Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

Bu prosedürün temel amacı, küflü görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak nöropeptitlerin, özellikle opioid peptitlerin doğrudan ince beyin kesitlerindeki mekansal dağılımını aydınlatmaktır. Bu, önce donmuş sıçan beyninin 12 mikrometre ince doku kesitlerinin toplanması ve bunların iletken cam slaytlara monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, küflü Matrixx'i kimyasal bir mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak bölümler boyunca diziler halinde uygulamak ve ardından her matris noktasından bir kütle spektrumu elde etmektir.

Daha sonra, deneyin genel başarısını sağlamak için birkaç peptit zirvesi görselleştirilir. Bunu, kütle spektrumlarının dışa aktarılmasının incelenmesi ve işlenmesi ve peptit verilerinin işlenmesi ve istatistiksel değerlendirme takip eder. Son adım, küflü görüntüleme kütle spektrometresi ile elde edilen peptit verilerini analiz etmek ve doğrulamaktır.

Sonuç olarak, sonuçlar, farklı tedavi grupları arasında beynin farklı bölgelerindeki nispi opioid peptit seviyelerinde önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin radyo immüno, SAO jel bazlı yaklaşımlar gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, çoklu görüntülemenin yüksek moleküler özgüllüğü korurken tedaviye bağlı değişikliklerin lokalizasyonuna izin vermesidir. Bu da bize, çeviri sonrası değişikliklerin daha önce tespit edilmemiş gibi kesilmesini tespit etme imkanı sağlar.

Bu yönteme yeni olan kişi, başlangıçta zorlanacaktır çünkü teknik, derin numune hazırlama ve veri işleme gerektirir. Burada odak noktası dokunun kalitesi, matris, uygulama protokolü, veri değerlendirmesi ve aşağıdaki doğrulama deneyleri olacaktır. Proteolitik bozulmayı önlemek için doku diseksiyonu sırasında hızlı ve özenli bir şekilde çalışmak esastır.

Fareyi onaylanmış protokollere göre kurban ettikten sonra, hemen beyni çıkarın, toz haline getirilmiş kuru buza aktarın ve beynin nispeten yavaş donmasına izin verin, beyni eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Tüm beyinler, MS sinyal kalitesinde kayıp olmadan bölümlere ayrılmadan önce birkaç yıl saklanabilir. Prosedüre başlamaya hazır olduğunuzda, doku teknolojisi, gömme ortamı kullanarak beyni tutucuya monte edin, gömme ortamı peptitlerin iyonlaşması ve desorpsiyonuna müdahale ettiği için beynin kesilecek kısmının kirlenmesini önleyin.

Bir kriyostat mikrotomunda donmuş dokuyu 12 mikronluk dilimlere kesin ve doku bölümlerini iletken maldi cam slaytlara Thom monte edin. Doku bölümlerinin boyanması bu noktada yapılabilir ve dokunun kalitesi incelenebilir. Bu şekil, dokunun çatlamasına ve yırtılmasına neden olan sıvı nitrojen içinde donmuş beyin dokusunun krestal mor boyamasını göstermektedir.

Bu doku, matris yayılacağı ve eşit şekilde kristalleşmeyeceği için yüksek çözünürlüklü küflü görüntüleme kütle spektrometresi için uygun olmayacaktır, bölümleri bir vakum altında 15 dakika kurutun ve slaytları eksi 80 santigrat derecede saklayın, daha fazla kullanım için doku kesiti, eksi 80 santigrat derecede saklansa bile, kesitlemeden sonra mümkün olan en kısa süre içinde analiz edilmelidir. İlk olarak, bölümleri bir saat boyunca kurumuş bir şekilde çözün, daha sonra slaytları oda sıcaklığında% 70 etanol içinde 10 saniye boyunca yıkayın, ardından her biri 10 saniye boyunca oda sıcaklığında% 95 Etanol içinde iki yıkama yapın. Yıkadıktan sonra, slaytları 10 dakika kurutun.

Doku kesitlerinin doku bozulması, mikro yırtıklar veya küf EMS kalitesini bozabilecek küçük çatlaklar olmadan iyi kalitede olduğundan emin olmak için bölümleri mikroskop altında inceleyin. Daha sonra, suda mililitre başına 50 miligram, DHB ve% 50 metanol,% 10 150 milimolar amonyum asetat ve% 0.3 tri floro asetik asitten oluşan taze matris çözeltisi hazırlayın. Cam sürgülü tutucuyu doku bölümüyle tarayın ve çip yazılımındaki görüntü analizi özelliğini kullanarak tutucuyu ilgili referans noktalarına hizalayın.

Ardından hem beyin bölgesi hem de hedeflenen analitler için uygun matris uygulama parametrelerini seçin. Ardından, uzamsal çözünürlüğü belirtin. Şimdi kimyasal bağlantı Jett yazıcıda optimize edilmiş protokolü kullanarak matrisi uygulayın.

Son matris benekli bölümlerini tarayın ve çoklu veri talebinden önce resmi kaydedin. Bu, daha sonra matris birikintilerini maldi aşamasının motor koordinatları ile çapraz referans vermek için kullanılacaktır. Hemen kullanılmazsa, matris benekli bölümler gerekli olana kadar bir vakum altında kurumuş bir şekilde saklanabilir.

Çoğu deney için, burada görüldüğü gibi birkaç bölüm aynı anda analiz edilecektir. Her sürgü tutucu iki cam kızağa uyar ve bu nedenle tüm tutucular için birden fazla ikili set analiz edilmelidir. Küf TOF elde etme yöntemleri ve parametreleri aynı olmalıdır, ancak her slayt için peptit kütle kalibrasyonları kontrol edilmelidir.

Ardından, lazer odağı ve lazer yoğunluğu dahil olmak üzere doku numunesi üzerindeki alım parametrelerini optimize edin. Ardından, taban çizgisini yükseltmeden en yüksek çözünürlüğü düşürmeden optimum bir MS sinyali elde etmek için gereken çekim sayısını girin. Dedektörü veya ablasyon matrisini komşu matris birikintilerinden doyurun ve lazer hareketini seçin.

Burada tek gürültü algılanana kadar matris noktası başına çekilebilecek maksimum çekim sayısını tahmin edin. Rastgele bir hareket modeli kullanılarak toplam 24 adım sayısı için 25 atış adımında her matris biriktirmesinden 600 çekim toplanır. Flex görüntüleme yazılımını kullanarak tespit edilen tüm bölümlerin taramalarını MALDI aşamasının motor koordinatlarıyla çapraz referans alın.

Ardından, otomatik yürütme toplu çalıştırıcı yazılımını kullanarak, toplu modda veri toplama işlemini gerçekleştirin. En yüksek yoğunluk dağılımlarını değerlendirmek ve en yüksek yoğunluk dağılımlarının doku özellikleri, lekelenme kalitesi veya normalizasyon etkileriyle ilişkili olup olmadığını belirlemek için Maori IMS görüntülerini görsel olarak incelemek için Flex görüntüleme gibi veri görselleştirme araçlarını kullanın. Bu örnek, dokuz farklı hayvanda 10 farklı peptit zirvesinin dağılımını göstermektedir.

Normalizasyon için kullanılan toplam demir akımı veya TIC beyaz renkte görüntülenir. TIC, bir kütle spektrumundaki her yoğunluk değerinin toplamıdır. Üçüncü hayvanda TIC değeri çok düşüktür ve peptit görüntüleri spesifik bilgilerden daha fazla gürültü gösterir.

Altı numaralı hayvanın beyni, bölümün altında çok yüksek TIC değerlerine sahip bir alan gösterir. Bu, peptit görüntülerinin o alanında, C ve D'de anormal derecede yüksek yoğunluklar olarak yansıtılır.Bu, veri analizini etkileyebilecek potansiyel bir normalizasyon etkisidir. Aşırı normalleşme etkileri, özellikle yalnızca bir tedavi grubunda mevcutsa yanlış sonuçlara yol açabilir.

Bu örnekte, TIC C grubu için önemli ölçüde daha yüksektir ve bu da bireysel tepe yoğunluklarını anormal şekilde etkileyebilir. Örneğin, sitokrom C için ortalama tepe yoğunluğu, ham verilerde C grubu için B grubundan daha yüksektir, ancak normalizasyondan sonra, tepe yoğunluğu artık daha düşüktür. C grubu için bu, sonuçların ciddi şekilde yanlış yorumlanmasına yol açabilir.

Kapsamlı veri doğrulamasına devam etmeden önce her tedavi grubu için her zaman ortalama TIC'yi hesaplamak önemlidir. Daha sonra, ilgilenilen bölgeyi tanımlamak için, pro di norfin haberci RNA'sının 14 kilodalton pro norfin propeptidine çevrildiğini anlamak önemlidir. Striat veya nöronlarda, prod norfin, diğer striat veya nöronları hedeflemek için dendritler yoluyla ve aksonlar yoluyla hücre gövdesinden birkaç milimetre uzaklıktaki önemli nigraya taşınan veziküller halinde paketlenir.

Veziküller, propeptidi alfa neo endorfin di norfin A veya DI norfin B gibi di norfin peptitlerine daha fazla işleyen enzimler içerir. Bu peptitlerin bazıları yalnızca kütle spektrometresi ile tespit edilebilir, çünkü mevcut antikorlar yalnızca peptitlerin C terminal ucunu hedef alır ve uç terminali hedef almaz. Opioid reseptör aktivasyonundan sorumlu olan Y-G-G-F-L dizisi, di norfin üreten hücreler başıboş AUM'da bulunur ve önemli nigra'ya projekte bulunur.

Bu nedenle, aşağıdaki deneyde, hem başıboş AUM hem de subs nigra, ilgilenilen her bölgeden gelen spektrumlar olan küflü IMS ile analiz edildi. Dorson medial ve dorsal lateral stri aum ve medial ve lateral nigra fleks analiz yazılımında tanımlandı ve veri analizi için dışa aktarıldı. Veri azaltma için, farklı yazılımlarda bulunan tepe bulma araçlarını kullanarak tepe tespiti gerçekleştirin.

Örneğin, orijinde tepe analizini veya matlab'da MS Tepelerini kullanın. Tepe listesini tüm spektrumlardan tek bir sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktarın, tepe başlangıç ve bitiş sınırlarını belirleyin Otoyol P kutusu gibi bir yazılım kullanarak, tepe sınırları arasındaki eğrinin altındaki alanı hesaplayın ve bunları istatistiksel analiz için kullanın. MS. Tedavi grupları arasındaki tekrarlanabilirlik, ortalama MS izi ve her bir kütle değeri için standart hata hesaplanarak değerlendirilebilir.

Bu örnekte, bozulmamış kontrol nigra için ortalama spektrumlar, analiz edilen kütle aralığı boyunca değişkenliği değerlendirmek için kullanılacaktır. Her iki kontrol grubunda da tepe yoğunlukları eşit olduğu ve standart sapma düşük olduğu için iyi tekrarlanabilirlik görülebilir. Bu, geçerli istatistiksel analiz sağlar.

Veri setleri yüksek derecede varyasyon gösteriyorsa, deneysel varyasyon kaynaklarını mümkün olduğunca azaltarak Maori IMS deneyini tekrarlamak neredeyse her zaman gereklidir. Tipik olarak, bazen vardiyalı olarak çalışan birkaç kişi de dahil olmak üzere, tek bir oturumda mümkün olduğunca çok sayıda bölümü ve hayvanı işliyoruz. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bu hala yeterli değildir ve başka stratejiler kullanılabilir.

Örneğin, bazı spektrumlar gürültüden oluşuyorsa, bunlar TIC'nin frekans dağılımını çizerek olabilir ve optimal olmayan verileri ortadan kaldırmak için bir kesme eşiği değeri kullanılabilir. Verileri değerlendirmenin bir başka yolu, aynı gruptaki iki hayvan için tüm tepe noktalarını birbirine karşı çizmektir. Her iki hayvanda da tepe yoğunlukları eşitse, yoğunluk yoğunluğu grafiği düz ve dar bir çizgi gösterir.

Bir hayvan düşük kaliteli spektral veriler içeriyorsa, çizim tipik olarak sağda görüldüğü gibi düz çizgiden asimetrik kaymalar gösterir. Peptit dizisi tanımlaması için, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisine tireli çok boyutlu sıvı kromatografisi kullanarak sıçan beyin dokusu ekstraktları üzerinde peptit Dominic analizi yapın. Kısaca nöropeptitler, sıçan beyninin kesitlerinden ekstrakte edilir ve güçlü katyon kromatografisi ile önceden fraksiyone edilir.

Farklı fraksiyonlar daha sonra nano akışlı ters faz HPLC kullanılarak daha da ayrılır. Daha sonra, nöropeptitleri, hibrit bir doğrusal iyon tuzağı ria dönüşümü iyon siklotron rezonans cihazları kullanarak elektro sprey tandem kütle spektrometresi vasıtasıyla karakterize edin, son olarak, bazı nöropeptitler için spesifik antikorları eşleştirerek veri tabanı eşleştirme ile peptit dizisi tanımlamasını gerçekleştirin ve immünohistokimya deneyleri, deneysel sonuçların yanı sıra peptit tanımlamasını da doğrulayabilir. Çözünürlük, Maori görüntüleme kütle spektrometresinden daha yüksektir ve ek bilgi elde edilebilir.

Bu örnekte, Dior arı immünoreaktif sinir lifleri hipokampusta, sol üst panelde ve önemli nigra sol alt panelde görülebilirken, sağ alttaki Maori IMS görüntüsü, farklı beyin alanları düzeyinde lokalizasyonu ortaya koymaktadır. Bir tepe kütlesinin kesin olarak belirli bir peptite atanabileceğinin nihai kanıtı, pronin nakavt faresinde peptit nakavt hayvanları üzerinde küflü IMS yapmaktır. Oklarla gösterildiği gibi birkaç tepe nakavtta eksiktir, ancak vahşi tip kontrolünde değildir.

Hayvanlar: P ve P mürekkebi gibi ilgisiz peptit zirveleri, nakavtlar ve kontrol hayvanları arasında hiçbir fark göstermez. Altı hidroksi dopamin lezyonunda di norfin B ve alfa neo endorfin tepe yoğunlukları önemli ölçüde artmıştır. Oklarla gösterildiği gibi yüksek diskinezi hayvanlarının Parkinson stri AUM'si, düşük diskinetik ve lezyon kontrol grubuna kıyasla.

İstatistiksel analiz ayrıca, uç terminal tirozinin çıkarıldığı kesilmiş alfa neo endorfine karşılık gelen bir peptit kütlesi için önemli bir artış olduğunu ortaya koydu. Gerçekten de, görsel inceleme, görüntüleme sonuçları yeşil renkle gösterilen ana di norfin peptitlerinin yüksek kolokalizasyonunu gösterir ve kırmızı sarı ile gösterilen ilgili DES tirozin metabolitleri, sağdaki kaplama panelinde bölgesel örtüşmeyi gösterir. Bu tekniğin büyük potansiyeli, diğer yöntemlerle tespit edilemeyen farklı beyin yapılarında seçici peptit işlemeye ilişkin bulgularla vurgulanmaktadır.

Burada, kırmızı ile gösterilen spesifik DES tirozin metabolitleri, yeşil ile gösterilen ana peptit ile birlikte lokalize olmuş ve sadece striatumda gözlenmiştir, ancak diskinetik sıçanların önemli nigrasında gözlenmemiştir. Sub nigra görüntü analizinde, kırmızı ile gösterilen bozunma ürünü lu ve kelin arkının, yeşil ile gösterilen di norfin B'ye ters olarak lokalize olduğunu ortaya koydu, bu da diskinezi sırasında DI norfin B'nin lateral subs, nigra'da lokal olarak salındığını ve daha sonra lu'ya metabolize edildiğini ve AR One kurulumunda dikkatli bir şekilde yapıldığını gösterdi. Kalıp görüntülemeyi kullanan tek bir deney, numune hazırlama ve veri toplama için bir veya iki gün içinde gerçekleştirilebilir.

Bunu daha sonra veri değerlendirmesi için bir veya iki gün daha izledi. Örneklem büyüklüğüne bağlı olarak, doğrulama deneyleri, uygun şekilde gerçekleştirilirse laboratuvarda bir veya iki gün daha uygulamalı deneyler gerektirecektir. Aşağıdaki adımlarda özellikle dikkatli olmak önemlidir.

Moral bozulmasını önlemek için doku diseksiyonu ve dondurma işlemi hızlı bir şekilde yapılmalı, yıkama ve matriks uygulama protokolü her deney için optimize edilmelidir. Aşırı normalizasyon etkileri veya zayıf tepe tespitleri nedeniyle yanlış pozitifleri önlemek için veri değerlendirmesi ve istatistiksel analiz dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir.