Name: Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan damlacık platformlarında yüksek verimli deneyler için floresan algılama yöntemlerini. Bu teknikler tek hücre analizi ve karıştırma süreçlerinin haritalanmasını mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EPSRC, HFSP, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (Hibe Numarası R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410): Yazarlar, aşağıdaki araştırma konseyleri ve hibe desteği kabul etmek istiyorum.

1. Mikroçip üretim <ol><li> SU8 ana imalat. 30 sn için 3000 rpm'de Si gofret 40 mikron yükseklik, spin kat SU8-50 (MicroChem Corp) mikroakışkan kanalları elde etmek için Yumuşak fırında sıcak bir plaka üzerinde 65 ° C 5 dakika ve 95 ° C, çözücü buharlaşması ve film sıkıştıracağını 30 dakika. Soğuduktan sonra, uygun bir maske altında SU8 300 mJ / 2 360-440 nm radyasyon ile karşı maruz kalmaktadır. Maruz kalındıktan sonra, gofret fırında 65 ° C için 2 dakika 4 dakika ve 95 ° C Soğuduktan sonra, karıştırarak, 5 dakika boyunca maruz kalmamış alanlarda (Micrpoposit EC solvent Chestech) gelişir. Kullanın 5 taze gofret yıkayın ve temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kuru çözücü EC. Hekzan ve metanol yıkar ile gofret davranın. Yüzeyine silan trikloro buharlaşan bir son adım (1,1,2,2-perfluoocytl) (40 dakika desikatöre), SU8 ana üretim süreci tamamlayın. </li><li> PDMS curing dicing ve delik delme. Yapılandırılmış mikroakışkan substratlar formu için master üzerine dökün ardından çapraz bağlayıcı reçine 10:1 (w / w) oranı Sylgard 184 (Dow Corning) karışımı ve. Bir saat sonra bir desikatöre Degas ve 65 tedavi cihazı (üst tabaka) ° C Ana kapalı tedavi PDMS ve kabuğu kesin. Akışkan borular için biyopsi yumruk kullanarak erişim delikleri oluşturun. Kür, 65 yaşında, 20 dakika boyunca PDMS başka bir katman (10x10 cm Petri kabındaki eşit olarak yayılan reçine 8 g) ° C Alt tabakasına hazırlanan üst tabaka yerleştirin ve daha sonra 65 yaşında bir gecede tedavi ° C Kullanmak için Petri kabı ve zar yongaları Peel. </li></ol> 2. Deney düzeneği <ol><li> Mikroakışkan kurulum <ol><li> Hortumun herhangi bir yerinde herhangi bir hava kabarcığı kalır sağlamak, gerekli çözümleri ile şırınga (plastik veya cam Beckton, Dickinson and Company veya SGE Analitik Bilim) doldurun. Damlacık üretimi için iki aşamadan kullanılır. Sulu (dağınık) phase ilgi reaktifler (örneğin büyüme ortamında bir hücre süspansiyon, ya da moleküler fluorophores bir çözüm) içerir. Bu durumda sürekli faz gibi davranır yağ fazında, genellikle petrol ve sürfaktan bir karışım, florlu yağı örneğin% 2 Raindance sürfaktan (Raindance Teknolojileri) (3M Fluorinert Elektronik Sıvı FC-40) oluşur ya da% 2 Açıklığı 80 Mineral yağ (Croda). </li><li> Fit bir ucunda iğneler şırınga iğne uçları aynı iç çapı boru (Polietilen borular, Harvard Apparatus). Boru, titreşim tedirginlikler nedeniyle akış kararsızlıkları en aza indirmek için mümkün olan en kısa uzunlukta kesilmiş olmalıdır. </li><li> Hortumun diğer ucu doğrudan PDMS substrat delikli deliklere takın. Silika kapiller liman veya bağlayıcılar (örneğin Upchurch Nanoports) kullanımı gibi daha karmaşık çözümler mikroakışkan cihazı ve tüp arasında daha sağlam bir arabirimi için de uygulanabilir. Prize bağlayınçipin bir koleksiyoncu (çöp toplama ya da daha fazla analit işleme) tüp ve doğrudan bağlantı noktası. </li><li> Mount bir şırınga pompası (örneğin PHD 4400 Hpsi programlanabilir şırınga pompaları, Harvard Apparatus) şırınga ve her aşaması için (genellikle dakikada mikrolitre sırasını) istenilen beslerken akış hızı tanımlamak. Yağ 1 / sulu akış oranları bir asgari oran, kararsız damlacığı oluşumundan (cihaz geometri bağlı olarak) yol açacak sulu faz, PDMS ıslatma önlemek için tavsiye edilir. Aynı nedenden ötürü, aynı zamanda sulu faz giriş ilk önce, herhangi bir mikroakışkan kanallar aracılığıyla, yağ fazı tek başına temizlemek için tavsiye edilir. Deneyler Burada kullanılan son kurulum Şekil 2a gösterilmiştir. </li></ol></li><li> Optik sistem kurulumu <ol><li> Konfokal mikroskobu (otomat ile küçük hacimlerde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip mikroakışkan kanalları içinde (birkaç pikolitre) probed Mikronaltı konumlandırma kapasite). </li><li> Yüksek kuantum verimi ile ideal bir floresan moleküller suda çözünebilen kullanın. Excite ilgili fluorofor emme eşleşen bir dalga boyunda bir lazer işletim kullanarak moleküller. Örneğin, floresein 5-izotiyosiyanat (FITC) ve Alexa Fluor 488 gibi sık kullanılan floresan moleküller verimli bir 488 nm diyot lazer (örneğin PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485) kullanılarak heyecan olabilir. Floresan moleküller, Texas Kırmızı veya Allophycocyanin (APC) gibi verimli bir şekilde kullanarak 633 nm çıkılabilir He / Ne lazer (örneğin Newport R-31.425). </li><li> Tekrarlama oranları birkaç MHz (çeşitli ns darbe ayırımlar) ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (Flim) deneyleri için yeterince farklılaşmış bir ömür boyu özellikleri ile fluorophores çalışan darbeli lazerler kullanın. </li><li> Kiriş direksiyon aynalar ve optik kiriş yüksekliğinin yanı sıra ışın yönünü kontrol etmek için kullanın. </li><li> Nesnel l içine lazer ışınını bir dikroik ayna kullanınEns. Aynı anda iki lazer kullanılırsa, bir dual-band dikroik ayna yansıması iki lazer ışınları (z488/633rdc Chroma Technology Corporation bir ayna ideal örneğin 488 ve 633 nm kirişler için) izin için monte edilebilir. </li><li> Mikroakışkan bir kanal içinde sıkı bir odak lazer ışığı getirmek için sonsuz düzeltilmiş, yüksek sayısal açıklık (NA) mikroskop objektif (yani Olympus 60 x / 1.2 NA, suya daldırma) kullanın. Uzun boylu mikro (&gt; 100 mikron) ile çalışırken kullanılan nesnel uygun çalışma mesafe Mikrokanallı tam yükseklikte etkili kapsar olmasını sağlamak için seçilmiş olması gerekir. </li><li> Aynı yüksek NA, aynı dikroik ayna aracılığıyla iletilen amaç ve (mikroakışkan kanal içinde) kullanarak örnek tarafından yayılan floresan toplayın. </li><li> Tek veya çift-bant emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir z488/633 filtre) kullanarak herhangi bir kalıntı uyarma ışık çıkarın. </li><li> Focus floresan emission bir yüzü düz diğeri dışbükey mercek (örneğin 50,2 F Newport Ltd) ile 75 mikron bir iğne deliği üzerine. Konfokal mikroskop objektif düzlemde iğne deliği yerleştirin. </li><li> Iki dedektör üzerine floresan sinyal bölmek için başka bir dikroik ayna (örn. 630dcxr, Chroma Technology Corporation) kullanın. </li><li> Bir emisyon filtresi (örneğin hq540/80 m Chroma Technology Corporation bir filtre) ile dikroik ayna tarafından yansıtılır floresan Filtre ve yüzü düz diğeri dışbükey lens ile odak (örneğin f = 30.0 id 25,4 mm, Thorlabs) ilk üzerine ( 'Yeşil') dedektörü. Ikincil bir kırmızı fluorofor ilgili deneyler başka bir emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir hq640lp filtresi) ile dikroik ayna tarafından gönderilen floresan filtre ve daha sonra ikinci dedektörü ('kırmızı') üzerine başka bir yüzü düz diğeri dışbükey lens odak. </li><li> Floresans fotonu tespiti için çığ fotodiyotlar (örneğin AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer) kullanın. Son kurulum gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 3. Damlacık üretimi ve veri toplama <ol><li> Damlacık nesil yöntemleri <ol><li> Bu damlacıkları oluşturmak için iki ana yapılandırmaları mikro kullanabilirsiniz: oluşan damlacıklar Mikrokanallı kendisi kadar geniş olduğu sürece Her iki yöntem de eşdeğer bir akış biçimi (Şekil 3a ve 3b) 6,7 odaklanma ya da T-kavşak. Sonuç olarak, iki karışmayan sıvılar bir araya getirmek ve arayüzü geliştirmek sonraki kılcal kararsızlıkları, monodisperse damlacıkları (birkaç Femtolitreden gibi küçük) kendiliğinden oluşturulur bu geometriler kullanarak ortaya çıkan kesme kuvvetlerinin. </li><li> Farklı şekillerde reaktifleri sarabiliriz: reaktifler hazırlanan ve karışık çip kapalı istenilen karışımı / konsantrasyon, ya da damlacık formasyonu (Şekil 3c) önce araya gelerek ayrı ayrı çip haline getirdi ve olabilir olabilir . Bukarışımları / konsantrasyonları sadece göreceli akış oranlarını ayarlama değiştirilebilir yılından bu yana son yöntem daha yüksek esneklik sağlar. Bu hücre kapsülleme, şırınga içinde hücre süspansiyonu, zaman ölçeği üzerinde deney hücrelerinin yoğunlaşmayı önlemek için karıştırılır gerektiğini kaydetti. </li></ol></li><li> Floresan veri toplama. <ol><li> Veri çığ fotodiyot dedektörü, (2.2.12 açıklanan), çok işlevli bir DAQ cihaza çift elektronik sinyal günlüğü (örneğin, bir PCI 6602, National Instruments), kişisel bilgisayar üzerinde çalışan. </li><li> Flim deneyler Zaman İlişkili Tek Foton Sayma dedektörleri bağlamak için (TCSPC) kartı (örneğin TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) ayrı bir PC üzerinde çalışıyor. Algılanan her floresan foton bir olay lazer darbe ilişkili olduğu ve bu nedenle her yayılan floresan foton bir gecikme süresi atanır: Bu kart bir TCSPC metodoloji kullanılarak elde edilecek floresans ömrü veri sağlar. Bu verilerfluorofor / s ışınımsal oranı katsayısı / s bir kestirim elde etmek için bir tek veya çok-üstel bozulma eğrisinin takılabilir Dedektörün cihaz tepki fonksiyonu (IRF) ham verileri Deconvolute: Bu düşük bir konsantrasyon Auramine-O çözüm (birkaç piko bir floresan ömür boyu sergiler) kullanılarak elde edilmiştir 8. </li></ol></li></ol> 4. Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama <ol><li> Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama <ol><li> Escherichia coli En canlılığı testi deney için 10 suşu kullanın. Kültür gecede Luria Bertani suyu hücreleri ve deneylere önce 0.5 optik yoğunluk maç. </li><li> 0.4 mcM SYTO9 ve 1 mcM propidium iyodür hücrelerin canlılığı saptamak için kullanın. Her ikisi de DNA intercalating boyalar ve onların floresan DNA'ya bağlanarak üzerine 20 yılı aşkın bir kat artar. SYTO9 beni bir yeşil floresan boyambrane geçirgen ve propidium iyodür membran geçirimsiz bir kırmızı floresan boya. Canlı hücrelerin ölü hücreleri, hem de 'yeşil' ve 'kırmızı' emisyon sergi Böylece 'yeşil' floresan. </li><li> Kırmızı / yeşil floresan tespiti için 2.2 tanıtıldı setup) kullanın. </li><li> Taşınabilir bir mini-manyetik karıştırıcı (Utah Biyodizel Kaynağı, Utah), hücre sedimantasyon önlemek için bir 7mm manyetik karıştırıcı ile donatılmış bir 3ml BD plastipak şırınga içinde hücre süspansiyonları karıştırmak için kullanın. </li></ol></li><li> Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama <ol><li> Damlacıkları akan boyunca hangi bir Mikrokanallı yarım yükseklikte optik prob hacmi odaklanın. </li><li> Iki sulu çözeltileri (Şekil 3c olarak), her biri farklı karakteristik floresan yaşamlarda (etkileşimli) fluorofor içeren formu damlacıkları . </li><li> Kanalın bir tarafında başlayarak, 1 mikron aralıklarla kanal tüm genişliği boyunca her deney yürütmek. Kanal edsonra floresan yoğunluğu büyük ölçüde lazer ışını yakınlığı odaklı düştükçe ges kolayca tespit edilebilir. </li><li> Yağ fazında gürültü arka sinyal patlamaları (damlacıkları ile ilişkili) ayırt etmek ve her patlama süresi kurmak için bir algoritma uygulanması. </li><li> Deney yapılmıştır belirli bir genişlikte her damla uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluğu değerleri çıkarmak için ikinci bir algoritmanın uygulanması. 9 </li><li> Sonra deneyde her damla için floresans ömrü değerlendirmek için Maksimum Olabilirlik Tahmincisi (MLE) algoritmasını kullanır. 8 deneyde tüm damlacıkları için ömür boyu değerleri ortalama MLE hesaplama son hata (daha damlacıkları probed azaltır hata daha küçük). </li><li> Bir ömür boyu yörüngesini her genişliği elde edildikten sonra, 2B harita tüm yörüngeleri birleştirir. Her bir özellikle yaşam boyu değeri ile ilişkili olduğundanlar iki fluorophores karışımı bir konsantrasyon (veya karıştırma) harita böylece elde edilebilir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, damlacık karıştırma 3D harita mikroakışkan kanal yüksekliği boyunca farklı pozisyonlarda bu protokol tekrarlayarak kolaylıkla elde edilebilir. </li></ol></li></ol> 5. Veri analizi <ol><li> Ham deneysel veri dosyaları uygun bilgisayar diline yeniden yorumluyoruz böylece daha da analiz edilebilir (foton sayıları zamanla değişim içeren örneğin, metin dosyaları, veri işleme ve analiz için kolayca Matlab içine ekstrakte edilebilir). MLE algoritmaları çalıştırmak veya ömür boyu yörüngeleri karıştırma patters 2B haritalar oluşturmak için daha karmaşık denemeler dosyaları (Flim için olanlar gibi) veya sipariş yer alan verilere erişmek için özel bir kod yazmak zorunda kalabilirsiniz. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Hücre tanıma Tipik örnekler variation hücre tabanlı deneyler için zamanın bir fonksiyonu olarak foton sayısı iki yüz milisaniyelik bir süre içinde, Şekil 4a ve c gösterilmiştir. Önemlisi Luria-Bertani suyu (LB orta) sulu damlacık sınırlarını tanımlayan zayıf floresanlama bir arka plan olarak görür, tek tek hücrelerin varlığı ile ilgili ayrı bir foton patlamalarının ise bu arka plan üstüne ayırt edilebilir. LB floresan arka plan, yaklaşık dikdörtgen bir kesit (kırmızı ve yeşil noktalı çizgi ile işaretlenmiş) ile karakterize edilir. E. kaynaklanan floresan patlamaları tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) coli hücrelerinde göre damlacıklarının uzunluğu (40 mikron, 30 picolitres bir birime karşılık gelen) ve E. ile uyumlu arka plan damlacık olaylar, daha 30 kat daha kısa . coli hücreleri (1.5-2.0 mikron) 10 Çift kanallı tespit ileiyon sistemi, canlı hücreleri veya ölü hücrelerin varlığı, yeşil ve kırmızı kanalları analizi ayırt edilebilir. Şekil 4 b ve d damlacık başına hücre sayısını açıklayan olasılık dağılımı gösterir . Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama Moleküler floresans ömrü sadece kimyasal çevre tarafından etkilenen bir birey fluorofor, kendine özgü bir özelliğidir. Buna göre ölçümler, konsantrasyon, uyarım yoğunluğu ve optik toplama gibi deneysel faktörler (bağımlı zaman entegre floresans ölçümleri, daha üstün çözünürlük ve hassasiyet ile çevre bilgileri (pH, sıcaklık, polarite ve viskozite gibi) elde etmek için kullanılır. verimlilik). 9,11 Yerde olduğu gibi sunulan, 8 di iki fluorophores kullanarak damlacıkları içindeki karıştırma desen haritası mümkündürfferent ömrü değerleri. 1 no'lu denklemde görüldüğü gibi iki (etkileşimli) floresan türleri içeren bir karışımı çürüme biexponential formu alacaktır: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="Denklem 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 1"> Bireysel yaşamlar τ1 ve τ2 olarak tanımlanan ve her bir bileşenin genlik sırasıyla α1 ve α2 tarafından verilmektedir. Ortalama ömrü, daha sonra şu şekilde tanımlanabilir: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="Denklem 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 2"> Β1 ve β2 her bir bileşenin fraksiyonu ve aşağıdaki gibi tanımlanır: <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="Denklem 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 3"> Prob hacmi sabittir ve damlacıkları o konumda boyunca akan bu yana, ömür boyu bir yörünge uzunluğu boyunca bu özel genişlik damlacıklarının değerleri bu şekilde elde edilebilir. Averag belirli bir genişlik için karakteristik bir yörüngeŞekil 5a ed, 6000 damlacıkları arasında görülebilir. Kanalın tüm genişliği boyunca yörüngeleri birleştiren bir 2D konsantrasyonu (karıştırma) harita oluşmasına yol açar. Tipik bir sonuç Şekil 5b sunulmuştur. Damlacıkları çok sayıda arasında ortalama, standart hata, elde edilen sonuçların büyük ölçüde azalır (Şekil 5a% 95 güven aralığı, standart hata% 1) olabilir . Ömrü yörünge belirleme yöntemini tüm damlacıkları hemen hemen aynı olduğunu varsayar. Damlacıkları önemli ölçüde farklı olsaydı, elde edilen ortalama ömrü yörüngeleri (ve ortalama damlacıklarının uzunluğu boyunca ömür boyu sürekli keskin farklılıklar tespit edilir), daha az uzaklaşan profilleri düz olurdu: Bu iki ana nedenden dolayı, büyük ölçüde doğru olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, sonuçlar ne olursa olsun bireysel olarak tekrarlanabilir.damlacıkları analiz veya damlacıklar miktarı hesaplamalarında kullanılacak. 8 <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 mikroakışkan çip imalat süreci akış. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, damlacık oluşumu için mikroakışkan yongası bağlı şırınga pompaları ve şırıngalar, temsil eden) Diyagramı, iki lazer için tipik bir optik kurulum b) şematik iki fluorofor (yeşil ve kırmızı) uyarma ve algılama . DC = Dikroik ayna, EM = Emisyon filtresi, L = Lens, PH = deliği, APD = Çığ fotodiyot dedektörü. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. On-chip damlacığı oluşumundan stratejileri: a) akış odaklama yapılandırma; b) T-kavşak yapılandırma. c) dr çip kapsüllemebaşlangıçta ayrı iki sulu reaktifler oplets. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 (a) ölüler için 0.2 s izleri Optik okuma ve (c), canlı hücreleri (hücre süspansiyonu için akış oranları: 1 ul dk -1, yağ: 2 ul min -1) . Her kemer şeklindeki sinyal kesik çizgiler ile işaretlenmiş damlacık sınırları, sulu damlacık formları zayıf floresan LB orta karşılık gelir. Yeşil sinyaller, 633 nm dalga boyları üzerinde 633nm ve kırmızı sinyaller altında okuma temsil eder. Hücreler DNA intercalating boyalardan kaynaklanan dikey başak tarafından ayırt edilir. (B) ölü hücreler ve (d) canlı hücreler için tek damlacıkları içinde hücre doluluk için olasılık dağılımı. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 uzunluğu boyunca belirli bir genişlikte bir damlacık a) Tipik ortalama ömrü yörünge; b)(% FITC /% Str-AF488 olarak ifade ya da konsantrasyon), 2D bir ömür boyu harita içine damlacıkları tam genişliği boyunca bütün ortalama yörüngeleri kombinasyonu tipik gösterimi araştırdı.

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

Biz mikroakışkan bir cihazın fabrikasyon, deneysel bir kurulum ve Mikrodamlacık oluşumu ve reaktif kapsülleme ve işlenmiş damlacıklarının optik algılama için ilgili protokoller tanımlanmıştır. (Damlacıkları tek hücrelerin saptanması ve akan damlacıklar içinde karışım süreçleri haritalama) seçilen iki örnek, şu anda damlacık Mikroakiskan araştırılmaktadır yaygın uygulamalar temsil eder. Sunulan deneylerin de gösterdiği gibi, damlacık mikroakışkan platformlarının kullanımı olsa da, yüksek kapasiteli, yarı mükemmel hapsi, yüksek tekrarlanabilirlik ... büyük miktarda üretilen bilgilerin ve bu bilgilerin üretilen olduğu yüksek hız gibi bazı çekici özellikleri, mevcut ise tam olarak yararlanmak, bu minyatür platformlardan elde edilecek yüksek uzaysal çözünürlüğü ile hızlı algılama yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Bu durumda biz bu olduğunu göstermektedirson derece hassas floresan spektroskopik teknikleri kullanarak. Özellikle, Flim algılama tekniği (bir kaç ns olarak tekrarlama dönemleri ile kısa darbeli lazer kullanımı kılan), hızla akan damlacıklar (saniyede yaklaşık 200), çok hızlı bilgi almak için kapasitesini ortaya koymaktadır. Bu durumda, tespit edilen olayların zaman çözünürlüğü 1 μs gibi düşük oldu. Damlacık boyutu ve konsantrasyon sınırları açısından büyük sayısal diyafram lensler ve daha büyük güç lazerlerin kullanımı kolay, 5 mikron (damlacık boyutu sınırlamaları fotolitografik kararları tarafından dayatıldığı gibi küçük damlacıklar içinde nM konsantrasyonları tespit izin verecek Mikronaltı konumlandırma aşamasında üretim süreci). Mikroakışkan damlacıkları tek bir hedef / olay, küçük miktarlarda reaktifleri içeren büyük ölçekli deneyler yürütmek için ideal adaylardır. Bu teknolojinin mevcut sınırlamalar dr oluşturmak için zorluk içerirYüksek verimli bir şekilde farklı kaynaklardan geniş bir yelpazede (onlarca veya yüzlerce) oplets. Ayrıca, üretilen, tek tek her damla hedef ve işlemek için zorluk, bu tekniklerin pratik uygulanabilirliği ciddi sınırlamalar getirmektedir. Bu nedenle, bu konularda araştırma ve analiz, yüksek hacimli uygulamalar standart bir referans yöntem haline mikroakışkan damlacık platformları sağlayacak gerekli teknolojik çözümler geliştirmeye yönelik önemli araştırma çabalarının merkezinde yer almaktadır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Floresein 5-izotiyosiyanat (FITC) </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin-Alexa Fluor 488 </td><td> Reaktif </td><td> Moleküler Probları </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 silikon elastomer kiti </td><td> Reaktif </td><td> Premier Farnell UK LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramine-O </td><td> Reaktif </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm diode lazer darbeli </td><td> Ekipman </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Kart </td><td> Ekipman </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> dikroik ayna </td><td> Ekipman </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Mikroskop hedefi </td><td> Ekipman </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Çığ fotodiyot </td><td> Ekipman </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidium İyodür </td><td> Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli top 10 suşu </td><td> Hücreler </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

mikroakışkan damlacık platformları için floresan algılama yöntemleri

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Kimya ve biyoloji gerçekleştirmek için mikroakışkan platformların geliştirilmesi, büyük bir kısmı sistem minyatürleştirme eşlik potansiyel yararları bir dizi tarafından tahrik edilmiştir. Avantajları verimli bir örnek, işlevsel bileşenleri facile entegrasyon, büyük ölçekli çoklama, gelişmiş analitik verim, gelişmiş kontrol ve azaltılmış enstrümantal ayak izleri doğru içsel bir yatkınlık femoto-litre hacimli nano işleme yeteneği dahil 1 Son yıllarda çok fazla ilgi damlacık tabanlı (ya da bölümlenmiş akışı) mikroakışkan sistemleri ve yüksek verimli bir deney platform olarak potansiyel gelişimi üzerine odaklanmış bulunmaktadır. 2-4 su-yağ emülsiyonu kendiliğinden mikroakışkan kanal oluşturmak için yapılır bir sonucu olarak iki farklı fazın arasında kılcal kararsızlıkları. Önemlisi, kesin olarak tanımlanmış hacimler ve kompozisyonlar microdroplets frekanslarda oluşturulabilirbirkaç kHz. Ayrıca, sürekli bir karışmayan faz, örnek çapraz konuşma ve dağılım (difüzyon ve Taylor tabanlı) ile ayrılmış izole bölmeleri içinde ilgi reaktifler encapsulating tarafından bertaraf edilebilir, minimum çapraz kontaminasyon ve analitik süreçlerin zaman yeteneği yol açar büyük doğruluk ile. Ayrıca, damlacıklar içeriğini ve kanal duvarları (sürekli faz ile ıslatılmış) arasında herhangi bir temas olmadığı için emilimi ve kanal duvarlarına reaktiflerin kaybı önlenir. Bu tür damlacıkları oluşturulur ve işlendikten sonra, gerekli analitik bilgileri ayıklamak için gereklidir. Bu bağlamda seçim algılama yöntemi, hızlı, yüksek duyarlılık ve algılama düşük limitler sağlamak, moleküler türlerin bir dizi için geçerli olmalıdır, tahribatsız ve uyduruk bir şekilde mikroakışkan cihazlara entegre edilmek üzere mümkün. Olarak geliştirilen bu ihtiyacı karşılamak içindeney araçları ve büyük miktarda küçük hacimli ortamlarda photophysical bilgi çıkarma sağlamak, fiziksel, kimyasal ve biyolojik parametreler geniş bir analizi için geçerli protokolleri uite. Burada bu yöntemlerin iki örnek sunuldu ve tek hücreleri ve pikolitre hacmi damlacıkları içinde karıştırma işlemleri haritalama tespiti için uygulanır. Biz mikroakışkan çip imalatı, optik kurulum ve damlacık oluşturma ve algılama süreci de dahil olmak üzere tüm deneysel süreci raporu.

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Kimya ve biyoloji çalışmaları yürütmek için mikroakışkan platformların geliştirilmesi, büyük ölçüde ... tarafından desteklenen bir dizi potansiyel fayda ile yönlendirilmiştir.

Merhaba, ben Jersey. Merhaba, benim adım Shabi; her ikimiz de Imperial College London'da, Profesör Andrew Di Melo ve Dr. Josh Del ile mikroakışkan damlacık platformları üzerine çalışan doktora sonrası araştırmacılarız. Damlacık tabanlı mikroakışkan platformlar, çok yüksek ve hassas şekilde tanımlanmış hacimlerde üretilebildikleri ve üretim frekansları saniyede birkaç bin damlacığa kadar çıkabildiği için daha yüksek verimli deneyler adına gelecek vadeden adaylardır.Ayrıca, ilgi alanı birkaç litrelik bölmeler içinde hapsedilebildiği için hem çapraz etkileşim hem de dağılım ortadan kaldırılabilir ve analitik süreçler daha yüksek doğrulukla zamanlanabilir. Grubumuzda, mikro damlacık platformlarını birçok uygulamada başarıyla hayata geçirdik. Örneğin; polimeraz zincir reaksiyonu, nanoparçacık sentezi ve tek moleküler hücre analizi.Bu sistemler bünyesinde üretilen büyük miktardaki bilgiler verimli bir şekilde çıkarılmalı, dizginlenmeli ve kullanılmalıdır. Bu bağlamda, tercih edilen tespit yönteminin uygun olması, yüksek hassasiyet ve düşük tespit limitleri sağlaması, çeşitli moleküler türlere uygulanabilir olması, tahribatsız olması ve mikroakışkan cihazlarla kolay bir şekilde entegre edilebilmesi gerekir. Bu ihtiyaca cevap vermek amacıyla, küçük hacimli ortamlardan büyük miktarlarda fiziksel bilgi çıkarılmasını sağlayan ve geniş bir yelpazedeki fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerin analizinde uygulanabilen bir dizi deneysel araç ve protokol geliştirdik.Bu protokolde, tek hücrelerin tespitine ve Dropbox'taki karıştırma süreçlerinin haritalanmasına uygulanan iki yöntemi sunacağız. Mikroakışkan çipler geleneksel olarak fotolitografi yöntemleri kullanılarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerinden üretilir. Mikroakışkan kanallar elde etmek için bu işlem bir temiz oda tesisinde gerçekleştirilmelidir; silikon gofret üzerine Spincoat ile SU-8 50 uygulayın, çözücüyü buharlaştırmak ve filmi yoğunlaştırmak için sıcak tablada 65 °C ve 95 °C'de yumuşak pişirme (soft bake) yapın, soğuduktan sonra SU-8 direnci uygun maske altında UV radyasyonu ile pozlayın ve ardından soğumayı takiben gofreti 65 °C ve 95 °C'de pişirin.Karıştırarak, uygun geliştirme çözeltisini kullanarak pozlanmamış alanları geliştirin. Gofreti durulamak için taze EC solventi kullanın ve ardından temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kurutun. Gofreti heksan ve metanol yıkamaları ile işleyin.Ayrıca kalıp ana üretme sürecini tamamlamak için, bir desikatör içerisinde yüzeye 40 dakika boyunca sabitleyici bir ajan buharlaştırın. Yapılandırılmış mikroakışkan altlıklar oluşturmak için, reçine çapraz bağlayıcıyı 10'a 1 oranında S guard 1 8 4 ile karıştırın ve bunu ana kalıbın üzerine çekin. Bunu bir desikatörde vakumlayarak gazını alın ve cihazı 65 °C'de kürleyin.Kürlenmiş PDMS'i kesin ve kalıptan soyun. Bir biyopsi punch'ı kullanarak akışkan boruları için erişim delikleri açın. Başka bir PDMS tabakasını 65 derecede 20 dakika boyunca kürleyin.Hazırlanan üst katmanı alt katman üzerine yerleştirin ve 65 derecede gece boyunca kürleyin. Çipleri Petri kabından soyun ve küpler halinde kesin. Çipler üretildikten sonra, ilgili çözeltilerin infüzyonu ile kullanıma hazır hale gelirler.Şırıngaları, boru hatlarının hiçbir bölümünde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak gerekli çözeltilerle doldurun. Damlacık üretimi için iki faz kullanılır. Sulu dağılmış faz, ilgili reaktifleri içerir.Yağ fazı sürekli faz görevi görür; bir ucu şırınga iğne uçlarıyla aynı iç çapta olan boruları iğnelere takın, şırıngaları bir şırınga pompasına monte edin ve istenen infüzyon akış hızını belirleyin. Her faz için, sulu fazın PDMS'yi ıslatarak dengesiz damlacık oluşumuna yol açmasını önlemek amacıyla, yağ/sulu faz akış hızları için minimum bir oran önerilir. Boruların diğer uçlarını doğrudan PDMS substratında açılmış deliklere bağlayın.Daha karmaşık çözümler için silika, kapiler portlar veya konnektörler de uygulanabilir. Çipin çıkış portunu tübe bağlayın ve atık toplama veya daha ileri analiz işlemleri için bir toplama kabına yönlendirin. Kurulum tamamlandığında, damlacık üretmek için iki ana mikrokanal konfigürasyonu mevcuttur: akış odaklama veya T-eklemi formatı; bu geometrilerin iki kabul edilebilir akışkanı bir araya getirmek için kullanılmasıyla ortaya çıkan makaslama kuvvetleri ve arayüzde gelişen ardışık kapiler instabilite sonucunda damlacıklar oluşur.Birkaç femtolitralık küçük, tekil dağılmış damlacıklar kendiliğinden oluşur. Damlacıklar oluşmaya başladıktan sonra, bir optik düzenek kullanılarak incelenebilirler. Optik sistem aşağıdaki protokole göre kurulur.Otomatik altmikron konumlandırma kapasitesine sahip bir konfokal mikroskop ve ilgili floroforların absorbansı ile eşleşen bir dalga boyunda çalışan bir lazer kullanın. Floresan ömür görüntüleme için bunları uyarmak amacıyla, birkaç megahertz tekrarlama hızlarında çalışan bir darbeli lazer kullanın. Balgam deneylerinde, ışın yüksekliğinin yanı sıra ışın yönünü kontrol etmek için ışın yönlendirme aynaları ve optikler kullanılır.Lazer ışınını objektif merceğe yansıtmak için bir dikroik ayna kullanın. Eğer iki lazer aynı anda kullanılıyorsa, çift bantlı bir dikroik ayna kurulabilir. İki lazer ışınının yansımasını sağlamak için, lazer ışığını bir mikroakışkan kanal içinde dar bir odak noktasına getirmek amacıyla sonsuz düzeltmeli yüksek sayısal açıklıklı (NA) bir mikroskop objektifi kullanın.Aynı yüksek NA objektif kullanılarak mikroakışkan kanal içindeki örnekten yayılan floresansı toplayın ve aynı dikroik aynadan geçirin. Tek veya çift bantlı bir emisyon filtresi kullanarak kalıntı eksitasyon ışığını giderin. Floresan emisyonunu 75 mikrometrelik bir pinhole üzerine odaklayın.Plano konveks bir lens kullanarak, iğne deliğini mikroskop objektifinin konfokal düzlemine yerleştirin. Floresan sinyalini iki dedektöre ayırmak için başka bir dikroik ayna kullanın.Dikroik ayna tarafından yansıtılan floresan ışımayı bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve düz konveks bir lens kullanarak ilk dedektör üzerine odaklayın. İkincil bir kırmızı florofor içeren deneyler için, dikroik ayna tarafından geçirilen floresan ışımayı başka bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve ardından başka bir düz konveks lens ile ikinci dedektör üzerine odaklayın. Floresan fotonlarının tespiti için avalanche fotodiyotlar kullanın.Floresans veri toplama işlemi için, avalanche photo diode dedektöründen gelen elektronik sinyali, kişisel bir bilgisayar üzerinde çalışan veri kaydı için çok fonksiyonlu bir DAQ cihazına bağlayın. Balgam deneyleri için, bir darbeli lazer kullanın ve dedektörleri, ayrı bir bilgisayar üzerinde çalışan bir zamanla ilişkili tek foton sayım (TCS) PC kartına bağlayın. Bu kart, floresans ömür verilerinin elde edilmesini sağlar.TCS PC metodolojisi kullanılarak; saptanan her floresan foton, gelen bir lazer darbesiyle ilişkilendirilir ve böylece yayılan her floresan fotona bir gecikme süresi atanır. Bu veriler, floroforların radyatif hızına dair bir kestirim elde etmek amacıyla tekli veya çoklu eksponansiyel sönümlenme eğrisine uydurulabilir.Hücrelerin biyolojik, fiziksel ve kimyasal perspektiflerden oldukça heterojen olduğunu artık biliyoruz. Bu nedenle, ideal olarak her hücreyi tek tek analiz etmeliyiz. Ancak, güvenilir ve anlamlı bir sonuca varmak için yeterli nicel bilgiyi toplayabilmemiz amacıyla analizlerin yüksek verimlilikle gerçekleştirilmesi gerekmektedir.Burada, işlemin nasıl gerçekleştirileceğini göstermek amacıyla, E. coli hücrelerinin tek bir damlacığa enkapsülasyonuna dair bir örnek sunulmuştur. Gece boyunca kültüre edilmiş E. coli TOP10 suşu kullanın. Hücrelerin canlılığını tespit etmek için cyto nine ve propidyum iyodür kullanın.Her iki boya da DNA etkileşimli boyalardır ve floresan yoğunlukları 20 kattan fazla artar. DNA'ya bağlandığında cyto nine, membran geçirgenliği olan yeşil floresan bir boyadır; propidium iodide ise membran geçirgenliği olmayan kırmızı floresan bir boyadır.Böylece canlı hücreler yeşil floresan yayarken, ölü hücreler hem yeşil hem de kırmızı emisyonlar sergiler. Burada, T bağlantısı ile damlacık oluşumunu ve tek bir hücrenin enkapsülasyonunu görebiliriz. Bu video yüksek hızlı bir kamera ile kaydedilmiştir, ancak damlacıklar saniyede binlerce adet olacak şekilde üretilebilir.Hücreler enkapsüle edilirken, üretilen damlacıklardan daha az hücre bulunması için hücre kültürünün seyreltildiğinden ve hücrelerin şırıngada veya tüplerde meydana gelebilen çökelmenin önlendiğinden emin olunmalıdır. Hücrelerin çözelti içinde eşit şekilde dağılmasını sağlamak için şırınganın içinde manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Şırıngayı mikroçipe bağlamak için 50 micrometers kalınlığında çok ince tüpler kullanın.Bu, tüp içerisinde hızlı bir akış hızı sağlayarak hücrelerin çökelmesini önler. Burada, hücre tabanlı deneyler için zamana bağlı foton sayımlarının tipik örnekleri yer almaktadır. Damlacıklar içindeki karıştırma süreçlerini haritalamak için.Farklı ömürlere sahip iki farklı florofor kullanılarak damlacıklar oluşturulabilir. Akan bir damlacık içerisinde, başlangıçta ayrı olan iki çözeltiyi karıştırarak karıştırma işlemini geliştiren bir akış alanı oluşturulur. Kıvrımlı kanallar kullanılarak akış alanının simetrisi değiştirilebilir.Damlacıkları incelemek için, optik prob hacmini damlacıkların aktığı bir mikrokanalın yüksekliğinin yarısına odaklayın; kanalın bir tarafından başlayarak her deneyi kanal boyunca tüm genişlikte, bir mikrometrelik aralıklarla gerçekleştirin. Damlacıklarla ilişkili tekil patlamaları (burst), yağ fazının gürültü arka planından ayırt etmek ve her patlamanın süresini belirlemek için bir algoritma uygulayın.Deneyin gerçekleştirildiği belirli genişlikte, her bir damlacığın uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluk değerlerini çıkarmak için ikinci bir algoritma uygulayın. Ardından, deneydeki her bir damlacığın floresan ömrünü değerlendirmek için bir maksimum olabilirlik kestirimi (MLE) algoritması kullanın. Deneydeki tüm damlacıklar için ömür değerlerinin ortalamasını almak, MLE hesaplamasının nihai hatasını azaltır.Sonda ile daha fazla damlacık incelendikçe, bir ömür yörüngesi elde edildikten sonra hata miktarı azalır. Her genişlik için tüm yörüngeleri 2B bir haritada birleştirin. Her ömür değeri iki floranın belirli bir karışımıyla ilişkili olduğundan, bu sayede bir konsantrasyon veya karışım haritası elde edilebilir.Mikro damlacık oluşumu, bölge enkapsülasyonu ve bu işlemin optik tespiti için bir mikro cihazın üretimi, deneysel düzeneği ve ilgili protokolleri tanımladık. Seçilen iki örnek, damlacıklardaki tek hücrelerin tespitini ve damlacık içindeki karıştırma süreçlerinin haritalanmasını temsil etmektedir; bunlar, günümüzde damlacık mikroakışkanları ile araştırılan yaygın uygulama alanlarıdır.Sunulan deneylerin gösterdiği üzere, damlacık mikroakışkan platformlarının kullanımı; mükemmel sınırlama ve daha yüksek tekrarlanabilirlik gibi yüksek verimlilik sağlayan bazı çekici özelliklere sahiptir. Üretilen bilgi miktarının fazlalığı ve bu bilginin üretilme hızının çok yüksek olması, bu minyatürize platformlardan tam anlamıyla yararlanabilmek için en yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hızlı tespit yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir.Bu çalışmada, yüksek hassasiyetli florlu spektroskopik teknikler kullanarak bunun mümkün olduğunu gösteriyoruz.

fluorescence-detection-methods-for-microfluidic-droplet-platforms

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Lensless bir çip üzerinde floresan mikroskobu platformu göstermiştir floresan nesneler, örneğin bir ultra-geniş alanda-görünüm görüntü&gt; &lt;4μm çözünürlük çözme algoritması tabanlı bir basınç örnekleme yöntemiyle 0,6-8 cm2. Böyle bir kompakt ve geniş alan floresan çip üzerinde görüntüleme yöntemidir yüksek verimli sitometri, nadir hücre araştırmaları ve mikroarray-analiz için değerli olabilir.

Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

Damlacık mikroakışkanlarında çok renkli floresan algılama, tipik olarak hacimli ve karmaşık epifloresan mikroskobu tabanlı algılama sistemlerini içerir. Burada, tek bir fotodetektör tarafından toplanan çok renkli verileri geçici olarak kodlamak için bir dizi optik fiber kullanan kompakt ve modüler çok renkli bir algılama şemasını açıklıyoruz.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Bu eser bir pnömatik damlacık manipülasyon platformunda çoklu nükleotid polimorfizmi tespit etmek için basit ve görsel bir yöntem sunar. Damlacık manipülasyon ve çoklu nükleotid polimorfizmlerinin tespiti de dahil olmak üzere önerilen yöntem, tüm deney ile, ileri araçların yardımı olmadan, 23 ° C civarındaki gerçekleştirilebilir.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm2 düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Protokol, bireysel insan periferik kan mononükleer hücrelerinin sitokin sekresyon dinamiklerini kantitatif olarak ölçmek için gelişmiş bir mikroakışkan platformu tanımlar. Platform, örnek olarak lipopolisakkarit ile uyarılan her bir hücre için paralel olarak üç adede kadar sitokini (IL-6, TNFa ve IL-1β) ölçer.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Bakterilerde plazmit retansiyonunun paralelleştirilmiş analizi için erişilebilir, açık kaynaklı bir mikroakışkan iş akışı sunulmaktadır. Jel mikro damlacıklar içindeki tek hücreli mikrokolonilerde plazmit varlığını ölçmek için floresan mikroskobu kullanan bu yöntem, geleneksel plaka sayımına kesin, erişilebilir ve ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

Açık Kaynak Damlacık Mikroakışkanları ile Plazmid Stabilite Analizi

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Öğrenin, mikroakışkan damlacık platformlarında yüksek verimli deneyler için floresan algılama yöntemlerini. Bu teknikler tek hücre analizi ve karıştırma süreçlerinin haritalanmasını mümkün kılar.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Daha fazla video keşfet