Monolayer sentezi, Montaj ve Karakterizasyonu Protein Monolayer Elektrokimya Korumalı Altın Nanopartikül Filmler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, tek tabaka korumalı kümeler veya MPC'ler olarak bilinen alkillat stabilize altın nanoparçacıklar sentezlemek ve bu materyalleri azarin protein tek tabaka elektrokimyası için bir absorbsiyon arayüzü olarak kullanılan ince film düzenekleri halinde birleştirmektir. Bu işlem, öncelikle altın kolloidlerinin organik ligandlarla korunmasıyla, bir Alkan Pholate filmi ile çevrelenmiş altın nanoparçacıklar oluşturularak gerçekleştirilir. Ardından MPC'ler, altın ve cam alt tabakalara sabitlenir ve büyümesi optik ve elektrokimyasal ölçümlerin yanı sıra kesit mikroskopisi ile takip edilen, kovalent olarak bağlanmış ince çok tabakalı filmler şeklinde ağ yapısına dönüştürülür.

Ardından, elektron transfer proteini azarin arayüzde absorbe edilir ve protein monotabaka elektrokimyası için döngüsel voltametri gerçekleştirilir. Sonuçlar, bu prosedürle oluşturulan MPC film arayüzlerinin, MPC filme dayalı adsorbe proteinin daha optimize edilmiş elektrokimyasal analizine olanak tanıdığını; geleneksel mesafe bağımlılığından yoksun, daha homojen bir adsorpsiyon arayüzü ve hızlı elektron transfer kinetiği sağladığını göstermektedir. Bu tekniğin geleneksel protein elektrokimyasına göre temel avantajı, nanopartikül filmlerle modifiye edilmiş elektrotların, döngüsel voltametri ile ölçüldüğünde daha ideal bir elektrokimyasal davranışla sonuçlanan bir absorpsiyon arayüzü sağlamasıdır.

Sentez süreci önemli görsel ipuçları içerdiğinden, film oluşturma ve karakterizasyon işlemleri ise çok sayıda karmaşık adım ve analitik teknik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. NPC filmleri, MPC katmanları ve dile bağlayıcı moleküllerin dönüşümlü olarak uygulandığı bir daldırma döngüsü yöntemi kullanılarak modifiye altın elektrotlar veya cam lamlar üzerine monte edilebilir. Sonuç olarak, bu katmanlar istenen film kalınlığına ulaşana kadar elektrokimyasal veya optik olarak takip edilebilir.

Uygun havalandırmaya sahip bir çeker ocuk altında altın kümeleri sentezlemek için, öncelikle 1,1 gram tetraoksil amonyum bromürü 30 mililitre toluen içinde çözün; 0,38 gram sodyum borohidrürü yaklaşık 20 mililitre 18 mega ohm ultra saf su içinde çözün ve en az 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın. Ardından, hidrojen tetrakloroaurat çözeltisini, ek beş mililitre ultra saf su kullanarak tetraoksil amonyum bromür toluen çözeltisine kantitatif olarak aktarın. Sulu altın çözeltisini organik fazdaki çözeltiye faz transferi yapmak için, kabın ağzını hafifçe kapatın ve 30 dakika boyunca şiddetli şekilde karıştırın.

Böylece yanık turuncu renkli sulu faz ve şeffaf sulu olmayan fazlar iyice karışmış olur. Hem şeffaf sulu fazı hem de yanık turuncu renkli sulu olmayan fazı bir ayırma hunisine aktarın. Sulu tabakayı atın ve sulu olmayan tabakayı temiz bir erlene dekante edin.

Sulu olmayan, tetra kloraurat içeren çözeltiye iki bir oranında C six ekleyin. Kırmızımsı turuncudan soluk sarıya, neredeyse renksiz bir çözeltiye dönüşen renk değişimiyle tespit edilen altın(I) polimerini oluşturmak için 30 dakika boyunca karıştırın. Reaksiyon karışımını yalıtımlı bir buz banyosuna aktarın ve karıştırarak en az 30 dakika boyunca 0 °C'ye kadar soğutun; altın(I)'i tiyollerin varlığında metalik altına indirgemek için soğutulmuş sodyum borohidrür çözeltisini niceliksel olarak ve hızlı bir şekilde reaksiyon karışımına ekleyin.

Ekledikten sonra, anında tek tabaka korumalı altın kümelerinden (MPC'ler) oluşan koyu siyah renkli, yoğun bir çözelti oluşacaktır. Reaksiyonu sıfır °C'de gece boyunca karıştırın ve ertesi gün reaksiyon karışımını bir ayırma hunisine aktarın.

Sulu tabakayı bir atık behere aktararak uzaklaştırın ve döner buharlaştırıcıya yerleştirin. Sulu olmayan toluen tabakasını, flask içerisinde yoğun siyah bir çamur kalana dek neredeyse tamamen kuruyana kadar buharlaştırın. Asetonitril ekleyerek MPC'leri çöktürün ve çözeltiyi, kauçuk bağlantılı orta gözenekli bir cam frit, yan kollu bir flask ve bir aspiratör kullanarak gece boyunca bekletin.

MPC'leri vakum filtrasyonu ile toplayın ve bol miktarda asetonitril ile durulayın. Sandviç hücreyi elektrokimyasal olarak monte ettikten sonra, 0.1 molar sülfürik asit ve 0.01 molar potasyum klorür çözeltisi içerisinde, saniyede 100 milivolt hızla 0.2 ile 0.9 volt, 0.2 ile 1.2 volt ve 0.2 ile 1.35 volt potansiyel aralıklarında döngüsel voltametri veya CV uygulayarak altın substratı temizleyin. Temizlenmiş çıplak altın substratın çift tabaka şarj akımını, potasyum fosfat tamponu veya KPB içerisinde, gümüş klorür'e karşı 0.1 ile 0.4 volt potansiyel aralığında saniyede 100 milivolt tarama hızıyla standart koşullarda CV gerçekleştirerek ölçün.

Tamponu boşaltın ve ultra saf su ve etanol ile iki kez iyice durulayın. Temizlenmiş altın substratı, etanol içindeki 5 mM C6 çözeltisinin yaklaşık 300 µL'sine maruz bırakın ve düzenli bir C6 SAM oluşması için gece boyunca bekletin. Hücredeki C6 çözeltisini boşaltın ve etanol ile ultra saf su ile iki kez iyice durulayın.

SAM'nin şarj akımını standart koşullar altında ölçün. KPB'yi atın ve ultra saf su ile etanol ile iki kez iyice durulayın. Şarj akımı belirgin şekilde azalmış olmalıdır.

Çıplak altın ölçümlerinden sonra, SAM modifiyeli altın altlığı etanol içindeki 5 mM NDT çözeltisinin yaklaşık 300 µL miktarına maruz bırakın ve NDT bağlayıcı moleküllerin C6 SAM içine dağılması için bir saat bekletin. NDT çözeltisini atın; önce etanol ve ultra saf su ile iki kez kapsamlı ve iyice durulayın, ardından bir kez dimetil metan ile durulayın. Altın altlığı, azot gazı ile yavaşça kabarcıklar oluşturarak karıştırma işlemi eşliğinde, dimetil metan içeren bir MPC çözeltisine bir saat boyunca maruz bırakın.

Bu, film düzeneğinin sabitleyici MPC katmanıdır. MPC çözeltisini atın ve sırasıyla diklorometan, ultra saf su ve KPB ile tekrar durulayın. Standart koşullarda MPC katmanının şarj akımını ölçün.

KPB'yi atın ve ultra saf su ile DIAM metan ile iyice durulayın. Altın substratı, 20 dakika boyunca yavaşça azot gazı kabarcıkları oluşturarak karıştırmak suretiyle, DIAM metan içindeki 5 millimolar NDT çözeltisinin yaklaşık 300 microliters miktarına maruz bırakın. İkinci MPC tabakasını biriktirmek için NDT'yi atın ve DIAM metan ile iyice durulayın.

Film düzeneğini DIAM metan MPC çözeltisine tekrar daldırın ve öncesinde durulayarak, azot gazı ile yavaşça kabarcık oluşturup karıştırarak bir saat boyunca bekletin. Ardından, MPC tabakasının şarj akımını standart koşullarda tekrar ölçün ve aynı prosedürü kullanarak yeniden durulayın. Arzu edilirse ek MPC tabakaları biriktirin.

Ağ yapılı MPC film tamamlandıktan sonra, AZ proteinini MPC film düzeneğine absorbe etmek için modifiye edilmiş alt tabakayı KPB ile durulayın. E chem sandviç hücresine, KPB içerisinde 5 ila 10 micromolar konsantrasyonda yaklaşık 150 microliter AZ çözeltisi enjekte edin ve kapağı kapalı şekilde buzdolabında en az bir saat bekletin. ECM hücresi oda sıcaklığına döndükten sonra, hücreyi KPB ile iyice durulayın, ECM hücresini tekrar KPB ile doldurun ve KPB'yi 10 dakika boyunca azot gazı ile havalandırın.

-0,25 volt ile 0,25 volt arasındaki potansiyel penceresinde CV gibi tek tabaka elektrokimyasal çalışmalar gerçekleştirin. Saniyede 100 milivolt tarama hızıyla, KPB Rinse A 3M PT MS modifiyeli cam lam üzerinde DIAM metan ile işlemi uygulayın ve düşük hızda bir çalkalayıcıda karıştırırken bir saat boyunca DIAM metan içeren bir MPC çözeltisine yerleştirin. Bu işlem, MPC'lerin sane'nin ME captan uç gruplarına sabitlenmesiyle film düzeneğinin ilk MPC tabakasını tamamlar.

Lamı diklormetan ile iyice durulayın, azot gazı ile kurutun ve lamı diklormetan içindeki NDT çözeltisinde beklettikten sonra UV-vis spektrumunu alın. Lamı, düşük hızda bir çalkalayıcı üzerinde ajite ederek bir saat boyunca MPC çözeltisinde bekletin. Bu işlem, film düzeneğinin ikinci MPC tabakasını tamamlar.

Lamı DIAM metan ile iyice durulayın, azot gazı ile kurutun ve lamın UV-vis spektrumunu alın. Filme ek MPC katmanları absorbe edildikçe, spektrum boyunca absorbansın artması gerekir. 3M PT MS modifiyeli cam lam üzerine monte edilmiş bir MPC filmini standart bir mikroskop lamına sabitlemek için.

Embed eight 12 epoksi reçinesini hazırlayın ve en az 12 saat boyunca koyulaşmaya bırakın. Bir ışın kapsülünü epoksi reçine ile doldurun ve MPC film örneğinin üzerine ters çevirerek yerleştirin. Kapsüle, bir kabarcık kapsülün üst kısmına çıkana kadar baskı uygulayarak epoksi reçine ile MPC film örneği arasında bir sızdırmazlık oluşturun.

En az 18 saat boyunca 60 °C'de polimerleşmeye bırakın ve ardından monte edilmiş lamları oda sıcaklığına kadar soğutun. Hızlı film üzerindeki bağlı MPC ile birlikte bloğun çıkarılmasını kolaylaştırmak için, monte edilmiş lamları 200 °C'deki döküm alüminyum bir ısıtıcı plaka üzerinde 20 saniye boyunca ısıtın. Filmi içeren örneği, kuyumcu testeresi kullanarak ışın kapsülü bloğundan kesin; çıkarılan kısmı, MPC film tarafı yukarıya ve silikonun iç kısmına bakacak şekilde bir silikon düz kalıba yerleştirin.

Silikon kuyu, oda sıcaklığında epoksi reçine ile doldurulur ve 60 °C'de en az 18 saat boyunca polimerize olması beklenir. Ardından numunenin oda sıcaklığına gelmesi sağlanır. Leica UCT ultra mikrotomda, elmas bıçak kullanılarak bıçak kenarına dik kesitler şeklinde 60 ila 80 nm kalınlığında ince numune kesitleri alınır; kesilen kesitler 400 mesh bakır ızgaralar üzerindeki Formvar karbon destek filmine yerleştirilir ve gösterilen MPC film düzeneklerinin enine kesitlerinin TEM görüntüleri alınır.

Burada, MPC ve NDT çözeltilerine ardışık maruziyet içeren toplam beş daldırma döngüsü için MPC film büyümesinin çift katman şarj akımı izleme sonuçları yer almaktadır. Şarj akımları her daldırma döngüsüyle sistematik olarak artmaktadır. Filme MPC katmanları eklenmektedir.

Burada, 4.4 mM potasyum fosfat tamponu içerisinde, saniyede 100 mV tarama hızıyla -0.25 ile +0.25 volt arası potansiyel penceresi kullanılarak elde edilen, bir MPC film düzeneğine AZ adsorpsiyonu için tipik bir döngüsel voltammogram yer almaktadır. 3M PT MS modifiyeli bir cam lam üzerinde diol bağlantılı MPC film büyümesinin temsili bir UV-vis spektral izlemesi burada gösterilmiştir. Bir daldırma döngüsü, cam lamın önce NDT bağlayıcı çözeltisine, ardından MPC çözeltisine maruz bırakılmasından oluşur.

Her bir sonraki daldırma işlemi, film kalınlığında artışa ve buna bağlı olarak absorbansın yükselmesine neden olur. Bu şekil, DIA bağlantılı bir MPC film düzeneğinin transmisyon elektron mikroskobu kesit görüntüsü analizini göstermektedir. Ek pencere, film düzeneği TEM analizinde kullanılan heksa metol fonksiyonelleştirilmiş MPC'lerin tipik bir TEM görüntüsünü göstermektedir.

Image J kullanılarak MPC'lerin ortalama altın çekirdek çapının yaklaşık iki nanometre olduğu belirlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra; redoks proteinlerinin adsorpsiyonu ve ardından elektrokimyasal analizi için bir arayüz görevi gören MPC altın nano parçacık filmlerinin nasıl sentezleneceği, karakterize edileceği ve bir araya getirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Film montaj süreci, geniş bir protein yelpazesinin adsorpsiyonuna uyum sağlamak amacıyla, hem MPC sentez prosedürünün hem de iç parçacık bağ mekanizmasının manipüle edilmesiyle kolayca adapte edilebilir.

Bu yöntem, proteinlerin modifiye edilmiş sentetik platformlara absorbsiyonunun elektrokimyası hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda elektron transferi modelleme sistemlerinin, biyosensör şemalarının ve sentetik biyouyumlu malzemelerin geliştirilmesinde de uygulanabilir.