst üste istifleyin. İnkübatöre yerleştirildikten sonra, düz bir şekilde diğer kabın üzerine yatırırken besiyerinin bölümlenmiş halde kaldığından ve karışım portundan uzak olduğundan emin olun. Öncelikle, çoklu flaskı logosu içe bakacak şekilde dik tutun.Ardından, beş mililitrelik bir aspirasyon ucu takın ve aspirasyonu tamamlamak için tükenmiş besiyerini boşaltın. Çoklu flaskı, kabı içeriye doğru ters çevirirken saat yönünün tersine 45 derecelik açıda tutun ve maksimum geri kazanım için aspirasyona devam edin. Kap içeriye doğru ters çevrilmiş durumdayken, disosyasyon öncesinde kabı saat yönünde eğin ve karışım portunun karşı köşesindeki kalıntı hacmi aspire edin.Gerekirse, hücre monotabakaları PBS ile durulanabilir ve bir atık kabına aspire edilebilir. Şimdi tripsin EDTA ayrıştırma reaktifi ekleyin ve kabı tekrar karıştırma konumuna getirin. Ardından, az önce gösterildiği gibi reaktifin tüm tabakalara dağılmasını ve dengelenmesini sağladıktan sonra, balonu 37 °C'de istenen süre boyunca inkübe edin.İnaktivasyon reaktifi içindeki çözeltiyi nötralize edip karıştırma, dengeleme ve bölümlendirme adımlarını tekrarladıktan sonra, hücre süspansiyonunu bir toplama tüpüne boşaltın. Son olarak, çoklu flaskı karıştırma portunun ters yönünde saat yönünde 45 derecelik bir açıyla eğin. Kabı ters konumda tutun.Kalan reaktifleri toplamak için bir pipet kullanın. Hücre konsantrasyonunu belirlemek amacıyla sayım için hücrelerden bir alikot alın. Üç katmanlı çoklu flaskta büyüme ortamı kullanırken, 75 ile 150 mililitre hücre kültürü ortamı hacmi önerilir.Beş katmanlı bir çoklu flask kullanıldığında, kap başına 125 ila 250 mililitreye kadar inkübasyon yapmak mümkündür. Dissosiyasyon ajanları için, üç katmanlı çoklu flask başına 15 mililitre veya daha fazla, üç katmanlı ve beş katmanlı çoklu flasklar kullanıldığında beş katmanlı kaplar için ise 25 mililitre veya daha fazla eklenebilir. Bu sütun grafiğinde gösterildiği üzere, T 1 75 flasklara kıyasla çoklu flasklarda üç ila beş kat daha fazla baby hamster kidney hücresi büyütülmüş ve geri kazanılmıştır.Bu şekilde, bebek hamster böbrek hücreleri için birim yüzey alanı başına düşen hücre veriminin, üç ve beş katmanlı çoklu flasklar ile T 1 75 flasklarda eş değer olduğu görülmektedir. Bu veriler için uygun büyüme ortamlarında kültüre edilen bir insan prostat adenokarsinom hücre hattı, bir insan hepatik karsinom hücre hattı ve bir insan böbrek hücre hattı eco pack 2 2 9 3 kullanılmıştır. Hücre kültürü.Beş katmanlı çoklu flasklara besiyeri eklenmiş ve katmanlara ayrılmıştır. Az önce gösterilen protokole uygun olarak, ardından münferit katmanlara delikler açılmış ve her katmandaki besiyeri dışarı pompalanarak ölçülmüştür. Her katmandan geri kazanılan sıvı miktarı, katmanlar arasında nispeten tekdüze çıkmış olup bu durum, besiyerinin kap boyunca eşit şekilde dağıldığını doğrulamıştır.Bu şekildeki bölme işleminden sonra, hücrelerle benzer boyutlardaki boncuklar kullanılarak, çok katmanlı bir flaskın katmanları arasında simüle edilmiş bir hücre dağılımı gerçekleştirilmiş ve bu durum, burada sunulan katman başına sayılan boncuk verileriyle kanıtlanmıştır. Karıştırma portu, boncukların ve reaktiflerin çok katmanlı flask katmanları arasında homojen dağılımını sağlamıştır. Burada, üç katmanlı çok katmanlı flasklarda %80'den fazla konfluensle büyütülmüş hücrelerin boyama modellerine ait temsili görüntüler yer almaktadır.Takviyeli büyüme ortamında, kristal viyole ile fikse edilmiş ve boyanmış hücre monotonabakaları gösterilmektedir. Çok katmanlı flask tabakaları kesilmiş ve görüntüler taranmıştır. Çok katmanlı flaskın tüm tabakalarındaki homojen hücre örüntüsüne dikkat ediniz.Bu son şekil, bir bio profile flex analizör kullanılarak 96 saat sonra insan embriyonik böbrek hücre kültürlerinden izole edilen harcanmış besiyerlerinin analizinden elde edilen verileri göstermektedir. Beş katmanlı çoklu flasklardan karşıして T 1 75 flasklardan izole edilen besiyerlerinin hava doygunluğu arasında herhangi bir fark tespit edilmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, üretkenliği artırmak için çoklu flaskların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

scale-up-of-mammalian-cell-culture-using-a-new-multilayered-flask

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Pnömatik bir biyoreaktör kullanarak, memeli hücrelerinin büyümesi için bu tek kullanımlık biyoreaktör sisteminin montajını, çalışmasını ve performansını gösteriyoruz.

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Sürekli büyümeye göre ayarlanmış besleme kullanan besin düzenlemesi, karıştırılmış süspansiyon biyoreaktörlerindeki kültürler için aralıklı toplu beslemeye kıyasla memeli hücre sferoidlerinin büyüme oranlarını iyileştirir.  Bu çalışma, basit düzeltilmiş oranlı beslenen kültürlerin oluşturulması için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Açıklanan protokoller, laboratuvarların programlanabilir bir sıvı işleme robotu ve 96 oyuklu plakalar kullanarak minimum işçilik, deneyim ve ekipman yatırım maliyeti ile yüksek verimde ölçeklenebilir, yapışık kök hücre kültürü gerçekleştirmesine olanak tanır.  Bu sistemde 20'den fazla kez geçen iPSC'ler pluripotentliği, normal karyotipleri korudu ve kardiyomiyositlere farklılaştı.

Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Burada, gen transfeksiyonuna veya retroviral vektörlere ihtiyaç duymadan, memeli pluripotent hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için kimyasal epigenetik silme kullanımını mekanosensing ile ilgili ipuçlarıyla birleştiren bir yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, bu strateji translasyonel tıp için umut vericidir ve kök hücre organoid teknolojisinde kayda değer bir ilerlemeyi temsil etmektedir.

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Fizyolojik Boyutta Bir Mikroakışkan Kültür Cihazında Epitel Hücre Tek Katmanlarının Hazırlanması ve Yapısal Değerlendirilmesi

Burada, bir ters akış santrifüjleme sistemi kullanarak çok katmanlı şişelerden yapışkan hücreleri kapalı yarı otomatik bir şekilde toplamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, mevcut adımlarda birkaç değişiklikle diğer hücre genişletme platformlarından hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini toplamak için uygulanabilir.

Kapalı Yarı Otomatik İş Akışı Kullanarak Klinik Uygulamalar için İnsan Mezenkimal Kök Hücre İşleme

Burada, GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcılara dayanan tamamen kapalı bir sistem aracılığıyla yapışık hücrelerin büyük ölçekli üretimini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan mezenkimal kök hücrelerinin, HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin yetiştirilmesi doğrulandı ve hücre ve gen terapisi endüstrisi için hem miktar taleplerini hem de kalite kriterlerini karşıladı.

GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Öğrenin, çok katmanlı BD Falcon Multi flask kullanarak memeli hücrelerini homojen ve yüksek verimle nasıl yetiştireceğinizi. Bu yöntem, geleneksel T175 flasklara göre 3-5 kat daha fazla hücre elde etmenizi sağlar.

Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up

Daha fazla video keşfet