Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Merhaba, ben Jersey. Merhaba, benim adım Shabi ve ikimiz de Imperial College of London'da doktora sonrası araştırmacılarız, Profesör Andrew Di Melo ve Dr.Josh Del ile mikroakışkan damlacık platformlarında çalışıyoruz. Damlacık tabanlı mikroakışkan platformlar, çok yüksek verimli deneyler için adaylar vaat ediyor, çünkü çok yüksek kesin olarak tanımlanmış hacimlerde üretilebiliyorlar ve rakipleri, üretim frekansı birkaç kilo kadar yüksek olabilir.

Ayrıca, ilgilenilen bölge birkaç litre gibi bölmelere yerleştirilebildiğinden, hem karışma hem de dağılma ortadan kaldırılabilir ve analitik işlemler daha yüksek bir doğrulukla zamanlanabilir. Grubumuzda, mikro damlacık platformlarını birçok uygulamaya başarıyla uyguladık. Örneğin, polimeraz zincir reaksiyonu, nanopartikül sentezi ve tek moleküler hücre tahlili.

Bu sistemlerde üretilen büyük miktarda bilgi verimli bir şekilde çıkarılmalı, kullanılmalı ve kullanılmalıdır. Bu bakımdan, tercih edilen algılama yönteminin doğru olması, yüksek hassasiyet ve düşük algılama limitleri sağlaması, bir dizi moleküler türe uygulanabilir olması, tahribatsız olması ve mikroakışkan cihazlarla kolay bir şekilde entegre edilebilmesi gerekmektedir. Bu ihtiyacı karşılamak için, küçük hacimli ortamlardan büyük miktarlarda fiziksel bilginin çıkarılmasını sağlayan ve çok çeşitli fiziksel, kimyasal ve biyolojik bilgilerin analizine uygulanabilir bir dizi deneysel araç ve protokol geliştirdik.

Bu protokolde, Dropbox'ta tek hücrelerin tespiti ve karıştırma işlemlerinin haritalandırılması için uygulanan yöntemleri sunacağız. Mikroakışkan çipler geleneksel olarak fotolitografi yöntemleri kullanılarak poli dimetil Sloane PGMS'de üretilir. Bu işlem, mikroakışkan kanallar elde etmek için temiz oda tesisinde gerçekleştirilmelidir Spinco, SU eight 50 silikon gofret üzerinde 65 derece ve 95 derecede sıcak bir plaka üzerinde yumuşak fırında çözücüyü buharlaştırmak ve soğuduktan sonra filmi yoğunlaştırmak, SU sekizini maruz bırakmak, uygun maske altında UV radyasyonuna direnmek, Daha sonra gofreti soğuduktan sonra 65 derece ve 95 derecede pişirin.

Karıştırırken uygun geliştirme solüsyonunu kullanarak maruz kalmayan alanları geliştirin. Gofret'i durulamak için taze EC çözücü kullanın ve ardından temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kurutun. Gofrete heksan ve metanol yıkamaları uygulayın.

Ayrıca esate ana imalat işlemini tamamlamak için, bir tutma maddesini 40 dakika boyunca bir kurutma içinde yüzey üzerinde buharlaştırın. Yapılandırılmış mikroakışkan substratlar oluşturmak için, S guard 1 8 4'ü 10'a bir oranında reçine çapraz bağlayıcıda karıştırıyoruz ve bunu master'ın üzerine çekiyoruz. Bunu bir kurutucu içinde gazdan arındırın ve cihazı 65 derecede sertleştirin.

Kürlenmiş PDMS'yi kesin ve master'dan soyun. Biyopsi zımbası kullanarak akışkan borular için erişim delikleri oluşturun. Başka bir PDMS katmanını 65 derecede 20 dakika boyunca sertleştirin.

Hazırlanan üst katmanı alt katmana yerleştirin ve gece boyunca 65 derecede kürleyin. Cipsleri Petri kabından soyun ve zar atın. Çipler üretildikten sonra, ilgilenilen çözeltiler aşılanarak kullanılmaya hazır hale gelirler.

Şırıngaları gerekli solüsyonlarla doldurun ve borunun hiçbir yerinde hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Damlacık üretimi için iki faz kullanılır. Sulu dağılmış faz, ilgilenilen reaktifleri içerir.

Yağ fazı, şırınga iğnesi uçları ile aynı iç çapa sahip sürekli faz geçme borusu görevi görür, bir uçta iğnelere şırıngaları bir şırınga pompasına monte eder ve istenen infüzör akış hızını tanımlar. Her faz için, PDMS'nin sulu faz tarafından ıslanmasını önlemek için minimum bir yağ sulu akış hızı oranı önerilir, bu da kararsız damlacık oluşumuna yol açacaktır. Borunun diğer uçlarını doğrudan PDMS alt tabakasında açılan deliklere bağlayın.

Daha karmaşık çözümler için silika, kılcal portlar veya konektörler de uygulanabilir. Çipin çıkış portunu boruya bağlayın ve atık toplama veya daha fazla analiz işlemi için doğrudan bir toplayıcıya bağlayın. Bu bir kez kurulduktan sonra, kabul edilebilir iki sıvıyı bir araya getirmek için bu geometrilerin kullanılmasından kaynaklanan saf kuvvetlerin bir sonucu olarak damlacıklar akış odaklaması veya bir T bağlantı formatı oluşturmak için iki ana mikro kanal konfigürasyonu ve arayüzde gelişen müteakip kılcal damarlar vardır.

Birkaç femtolitre kadar küçük bir oh dağılmış damlacıklar kendiliğinden üretilir. Damlacıklar oluşturulduktan sonra, optik bir kurulum kullanılarak incelenebilirler. Optik sistem aşağıdaki protokole göre kurulur.

Otomatik mikron altı konumlandırma kapasitesine sahip bir konfokal mikroskop ve ilgili Fluor şelalelerinin absorpsiyonuna uyan bir dalga boyunda çalışan bir lazer kullanın. Onları heyecanlandırmak için, floresan ömür boyu görüntüleme için birkaç megahertz tekrarlama oranlarında çalışan bir darbeli lazer kullanın. Balgam deneyleri, ışın yüksekliğini ve ışın yönünü kontrol etmek için ışın yönlendirme aynaları ve optikler kullanır.

Lazer ışınını objektif merceğe yansıtmak için dikroik bir ayna kullanın. İki lazer aynı anda kullanılıyorsa, çift bantlı bir diic ayna takılabilir. İki lazer ışınının yansımasına izin vermek için, lazer ışığını mikroakışkan bir kanal içinde sıkı bir odağa getirmek için sonsuzluk düzeltmeli yüksek sayısal açıklıklı bir NA mikroskop objektifi kullanın.

Aynı yüksek NA objektifini kullanarak ve aynı dikroik aynadan iletilen mikroakışkan kanal içindeki numune tarafından yayılan floresansı toplayın. Tek veya çift bantlı bir emisyon filtresi kullanarak kalan uyarma ışığını çıkarın. Floresan emisyonunu 75 mikrometrelik bir iğne deliğine odaklayın.

Plano dışbükey lens kullanma. İğne deliğini mikroskop objektifinin konfokal düzlemine yerleştirin. Floresan sinyalini iki dedektöre bölmek için başka bir dikroik ayna kullanın.

Dikroik ayna tarafından yansıtılan floresansı bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve düz dışbükey bir lens ile ilk dedektöre odaklayın. İkincil bir kırmızı Flor içeren deneyler için, diic ayna tarafından iletilen floresansı başka bir emisyon filtresi ile filtreleyin ve ardından başka bir plano dışbükey lens ile ikinci dedektöre odaklayın. Floresan fotonların tespiti için çığ foto diyotları kullanın.

Floresan veri toplama için, çığ foto diyot dedektöründen gelen elektronik sinyali, kişisel bir bilgisayarda çalışan veri kaydı için çok işlevli bir DAQ cihazına bağlayın. Balgam deneyleri için, bir darbeli lazer kullanın ve dedektörleri ayrı bir bilgisayarda çalışan zamanla ilişkili tek foton sayan TCS PC kartına bağlayın. Bu kart, floresan kullanım ömrü verilerinin elde edilmesini sağlar.

TCS PC metodolojisi kullanma. Tespit edilen her floresan foton, gelen bir lazer darbesi ile ilişkilendirilir ve bu nedenle yayılan her floresan fotona bir gecikme süresi atanır. Bu veriler, floroforların radyasyon hızının bir tahminini elde etmek için tek veya çok üstel bir bozunma eğrisine takılabilir.

Artık hücrelerin hem biyolojik, hem fiziksel hem de kimyasal açıdan oldukça heterojen olduğunu biliyoruz. Bu nedenle, ideal olarak, her hücreyi bir seferde analiz etmeliyiz. Bununla birlikte, güvenilir ve anlamlı bir sonuca varmak için yeterli nicel bilgi toplayabilmemiz için tahliller daha yüksek bir verimle gerçekleştirilmelidir.

Burada, olduğu gibi gerçekleştirilebilmesi için tek damlacıkta kapsüllenen bir e coli hücresi örneğimiz var. Gece boyunca kültürlenmiş e coli ilk 10 suşunu kullanın. Hücrelerin canlılığını tespit etmek için, sito dokuz ve propidyum iyodür kullanın.

Boyaların her ikisi de DNA harmanlayan boyalardır ve floresan yoğunlukları 20 kattan fazla artar. DNA'ya bağlandıktan sonra sito dokuz, zar geçirgen ve propidyum iyodür olan yeşil bir floresan boyadır. Membran geçirimsiz kırmızı floresan bir boyadır.

Böylece, canlı hücreler yeşil floresan verirken, ölü hücreler hem yeşil hem de kırmızı emisyonlar sergiler. Burada damlacık oluşumunu ve T bağlantılı tek hücreli bir kapsüllemeyi görebiliriz. Bu video yüksek hızlı bir kamera ile kaydedildi, ancak saniyede binlerce oranında damlacıklar üretilebilir.

Hücreleri kapsüllerken, hücrelerin kültürünün, üretilen damlacıklardan daha az hücre olacak şekilde seyreltildiğinden, hücrelerin şırınga veya tüpte meydana gelebilecek çökelmesinin önlendiğinden emin olunmalıdır. Hücrelerin çözelti içinde eşit olarak dağılmasını sağlamak için şırınganın içinde manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Şırıngayı mikroçipe bağlamak için çok ince boru, 50 mikrometre kullanın.

Bu, borunun içinde hızlı bir akış hızı sağlar ve bu nedenle hücrelerin çökelmesini önler. İşte hücre tabanlı deneyler için zamanın bir fonksiyonu olarak fotoğraf sayımlarının tipik örnekleri. Damlacıklar içindeki karıştırma işlemlerini haritalamak için.

Damlacıklar, farklı kullanım ömürlerine sahip iki farklı floro dörtlüsü kullanılarak üretilebilir. Akan bir damlacık içinde, karıştırma işlemini geliştirmek için başlangıçta ayrılmış iki çözeltiyi karıştıran bir akış alanı oluşturulur. Akış alanının simetrisi, sargı kanalları kullanılarak değiştirilebilir.

Damlacıkları araştırmak için, optik prob hacmini, kanalın bir tarafından başlayarak, damlacıkların aktığı bir mikro kanalın yarısı yüksekliğine odaklayın, her deneyi kanalın tüm genişliği boyunca gerçekleştirin. Bir mikrometre aralıklarla. Damlacıklarla ilişkili tek patlamaları yağ fazının gürültü arka planından ayırt etmek ve her patlamanın süresini belirlemek için bir algoritma uygulayın.

Deneyin gerçekleştirildiği belirli genişlikte her bir damlacığın uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluk değerlerini çıkarmak için ikinci bir algoritma uygulayın. Ardından, deneydeki her damlacığın floresan ömrünü değerlendirmek için bir maksimum olabilirlik tahmincisi MLE algoritması kullanın. Deneydeki tüm damlacıklar için yaşam süresi değerlerinin ortalamasının alınması, MLE hesaplamasının son hatasını azaltır.

Ne kadar çok damlacık incelenirse, ömür boyu bir yörünge elde edildiğinde hata o kadar küçük olur. Her genişlik için, tüm yörüngeleri bir 2B haritada birleştirin. Her bir yaşam boyu değer, iki flora dörtlüsünün belirli bir karışımı ile ilişkili olduğundan, böylece bir konsantrasyon veya karışım haritası elde edilebilir.

Bir mikro cihazın imalatını ve mikro damlacık oluşumu ve bölge kapsüllemesi ve sürecin, damlacıkların optik tespiti için deney düzeneğini ve ilgili protokolleri tanımladık. İki örnek, damlacıklardaki tek hücrelerin algılanmasını ve karıştırma işlemlerinin haritalandırılmasını seçti. Akan damlacığın içinde, şu anda damlacık mikroakışkanları ile araştırılmakta olan yaygın uygulamaları temsil eder.

Sunulan deneylerin gösterdiği gibi, damlacık mikroakışkan platformların kullanımı, yüksek verim, mükemmel hapsedilmeye neden olma ve daha yüksek tekrarlanabilirlik gibi bazı çekici özellikler sunar. Üretilen büyük miktarda bilgi ve bu bilginin üretilme hızının en yüksek olması. DU, bu minyatür platformlardan tam avantaj elde edilecekse, en yüksek uzamsal zamansal çözünürlüğe sahip hızlı algılama yöntemlerinin kullanılmasını gerektiriyordu.

Bu durumda, bunun son derece hassas floröz spektroskopik teknikler kullanılarak mümkün olduğunu gösteriyoruz.