Name: Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 57 s
Description: Öğrenin, Parkinson hastalığında L-DOPA tedavisine bağlı diskinezi ile ilişkili neuropeptid değişikliklerini sıçan beyinlerinde MALDI görüntüleme kütle spektrometresi ile tespit etmeyi. Bu yöntem yüksek moleküler özgüllük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz değerli katkıları için Şekil 3 ve Dr Jonas Bergquist için veri katkıda bulunmak için, Hanna Warner teşekkür ederiz. İsveç Araştırma Konseyi (Hibe 522-2006-6416 (MA) 521-2007-5407 (MA); Åke Wiberg Vakfı (MA, JH), İsveç Kraliyet Bilimler Akademisi (MA, JH) ve İsveç Kimyasal Derneği (JH) minnetle mali destek için kabul edilmiştir.

Protokolü, genellikle birden fazla sıçan beyin kesitleri, 20-30 bölümleri ile MALDI IMS verilerine istatistiksel analiz amaç için ayarlanabilir ve doku hazırlanması oluşan beş farklı adımlardan oluşur, matris uygulaması, MALDI-TOF MS analizleri, veri değerlendirme, ve nöropeptid tanımlama. Prosedürler özetlenen ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir: 1. Doku hazırlık Bu prosedür, ilgili doku örneklerinin toplanması gibi doku IMS analizi için kesit içerir. Proteolitik degradasyona önlemek için belirli bir amacı, bir protein ve peptid analizi. Bu nedenle doku diseksiyonu sırasında hızlı ve gayretli çalışmak esastır. <ol><li> Dekapitasyon yoluyla sıçan (genellikle 250-300 g) Kurban, -80 ° C derin dondurucuda aktarmadan önce toz kuru buz &lt;30'lu ve dondurma maksimum post-mortem bir süre içinde sıçan beyin kaldırın. Sıvı azot kullanarak daha hızlı dondurulmasımatriks kristalizasyon olumsuz etkileyecektir beyin dokusu, microtears riskini artırabilir ve böylece MS kalitesini düşürür (Şekil 2D). Tüm beyinler MS sinyal kalitesi kaybı olmadan kesit önce birkaç yıl boyunca saklanabilir. </li><li> 12 mikron dilimleri ve çözülme-mount doku kesitlerinde iletken MALDI cam slaytlar (indiyum kalay oksit kaplı slaytlar Bruker Daltonics,) ya da MALDI hedef (Şekil 2A-C) bir kriyostat mikrotom dondurulmuş doku kesin. </li><li> -80 Vakum altında 15 dakika ve mağaza slaytlar Kuru bölümleri ° C daha sonra kullanmak kadar. -80 De bile saklanan doku kesitleri, kesit sonra mümkün olan en kısa süre içerisinde analiz edilmelidir ° C Biz MS sinyal kalitesini belirgin bir yıl depolamadan sonra azalacaktır bulabilirsiniz. Proteinler ve peptitler oksidasyon azaltmak amacıyla, depolama konteyner içindeki havanın, inert bir gaz (örneğin argon veya nitrojen) ile ikame edilebilir. </li></ol> 2. Matrix uygulama Matris uygulamasıadım, spektrum kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve doku tür yanı sıra ilgi analit bağlı olarak birden fazla parametre optimizasyonu gerektirir. Bu faktörler, matris tür bir matris konsantrasyonu, pH, doku yıkama ve organik değiştiriciler aletsel ayarları depozitosu hacmi, 10 depolanmalar yanal çözünürlük ve sayısını (Şek. 2B) dahil olmak üzere yanı sıra gibi kimyasal parametreleri içerir. Büyük ölçekli deneyler için, örneğin bir gün içinde tüm bölümlerine matris uygulanarak ve aynı operatör tarafından azaltmak için, varyans analizi, büyük önem taşımaktadır. Yüceltme veya spreyi, küçük matris damlacıklarının dizilerin otomatik birikimi, tarafından, büyüklüğü 100-150 picolitre hakkında çeşitli dokularda küçük protein ve nöropeptid analizi için başarıyla kullanılmaktadır matris çözümü uygulamak amacıyla birçok strateji olmasına rağmen , beyin bölümlerde 9, 10,11, 12, 13 dahil olmak üzere. <ol><li> 1 saat için bir desikatöre buzunu kesitlerbizim. </li><li> Deney operatör daha başka bir kişi tarafından kör olduğundan emin olun. Re-etiket örnekleri. </li><li> 10 sn için% 70'lik etanol (EtOH, oda sıcaklığında, RT) bölümleri, yıkayıp 1x ve iki kez% 95 10 sn için EtOH (RT). Büyük deneyler için, yıkama için tüm cam gerçekleştirmek varyasyon en aza indirmek için bir küvet kullanılarak bir araya kayarak. </li><li> 10 dk için bir desikatöre bölümlerde kurutun. </li><li> Doku kesitleri mikroskop altında değerlendirilmesi ve, MALDI MS kalitesi (Şekil 2D) bozacağına doku bozulma, microtears ve küçük çatlaklar olup olmadığını kontrol edin. </li><li> % 50 metanol, 10% 150mm, amonyum asetat (AMAC) ve suda% 0.3 triflüoroasetik asit (TFA) içinde 50 mg / mL DHB içeren taze matris çözeltisi hazırlayın. </li><li> Matrix uygulama kimyasal bir mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak bir dikdörtgen desen (CHIP, Shimadzu) kesikli damlacık birikimi ile yapılır. Birinci adım, deneysel matris uygulama parametreleri analizi includi nöropeptid için optimize etmek içinng sayısını geçişte başına damlacıkların geçer. Bu deney, her dizi gibi korpus kallosum, korteks ve striatum gibi benzer beyin bölgeleri kapsayan emin yaparken, aynı doku bölümünde farklı bir uygulama parametreleri ile çoklu matris dizileri uygulayarak tarafından yapılır. Farklı beyin yapıları, özel analitler hedefleyen farklı matrisler ve farklı matris solventler spesifik analitlerin çıkarılması için gerekli ise de dahil olmak üzere, her zaman parametreleri değiştirilir aynı deneyi yapılmalıdır </li><li> Tarama doku bölümü ile cam slayt tutucu ve tutucu hizalamak. Doku bölümünde matris uygulaması için dizi tanımlayın ve mesafe nokta uzaysal çözünürlüğü, yani nokta belirtin. Kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı üzerinde optimize edilmiş protokolü kullanılarak matris uygulayın. Bu deneme için aşağıdaki baskı parametreleri ile peptid görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol kullanılır: 10 damla (100 pL / damla), 10 uygulama geçer ve d noktaya bir nokta300 um istance. </li><li> Tarama son matrisi bölümleri tespit ve kayıt için MALDI veri toplama sistemi (3.4 adım) önce resmi kaydedin. </li><li> De kullanıma kadar vakum altında bir desikatöre bölümlerde depolar. </li></ol> 3. MALDI MS veri toplama ve işleme Nöropeptidlerin MS analizi her matriks nokta 14 yazılım destekli veri toplama kullanarak,, MALDI zamanında uçuş aleti (Ultraflex II Bruker Daltonics,., Almanya) reflektör modu faaliyet yapılmaktadır. Bu nedenle doğru mekansal öğretim şarttır. Bu, MALDI optimizasyonu, satın alma ve özellikle hedef kaydı deneyler tercihen deney grupları kör olmalıdır aynı operatör tarafından yapılmaktadır esastır. Birden fazla cam slaytlar ile büyük ölçekli bir deneyde, başka bir kişi kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı çalışırken MALDI deneyler, bir operatör tarafından yapılmalıdır. <ol><li> Kütle spektrometresi cam slaytlar yükleyin. </li><li> MALDI etme yöntemi, düşük moleküler ağırlıktaki bir standart kalibrasyon karışımı (Bruker Daltonics) kullanılarak kalibrasyon kontrol. </li><li> Satın alma parametrelerini optimize edin. <ol><li> MS sinyal için optimize etmek ve, komşu matris yataklarının matris ablasyonu önlemek için,, doku lazer ve optimum odak boyutu tespit edilmelidir. </li><li> Lazer enerjisi pik çözünürlüğü veya doyurarak dedektör azaltarak, taban yükseltme olmadan mümkün olduğunca çok sayıda matris mevduat olarak maksimum MS kalitesini sağlamak ayarlanır. </li><li> Sadece gürültü tespit edilir kadar matris noktaya başına çekim maksimum sayısını değerlendirmek, genellikle 1000-2000 çekim. Birikmiş olmalı ve bir spot içinde lazer pozisyonundan önce satın çekim numarasını değiştirmek gerekir çekim sayısını tahmin. Her matris nokta eşit örneklemek için, bir ran kullanarak 24 basamaklı olmak üzere toplam 25 atış adımda 600 çekim birikirhareket özgürlüğü desen, her matriks birikimi. </li></ol></li><li> Kayıt, MALDI aşamasında motor FlexImaging kullanarak koordinatları (v.2.0) 10 tüm lekeli bölümden tarama ve veri toplama AutoXexuteBatchRunner.exe yazılım toplu modunda gerçekleştirmek. </li><li> Bazal çıkarma (Konveks gövde V3), yumuşatma ve bir ASCII dosyası (*. Dat, *. Txt veya *. Csv formatında) ihracat takip harici kalibrasyon (isteğe bağlı) sayesinde, tek tek her spektrumları işleyin. 15 </li></ol> 4. Verilerin değerlendirilmesinde Final veri değerlendirme, sadece zirve bilgi, istatistiksel analiz takip odaklanmak sonrası kısıtlı veri işleme ve veri azaltma oluşmaktadır. <ol><li> Bir ilk adım olarak, MALDI IMS bölümleri overnormalization etkileri değerlendirildi. Bu veri görselleştirme, böyle FlexImaging (Bruker Daltonics) veya BioMap (Novartis) gibi araçlar kullanılarak kolaylıkla elde edilebilir. Bir ilk adım olarak toplam iyon görüntüleri evatoplam iyon akımı (EFT) normalleştirme önce luated, çeşitli önde gelen peptid zirveleri tek iyon dağıtım görüntüleri elle muayene ile takip etti. Karakteristik tepe yoğunluğu dağıtımları için bak ve kalite veya normalleşme etkiler (Şekil 3) lekelenme, doku özellikleri (tazminat) ilgili. </li><li> Histolojik özellikleri göre çıkarlarının bölgelerde (striatum örneğin) tasvir ve ASCII dosya biçiminde karşılık gelen spektrumları ihracat. Tercihen, bu aşamada,, toplam iyon akımı (TIC) spektrumları normale yapılabilir. </li><li> Böyle bir Menşei olarak veri işleme yazılımı (v.8.1 Originlab), MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) veya R 16 ASCII dosyalarına alma. Tepe tespiti örneğin Köken ya da Matlab "mspeaks" "zirve analizi" için yazılıma dahil tepe bulma araçları kullanılarak yapılabilir. Tek bir sekme ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktarın. Tüm spektrumu peaklists de </li><li> Tespit peptid bin sınırları belirlemek amacıylazirveleri, binning analizi uygun yazılım araçları kullanılarak (örn. pbin 17) ya da in-house MATLAB veya R için komut dosyası yazılı tüm pik içeren tek bir metin dosyası veri aldı yazılımı yüklenir ve pik sınır belirlenmesi için bir parametre belirtilmemişse deney için ilgili olduğu için bir zirve spektrumları mevcuttur ne sıklıkta olmalıdır gibi. Örneğin, deneyi, hayvanların 2 grupları, (5) her gruptaki hayvanların, ve her bir hayvan ve ilgi bölgenin toplanan 100 spektrası içerir. Hayvanların bir grup, (3/5) ve bu hayvanlarda spektrumları (3x50 = 150 spectra) en az yarısı, en azından büyük çoğunluğu mevcut ise, potansiyel olarak ilginç bir tepe varsayınız, toplam yüzdesi verecek için% 15, toplam 1000 (2x5x100) spektrumları 150 olumlu spektrumları dışarı. Pbin aracını kullanarak, bu adımı, bin genişlikleri elde edilen verilerin belirlenen tüm içeren tek bir binrange dosya verir. O bin sınırları doğrulamak içinuygun olan, bunun özgün spektrası izleri ile birlikte konteynerleri görselleştirmenizi Origin kolaydır. </li><li> Pik alan entegrasyonu, istatistiksel analiz için önemlidir varyans azaltabilir. 4. adımda belirlenen pik sınırları arasında eğri altında kalan alanı hesaplamak için bir in-house yazılmış betiklerin R için kullanın. Entegre pik alanları 18 yapılır SAM aracını kullanarak non-parametrik eşleştirilmemiş test yoluyla MS excel (v.2007) ve istatistiksel analiz alınır. </li></ol> 5.. Peptid tanımlama Gözlenen peptid kimliklerin Sıra doğrulama biyolojik alaka sonuçlandırmak için son derece önemlidir. Yüksek peptid konsantrasyonları 12,13 analizi bu tür için gerekli olmasına rağmen, en doğru yaklaşım, doğrudan tandem kütle spektrometresi (MS / MS) vasıtasıyla peptid parçalanma kullanarak doku kapalı gerçek yukarıdan aşağıya belirlenmesini de içerir. Düşük, clos ile bol peptid veya birden peptidler içinem / z değerleri (±% 0.5), doku analizi bozulur ve kapalı bir doku analizi bir peptidomic stratejisi kullanılarak, ekstraksiyon, ayrılması ve endojen nöropeptidlerin MS bazlı tanımlama içerir kullanılmaktadır. Burada sunulan deneme için, merkezi odak opioid peptid tespiti, bu peptidler spektrumu diğer nöropeptitlerin ile karşılaştırıldığında bol oldukça düşük olduğundan, belirli bir sorundur. Ayrıca, ortak peptid ekstraksiyonu ve ayırma teknikleri ile korumak için onları oldukça hidrofilik ve zor kılan bu peptidler yerine polar .. Bu nedenle biz, peptid kimlik 9,19 dayanarak standart LC-MS/MS birlikte doku ekstraksiyonu ve opioid peptid prefractionation için önceden bildirilen protokolü uyguladık. <ol><li> Ilgi hedef yapılara (kaudat putamen, CPU çekirdeği akumbens, NAC) koronal kesitler toplayın. Bir kriyostat mikrotom Mount donmuş sıçan beyin ve çevreleyen beyin malzeme çıkarmak (kortex, bir neşter ile septum, korpus kallosum). Disseke NAC CPU ve çözülme NAC ve farklı cam slaytlar bölümden CPU parçalar monte; bölümler (n = 50 30 mikron) toplayın. </li><li> Iki dakika inkübe 100 mcL% 5 ACN/0.1% TFA ekleyerek doku kapalı peptidler ayıkla ve eppendorf düşük protein bağlayıcı tüpler içinde toplamak. Bu adım iki kez tekrarlayın. </li><li> Peptid prefractionation güçlü katyon değişim kromatografisi vasıtasıyla, artan iyonik kuvveti 19 stepwise (n = 4), elüsyon kullanılarak gerçekleştirir. Vakum altında bir speedvac konsantratörü kullanan numuneler kurulayın. </li><li> Nanoflow C18 ters faz sıvı kromatografisi, elektrosprey tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) arabirim sayesinde (1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) tarafından peptid fraksiyonları analiz edin. MS deneyler, lineer iontrap / Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans (FTICR) melez bir cihaz (LTQ FT 7T, Thermo Scientific, Waltham, MA) Peptid fulscan spektrumu (m / z 150 tarihinde yapıldı-2000), Müteakip, çarpışma endüklenen, ayrışma (CID) 9 yoluyla iontrap 5 en yoğun bir peptid zirveleri fragmentasyonu tarafından takip yüksek kütle çözünürlüğü (100,000) FTICR analizörü ile elde edilmiştir. </li><li> Peptide sekansı tanımlama veri tabanında eşleme tarafından gerçekleştirilir ve de novo dizi analizi ile tamamlanır edilebilir. Veritabanı arama için, piyasada bulunan arama motorları (Mascot, XTandem veya Protein fırsatçı) 20 istihdam edilmektedir. Aramalar genellikle bilinen veya tahmin nöropeptid ve nöropeptid habercisi proteinlerinin 21 dizileri dizileri içeren veritabanlarına karşı yapılmaktadır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Burada tarif edilen protokol, tekabül eden yaklaşık 300 Monoizotopik molekül türü (gösterilen ortalama spektrası için 1.000 'den daha fazla zirveleri tespiti ile sonuçlanmıştır göre hazırlanan striatal doku bölümlerini MALDI görüntüleme kitle spektrometrisiŞek. 1). Önde gelen moleküler iyon pikleri için veri görselleştirme Flex Görüntüleme yazılımı kullanarak elde etti ve anatomik özellikleri (Şekil 3) ile uyumlu iyi karakteristik pik şiddetlerinin dağılımı gösterdi. MALDI IMS bir diğer özelliği de görece iyi tekrarlanabilirlik. Bu deney,% 30 tepe noktası tespit edilen tüm molekül türü yoğunlukları için, varyans genel katsayısı, ama birçok zirveleri çok düşük bir varyasyon ve tedavi grupları (Şek. 4) içinde yüksek tekrarlanabilirlik görüntülenir. Ilgi hem lezyonlu ve sağlam striata dorsolateral ve dorsomedial bir bölümü dahil olmak üzere dört farklı bölgede, relatif zirve yoğunluğu verileri istatistiksel analize tabi tutuldu. Aynı anda çoklu karşılaştırmalar için ayarlamak için, istatistiksel analiz, 18 SAM aracı kullanarak parametrik olmayan test yoluyla yapıldı. En belirgin değişiklikler, dopamin Denerve, parkinson striatum dorsolateral parçası bulundu. İşte si , dynorphin B ve alfa-neoendorphin (Şekil 5); farklı tedavi grupları arasında orada önemli değişiklikler iki dynorphin peptidler için gözlenmiştir. Ayrıntılı olarak, hem dynorphin pik şiddetleri% 50-60 oranında göreceli bir artış, düşük, diskinetik hayvanlar ve lezyon denetimleri (karşılaştırıldığında yüksek diskinetik hayvanlarda gözlendi p &lt;0.05, F (2, 15) = 12.8 DynB, F = 5.7 aNeo; Şekil 5). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Kaudat putamen (CPU) ve nükleus akumbens (NAC); Şekil 1 Ortalama MS iki striatum yakından ilişkilidir bölgelerden elde izler. Iki bölgede benzersiz bir bölgede ifade bazı moleküler türleri ile farklı MS profillerin görüntülemek veya farklı tepe yoğunluğu seviyelerde (insert, m / z 2028). Her tepe mekansal dağılım deseni, özel bir görüntüleme yazılımı (alt panel) kullanılarak görüntülenebilir. "2.jpg /&gt; Şekil 2 (A), beyin, bir gömme medya (OTC; ok) kullanılarak bir kriyostat chuck üzerine monte edilir., Tezgah üstü beynin kesitli, peptidlerin OTC nedeni iyon supresyon yana olmak alanında kontamine gelmez özen. (B, C) İnce bölümler (≈ 12 mikron kalınlığında) çıplak gözle tespit etmek zor olabilir, MALDI uyumlu cam Slaytlarınıza çözülme monte ve C. (D) Microtears görüldüğü gibi, donma hasarı önlemek için birkaç saniye için kurutuldu ama MALDI matris kristalizasyon bozan ve MALDI MS sinyal yoketmek. , Cresyl menekşe ile boyanarak aynı bölümde microtears ve çatlaklar (sağ alt fotomikrografıdır) ortaya koymaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Verilerin değerlendirilmesinde ilk adım (AI) analiz kütle aralığı boyunca birkaç farklı zirveleri görselleştirmek için. Burada, 9 farelerin striatal bölümlerde, MALDI MS ile görüntülendi. Ortalama toplam Görselleştirme imevcut alanlarda göze çarpan yüksek veya düşük iyon yoğunlukları (oklar) ortaya çıkaracaktır. Bu alanlar üzerinde veya altında normalleşme etkileri ve sonuçları ödün deforme veri analizi tarafından etkilenebilir. Kötü anatomik pik dağılımları tanımı I. aracılığıyla, örneğin bölüm 3 ve 9, genellikle düşük tepe sinyal-gürültü ile zirveleri F bölümleri ortaya <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 tedavi grupları arasında MS tekrarlanabilirlik ortalama MS iz ve her m / z değeri (ekler, m / z 722 ve 1749) için standart hata hesaplanırken değerlendirilebilir. İyi tekrarlanabilirlik geçerli istatistiksel analiz sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3445/3445fig5_lg.jpg"><img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3445/3445fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"></a> Şekil 5 dynorphin B ve, alfa neoendorphin pik şiddetlerini, 6-OHDA, önemli ölçüde artmıştırLezyonlu, parkinsona, yüksek-diskinetik hayvanların striatum (HD; oklar), düşük-diskinezi (LD) ve lezyon kontrol grubuna (LC) için karşılaştırılmıştır. Peptid pik şiddetlerini, sağlam tarafın ortalama kat-değişim ± SEM (intakt / lezyon tarafı) olarak ifade edilir. * P &lt;0.05; cx korteks; cc korpus kallosum. Ölçek çubuğu 5 mm.

<ol><li>Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levodopa+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Levodopa motor complications in Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).</li>
<li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+biological+samples%3A+localization+of+peptides+and+proteins+using+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22MALDI-TOF+MS.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li>
<li>Obeso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+origin+of+motor+complications+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The evolution and origin of motor complications in Parkinson's disease.</a> Neurology. 55, S13-S20 (2000).</li>
<li>O, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncommunicable+Diseases+and+Mental+Health+Cluster%2C+Noncommunicable+Disease+Prevention+and+Health+Promotion+Department%2C+Ageing+and+Life+Course%5BTitle%5D)+AND+%22Active+Ageing%3A+A+Policy+framework%22%5BJournal%5D)">Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course.</a> Active Ageing: A Policy framework. , (2002).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+disorders%3A+advances+in+cause+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Movement disorders: advances in cause and treatment.</a> Lancet Neurology. , 6-7 (2010).</li>
<li>Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+levodopa-induced+dyskinesias+in+Parkinson%27s+disease%3A+problems+with+the+current+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: problems with the current model.</a> Ann. Neurol. 47, S22-S32 (2000).</li>
<li>Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DOPA-induced+dyskinesia+in+the+rat+is+associated+with+striatal+overexpression+of+prodynorphin-+and+glutamic+acid+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).</li>
<li>Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+fosB+expression+is+causally+linked+with+l-DOPA-induced+abnormal+involuntary+movements+and+the+associated+upregulation+of+striatal+prodynorphin+mRNA+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).</li>
<li>Hanrieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+striatal+neuropeptides+revealed+by+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).</li>
<li>Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+imaging+mass+spectrometry%3A+molecular+snapshots+of+biochemical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems.</a> Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).</li>
<li>Ljungdahl, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Elevated+Nigral+Levels+of+Dynorphin+Neuropeptides+in+L-DOPA-Induced+Dyskinesia+in+Rat+Model+of+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson's Disease.</a> PLoS ONE. 6, e25653(2011).</li>
<li>Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+directly+from+tissue%3A+in+situ+tryptic+digestions+coupled+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).</li>
<li>Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+of+proteins+and+peptides%3A+3D+volume+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction.</a> Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).</li>
<li>Deininger, S. -O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeininger%2C+S-O+%22Imaging+Mass+Spectrometry%22">Imaging Mass Spectrometry</a>. Setou, M. , Springer. Japan. 199-208 (2010).</li>
<li>Norris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+MALDI+Mass+Spectra+to+Improve+Mass+Spectral+Direct+Tissue+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis.</a> Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).</li>
<li>Ihaka, R., Gentleman, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Language+for+Data+Analysis+and+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+and+Graphical+Statistics%22%5BJournal%5D)">A Language for Data Analysis and Graphics.</a> Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).</li>
<li>Mass Spectrometry Binning Software GAB. , Vanderbilt Center for Quantitative Sciences. Nashville, TN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> (2012).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwePep%2C+a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar, ifşa etmek için bir şey var.

, Nöropeptidlerin çalışma olarak MALDI görüntüleme kütle spektrometresi istihdam çeşitli avantajları vardır. MS verilerin tarafsız bir analizi sadece belirli beyin çekirdekleri ortaya, ya da, striatum sadece dorsolateral kısmı belirli bir patofizyolojik durum ile ilişkili olduğu, burada sunulan sonuçlar. Mekansal bilgi istinat tarafından ilgi alanları yeniden tanımlamak için tüm beyin bölümlerinin analizi veya peptid ekstraklar geleneksel peptidomics çalışmaları kullanılarak ile karşılaştırıldığında daha yüksek hassasiyet ve daha düşük değişkenliği ile istatistiksel analiz yapmak mümkündür. Buna ek olarak,, MALDI IMS kolayca önceden bilinmeyen post-translasyonel modifikasyonlar tespit gerçekleştirmek için önemlidir, ancak yapısal analizler değiştirilmiş tam amino asit pozisyonları belirlemek için izlemeniz gereken. MALDI IMS veri görselleştirme ortak tuzaklar, bl doğrusal bir optik ölçekli maksimum tepe yoğunluğu haritalama(% 0) ack renk arasında deneysel serisi yerine ortak bir mutlak ölçek bölümlerden maksimum zirve yoğunluğu% 100 burada tüm bölümlerde eşleyerek ve her bölümü (Şekil 3), (% 100) (Şekil 5) . Ikinci yöntem grubu verileri ile karşılaştırılması ve tedavi grupları arasında farklılıklar görselleştirme sağlar. , MALDI IMS analizinde önemli bir engel belirli kitle doruklarına peptidlerin atama. Doku tandem-kütle spektrometresi bazen mümkün olabilir, ama genellikle 13,14 oldukça zor oluyor. Izledi güçlü katyon değişim kromatografisi, ters çevrilir faz LC-MS/MS tarafından bir preparatif fraksiyonasyon da dahil olmak üzere, geleneksel bir yaklaşım, başarıyla sekansı birçok nöropeptidler ve opioid peptidler, özellikle de kullanılabilir. MASCOT gibi sık kullanılan arama motorlarını kullanarak herhangi bir veritabanı girdilerinin eşleşmiyor kaliteli MS / MS spektrumları elde etmek için yine de nadir değildir. Bu durumlarda el ile de novo-sıralama only seçeneği. MALDI uygun tırnakları fare doku bölümleri IMS tarafından, pik kimlik nihai kanıtı elde edilebilir, ancak bu her zaman mümkün değildir. Bir alternatif diametrik farklı bir yöntem, örneğin, batı immunoblotting veya imünohistokimya ile doğrulamak için. Bu, genellikle yükselterek antikorlar ve eser yeni antikorlar doğrulanması önemli bir miktarını içerir. Bu protokol sunulan genel stratejisi, çeşitli bölümler ve deneysel koşullar da dahil olmak üzere büyük ölçekli nöropeptid MALDI IMS deneyleri için optimize edilmiştir. Altta yatan mekanizmalar ağrı ve uyuşturucu bağımlılığı endojen yanıt dahil olmak üzere araştırma farklı alanlarda istihdam protokolü, özellikle opioid peptidler için optimize edilmiş ve gelecekteki çalışmalarda büyük etkisi olacaktır.

1.1 örnek toplama ve hazırlama <ol><li> İsofluranın (Apoteksbolaget AB, İsveç) </li><li> Cerrahi aletler; iki çift makas, bir rongeur, spatula </li><li> İnce ezilmiş kuru buz </li><li> Alüminyum folyo ve depolama için plastik torbalar </li><li> Kriyostat (Microm, Heidelberg, Almanya) </li><li> Indiyum kalay oksit (ITO) kaplı MALDI slaytlar (Bruker Daltonics, Almanya) </li><li> optimum kesim sıcaklığı orta (OCT) (, Sakura Finetek Avrupa, Hollanda) </li><li> vakum desikatöre </li></ol> 1.2 Matrix uygulama <ol><li> Asetonitril (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) pro-analizi dereceli (Merck, Almanya). </li><li> Trifloroasetik asit (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). </li><li> Su bir Milli-Q saflaştırma sistemi (Millipore, Bedford, MA) ile saflaştırılmıştır. </li><li> CHIP-1000 (Shimadzu, Japonya) veya Dikey 630 gözcü (LabCyte, Sunnyvale, CA) </li></ol> 1.3 Kütle spektrometrisi <ol><li> Ultraflex II (Bruker Daltonics) </li><li> FlexImaging yazılımı (v 2.0 Bruker Daltonics,) </li><li> Peptid veya protein Kalibrasyon Standart (Bruker Daltonics) </li></ol> 1.4 Veri işleme <ol><li> Kökeni v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA) </li><li> Matlab sürümü 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA) </li><li> pBin ( <a href="http://www.vicc.org/biostatistics/software.php" target="_blank">http://www.vicc.org/biostatistics/software.php</a> ) </li></ol> 1.5 Nöropeptit tanımlama <ol><li> Ultrason sonikatör </li><li> 10 kDa moleküler ağırlık cut-off filtresinden (Millipore, Bedford, MA) </li><li> SP Sephadex C&#39;de 25 jel (Sigma, Almanya) </li><li> Hypersil sütun (ThermoFisher) </li><li> Piridin, formik asit, pro-analizi dereceli (FA) Asetonitril (ACN), metanol (MeOH), etanol (EtOH) (Merck, Almanya). </li><li> Trifloroasetik asit (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). </li><li> Agilent 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 kolon (0,075x150mm) </li><li> Agilent 1100 Mikro-fractioncollector, Prespotted anchorchip hedef plakası (Bruker Daltonics) </li><li> BioTools yazılımı (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics) </li><li> Biyografi Eserleri yazılım (v.3.3, Thermo Fisher; <a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank">www.thermoscientific.com</a> ) </li><li> Maskot yazılımı (v 2.2, MatrixScience; <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ) </li><li> Swepep veritabanı ( <a href="http://www.swepep.org" target="_blank">www.swepep.org</a> ) </li></ol>

parkinson hastalığında nöropeptitler maldi görüntüleme kütle spektrometresi

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI görüntüleme kütle spektrometresi (IMS) moleküler türlerin biyolojik doku örnekleri 2 (Şekil 1) mekansal analiz kolaylaştıran güçlü bir yaklaşım. 12 mikron ince bir doku bölümünde tipik bir MALDI TOF / TOF kütle spektrometresi kullanarak, sağlam bir kitle analizi ile tespit edilebilir peptitler ve proteinlerin desorpsiyon ve iyonizasyon kolaylaştıran bir matris, MALDI ile kaplıdır. Genellikle tek bir fare beyin dokusunda bölümünde zirveleri yüzlerce değerlendirilebilir. Yaygın olarak kullanılan görüntüleme tekniklerinin aksine, bu yaklaşım ilgi moleküllerin ön bilgi gerektirmeyen ve yüksek molekül özgüllüğü ve duyarlılığı 2 korurken, birden fazla moleküler türlerin denetimsiz ve kapsamlı bir analiz sağlar. Burada bir hayvan modeli Parkinson hastalığı (PH) sıçan beyinde ortaya çıkması için, nöropeptidlerin bölgeye özgü dağıtım profilleri MALDI IMS tabanlı yaklaşımı açıklar. PD prevalansı% 1 3,4 yaş 65 yaş üstü insanlar için ortak bir nörodejeneratif bir hastalıktır. En yaygın semptomatik tedavi dopamin replasman 5 L-DOPA ile dayanmaktadır. Ancak bunun yanında şiddetli yan etkilere istemsiz olarak adlandırılan, L-DOPA ile endüklenen diskinezilerinin (KAPAKLI) 1,3,6, anormal hareketleri, eşlik etmektedir. KAPAKLI en önde gelen moleküler değişim Bir upregülasyonu, mRNA 7 opioid habercisi prodynorphin bir. Dynorphin peptidler hareketi kontrolü 7,8 esas alan beyin alanlarında nörotransmisyonu modüle. Ancak,, nöropeptid habercisi işleme menşei tam opioid peptidler, bugüne kadar henüz tanımlanmamıştır. Bu nedenle, deneysel Parkinson hastalığı ve L-DOPA bağlı diskinezi bir hayvan modeli MALDI IMS kullandı. MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi nöropeptid Örneklerin açısından özellikle avantajlıdır olduğu kanıtlanmıştırTION, yaygın olarak kullanılan antikor temelli yaklaşımlar beri bilinen peptit dizileri ve daha önce gözlenen post-translasyonel modifikasyonlar hedefliyor. MALDI IMS aksine yeni peptid işleme ürünleri çözmeye ve böylece yeni moleküler nöronal iletim nöropeptit modülasyonu mekanizmaları ortaya koymaktadır. Nöropeptidlerin mutlak miktarı, MALDI IMS tarafından belirlenir mümkün olmasa bile,, peptit iyonların göreceli bolluk, sağlık ve hastalık düzeyleri değiştirme hakkında anlayışlar veren kitle spektrumu tarif edilebilir. Burada sunulan örnekler, dynorphin B, alfa-neoendorphin ve P maddesi pik şiddetlerini dorsolateral önemli ölçüde artmış olarak bulundu, ancak ciddi diskinezi ile, hayvanların dorsomedial, striatum (Şekil yüz, gövde ve orolingual kasları içermeyen 5). Ayrıca, MALDI IMS, fonksiyonel inacti daha önceden bilinmeyen bir mekanizma temsil eden,, diskinezi şiddeti ve alfa-neoendorphin des-tirozin düzeyleri arasında bir ilişkiyi ortaya, N-terminal tirozin çıkarılması gibi striatum içinde dynorphins vation dynorphin, opioid-reseptör bağlanma kapasitesi 9 azaltır. Bu, MALDI IMS ve sonuçları biyomedikal araştırmanın bütün alanlarında uygulama için teknik potansiyeli vurgulamak kullanarak KAPAKLI nöropeptit karakterizasyonu üzerine ilk çalışmadır.

Dopamin değiştirme farmakoterapi L-DOPA ile Parkinson hastalığının en yaygın olarak kullanılan semptomatik tedavi, anormal istemsiz hareketleri olarak adlandırılan diskinezi dahil olmak üzere, yan etkileri ile birlikte<sup&gt; 1</sup&gt;. Burada,, MALDI görüntü kütle spektrometresi için bir protokol, diskinezi ilgili sıçan beyin nöropeptid düzeyleri değişiklikleri algılar sunulmaktadır.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi (IMS), biyolojik doku örneklerindeki moleküler türlerin konumsal analizini kolaylaştıran güçlü bir yaklaşımdır2 ...

Bu prosedürün temel amacı, matris destekli görüntüleme kütle spektrometrisi kullanarak, özellikle opioid peptitlerin ince beyin kesitlerindeki uzamsal dağılımını aydınlatmaktır. Bu işlem, öncelikle şok dondurulmuş sıçan beyninden 12 mikrometre kalınlığında doku kesitleri alınması ve ardından bunların iletken cam lamlar üzerine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kimyasal bir püskürtmeli yazıcı kullanarak kesitler boyunca diziler halinde matris uygulanması ve ardından her bir matris noktasından bir kütle spektrumu elde edilmesidir.Deneyin genel başarısını doğrulamak için sonraki birkaç peptit piki görselleştirilir. Bunu, kütle spektrumu dışa aktarımının incelenmesi ve işlenmesi, peptit verilerinin sonradan işlenmesi ve istatistiksel değerlendirme takip eder. Son adım, küflenmiş görüntüleme kütle spektrometrisi ile elde edilen peptit verilerinin analiz edilmesi ve doğrulanmasıdır.Sonuçlar, farklı tedavi grupları arasında beynin farklı bölgelerindeki bağıl opioid peptid seviyelerinde anlamlı farklılıklar olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin, radyo immüno SAO jel tabanlı yaklaşımlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çoklu görüntülemenin yüksek moleküler spesifikliği korurken tedavi kaynaklı değişikliklerin lokalizasyonuna olanak tanımasıdır. Bu durum ise bize, daha önce tespit edilemeyen translasyon sonrası modifikasyonların kısalmalarını tespit etme imkanı sağlamaktadır.Bu yöntemde yeni olan kişiler, tekniğin kapsamlı numune hazırlama ve veri işleme gerektirmesi nedeniyle başlangıçta zorlanabilirler. Burada odak noktası doku kalitesi, matriks, uygulama protokolü, veri değerlendirmesi ve ardından gelen doğrulama deneyleri olacaktır. Proteolitik bozunmayı önlemek için doku diseksiyonu sırasında hızlı ve titiz çalışmak esastır.Onaylanmış protokoller uyarınca sıçan sakrifye edildikten sonra beyni derhal çıkarın, toz kuru buza aktarın ve beynin nispeten yavaşça donmasını sağlayın, ardından beyni -80 °C dondurucuda saklayın. Bütün beyinler, MS sinyal kalitesinde kayıp olmaksızın kesit alınana kadar birkaç yıl boyunca saklanabilir. Prosedüre başlamaya hazır olduğunuzda, beyni doku tekniği gömme medyası kullanarak tutucuya monte edin; gömme medyasının peptidlerin iyonizasyonunu ve desorpsiyonunu engellemesi nedeniyle, beynin kesilecek kısmının kontamine olmasından kaçının.Dondurulmuş dokuyu bir kriyostat mikrotomda 12 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve doku kesitlerini iletken MALDI cam lamlarına monte edin. Bu aşamada doku kesitlerinin boyanması gerçekleştirilebilir ve doku kalitesi incelenebilir. Bu şekil, sıvı azot içinde şok dondurulan ve bu nedenle dokuda çatlama ve yırtılmalara yol açan beyin dokusunun kristal viyole boyamasını göstermektedir.Matris yayılacağı ve eşit şekilde kristalleşmeyeceği için bu doku, yüksek çözünürlüklü MALDI görüntüleme kütle spektrometrisi için uygun olmayacaktır; kesitleri vakum altında 15 dakika boyunca kurutun ve lamları daha sonra kullanana kadar -80 °C'de saklayın. Dokul kesitleri, -80 °C'de saklansalar bile kesim işleminden sonra mümkün olan en kısa süre içinde analiz edilmelidir. Öncelikle, kesitleri bir desikatörde bir saat boyunca çözdürün, ardından kesitlerin bulunduğu lamları oda sıcaklığında %70 ethanol ile 10 saniye boyunca yıkayın ve ardından oda sıcaklığında her biri 10 saniye sürecek şekilde %95 Ethanol ile iki kez yıkayın. Yıkama işleminden sonra lamları bir desikatörde 10 dakika boyunca kurutun.Doku kesitlerinin, mold EMS kalitesini bozabilecek doku distorsiyonu, mikro yırtıklar veya küçük çatlaklar içermediğinden ve iyi kalitede olduğundan emin olmak için kesitleri mikroskop altında inceleyin. Ardından; 50 mg/mL DHB ve %50 metanol, %10 150 mM amonyum asetat ve suda %0,3 trifloroasetik asit içeren taze matris çözeltisi hazırlayın. Doku kesitinin bulunduğu cam lam tutucuyu tarayın ve çip yazılımındaki görüntü analiz özelliğini kullanarak tutucuyu ilgili referans noktalarına hizalayın.Ardından, hem beyin bölgesi hem de hedeflenen analitler için uygun matris uygulama parametrelerini seçin. Sonrasında, uzamsal çözünürlüğü belirtin. Şimdi, optimize edilmiş protokolü kullanarak matrisi chemical link Jett yazıcısında uygulayın.Çoklu veri talebi öncesinde, matriks damlatılmış son bölümleri tarayın ve görüntüyü kaydedin. Bu görüntü, daha sonra matriks birikintilerinin MALDI tablasının motor koordinatlarıyla çapraz referanslanması için kullanılacaktır. Hemen kullanılmayacaksa, matriks damlatılmış bölümler ihtiyaç duyulana kadar bir vakum altında desikatörde saklanabilir.Çoğu deney için, burada görüldüğü gibi birkaç kesit aynı anda analiz edilecektir. Her lam tutucu iki cam lama uygundur ve bu nedenle tüm tutucular için ikişerli çoklu setlerin analiz edilmesi gerekir. MALDI-TOF analiz yöntemleri ve parametreleri aynı olmalıdır, ancak her lam için peptit kütle kalibrasyonları kontrol edilmelidir.Ardından, lazer odağı ve lazer yoğunluğu dahil olmak üzere, doku örneği üzerindeki kazanım parametrelerini optimize edin. Daha sonra, baz çizgisini yükseltmeden, pik çözünürlüğünü düşürmeden, dedektörü doyurmadan veya komşu matris birikintilerinden matris ablasyonu yapmadan optimal bir MS sinyali elde etmek için gereken atış sayısını girin ve lazer hareketini seçin.Yalnızca gürültünün tespit edileceği ana kadar, matris noktası başına alınabilecek maksimum çekim sayısını tahmin edin. Rastgele bir hareket örüntüsü kullanılarak, toplam 24 adım boyunca 25'er çekimlik adımlarla her bir matris birikiminden 600 çekim biriktirilir. Tüm noktalanmış bölümlerin taramaları, flex görüntüleme yazılımı kullanılarak MALDI tablasının motor koordinatlarıyla çapraz referanslanır.Ardından, otomatik yürütme toplu işlem yazılımını kullanarak veri toplama işlemini toplu modda gerçekleştirin. Pik yoğunluğu dağılımlarını görsel olarak incelemek ve pik yoğunluğu dağılımlarının doku özellikleri, spotlama kalitesi veya normalizasyon etkileriyle ilişkili olup olmadığını belirlemek için Flex görüntüleme gibi veri görselleştirme araçlarını kullanarak Maori IMS görüntülerini kontrol edin. Bu örnek, dokuz farklı hayvanda 10 farklı peptid piğinin dağılımını göstermektedir.Normalizasyon için kullanılan toplam iyon akımı veya TIC beyaz renkte gösterilmektedir. TIC, bir kütle spektrumundaki tüm şiddet değerlerinin toplamıdır. Üçüncü hayvanda TIC değeri çok düşüktür ve peptit görüntüleri spesifik bilgilerden ziyade daha fazla gürültü göstermektedir.Altı numaralı hayvandan alınan beyin, kesitin alt kısmında çok yüksek TIC değerlerine sahip bir alan göstermektedir. Bu durum, C ve D peptid görüntülerinin ilgili alanındaki anormal derecede yüksek yoğunluklar olarak yansımıştır. Bu, veri analizini etkileyebilecek potansiyel bir aşırı normalizasyon etkisidir. Aşırı normalizasyon etkileri, özellikle yalnızca tek bir tedavi grubunda mevcutsa hatalı sonuçlara yol açabilir.Bu örnekte, TIC grup C için önemli ölçüde daha yüksektir ve bu durum bireysel pik yoğunluklarını anormal şekilde etkileyebilir. Örneğin, ham verilerde sitokrom C için ortalama pik yoğunluğu grup C'de grup B'ye göre daha yüksektir, ancak normalizasyondan sonra pik yoğunluğu artık daha düşüktür. Grup C için bu durum, sonuçların ciddi şekilde yanlış yorumlanmasına yol açabilir.Kapsamlı veri doğrulamasına geçmeden önce, her bir tedavi grubu için ortalama TIC'nin her zaman hesaplanması önemlidir. Ardından, ilgi bölgesini tanımlamak için, pro dinorfine haberci RNA'nın 14 kilodaltonluk pro dinorfine propeptidine çevrildiğini anlamak önemlidir. Striatal nöronlarda, pro dinorfine, dendritler aracılığıyla diğer striatal nöronları hedeflemek veya aksonlar aracılığıyla hücre gövdesinden birkaç milimetre uzaklıktaki substantia nigra'ya taşınmak üzere veziküllere paketlenir.Veziküller, propeptidi alfa neo endorphin di norphine A veya DI norphine B gibi di norphin peptitlerine daha fazla işleyen enzimler içerir. Hedef yapı olan substantia nigra'ya salındıklarında her biri farklı opiyat reseptörlerini aktive edebilir; dinorphinler daha sonra endo ve ekso peptidazlar tarafından işlenir ve temizlenir. Mevcut antikorların yalnızca peptitlerin C terminal ucunu hedeflemesi ve N terminal ucunu hedeflememesi nedeniyle, bu peptitlerin bazıları yalnızca kütle spektrometrisi ile tespit edilebilir. Opioid reseptör aktivasyonundan sorumlu Y-G-G-F-L sekansı; di norphine üreten hücreler stray AUM'de bulunur ve substantia nigra'ya projeksiyon gönderir.Bu nedenle, sonraki deneyde, hem şaşal AUM hem de subs nigra, her bir ilgi bölgesinden alınan spektrumlarla moldy IMS kullanılarak analiz edilmiştir. Dorsal medial ve dorsal lateral stri aum ile medial ve lateral nigra, flex analiz yazılımında tanımlanmış ve veri analizi için dışa aktarılmıştır. Veri azaltma işlemi için, farklı yazılımlarda bulunan pik bulma araçlarını kullanarak pik tespiti gerçekleştirin.Örneğin, Origin'de pik analizi veya Matlab'da MS Peaks kullanın. Tüm spektrumlardaki pik listesini tek bir sekme ile ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktarın, Freeway P bin gibi bir yazılım kullanarak pik başlangıç ve bitiş sınırlarını belirleyin, pik sınırları arasındaki eğri altındaki alanı hesaplayın ve bunları istatistiksel analiz için kullanın. MS. Tedavi grupları arasındaki tekrarlanabilirlik, her kütle değeri için ortalama MS izi ve standart hata hesaplanarak değerlendirilebilir.Bu örnekte, analiz edilen kütle aralığındaki değişkenliği değerlendirmek için sağlam kontrol nigra grubuna ait ortalama spektrumlar kullanılacaktır. Pik şiddetlerinin her iki kontrol grubunda eşit olması ve standart sapmanın düşük olması sayesinde iyi bir tekrarlanabilirlik görülebilir. Bu durum, istatistiksel analizin geçerliliğini sağlar.Veri setleri yüksek derecede varyasyon gösteriyorsa, deneysel varyasyon kaynaklarını mümkün olduğunca azaltarak Maori IMS deneyini tekrarlamak neredeyse her zaman gereklidir. Tipik olarak, bazen vardiyalı çalışan birkaç kişiyi de dahil ederek, tek bir oturumda mümkün olduğunca çok kesiti ve hayvanı işleriz. Ancak, bazı durumlarda bu hala yeterli olmayabilir ve diğer stratejiler uygulanabilir.Örneğin, bazı spektrumlar gürültü içeriyorsa, bunlar TIC'nin frekans dağılımı çizilerek tespit edilebilir ve suboptimal verileri ayıklamak için bir kesme eşik değeri kullanılabilir. Verileri değerlendirmenin bir başka yolu da, aynı grup içindeki iki hayvana ait tüm pikleri birbirine karşı grafiğe dökmektir. Pik yoğunlukları her iki hayvanda da eşitse, yoğunluk-yoğunluk grafiği düz ve dar bir çizgi gösterir.Bir hayvan düşük kaliteli spektral veri içeriyorsa, grafik genellikle sağda görüldüğü gibi düz çizgiden asimetrik kaymalar gösterir. Peptit dizisinin tanımlanması için, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş çok boyutlu sıvı kromatografisi kullanarak sıçan beyin dokusu ekstraktlarında peptid Dominic analizi gerçekleştirin. Kısaca, nöropeptitler sıçan beyin kesitlerinden ekstrakte edilir ve güçlü katyon kromatografisi aracılığıyla ön fraksiyone edilir.Farklı fraksiyonlar daha sonra nano akış ters faz HPLC kullanılarak ayrıştırılır. Ardından, hibrit lineer iyon tuzağı ria transform iyon siklotron rezonans cihazları kullanılarak elektrospray tandem kütle spektrometrisi yoluyla nöropeptitlerin karakterizasyonu yapılır ve son olarak veri tabanı eşleştirmesi ile peptit dizilimi tanımlaması gerçekleştirilir; bazı nöropeptitler için spesifik antikorlar mevcuttur ve immünohistokimya deneyleri peptit tanımlamasının yanı sıra deneysel sonuçları da doğrulayabilir. Çözünürlük, MALDI görüntüleme kütle spektrometrisinden daha yüksektir ve ek bilgiler elde edilebilir.Bu örnekte, sol üst paneldeki hipokampusta ve sol alt paneldeki substantia nigra'da Dior arı immünoreaktif sinir lifleri görülebilirken, sağ alttaki Maori IMS görüntüsü farklı beyin bölgeleri düzeyindeki lokalizasyonu ortaya koymaktadır. Bir pik kütlesinin kesin olarak belirli bir peptide atanabileceğine dair nihai kanıt, pronin knockout faresindeki peptid knockout hayvanlarda moldy IMS gerçekleştirilerek elde edilir. Oklarla belirtilen birkaç pik, wild type kontrolde mevcutken knockout örneğinde eksiktir.Substans P ve P ink gibi ilişkisiz peptit pikleri, nakavt ve kontrol hayvanları arasında herhangi bir fark göstermemektedir. Dinorfini B ve alfa neoendorfin pik yoğunlukları, altı hidroksi dopamin lezyonunda anlamlı derecede artmıştır. Oklarla belirtildiği üzere, yüksek diskinezi gösteren Parkinsonian striatın AUM değerleri, düşük diskinezik ve lezyon kontrol grubuna kıyasla daha yüksektir.İstatistiksel analizler ayrıca, uç terminal tirozin kalıntısının uzaklaştırıldığı trunkat alfa neo endorphin'e karşılık gelen bir peptid kütlesinde anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur. Nitekim görsel incelemede, görüntüleme sonuçları yeşil ile gösterilen ana di norphine peptidleri ile kırmızı ile gösterilen ilgili DES tirozin metabolitlerinin yüksek kolokalizasyonunu göstermektedir; sağdaki üst üste bindirme panelindeki sarı renk, bölgesel örtüşmeyi ifade eder. Bu tekniğin sahip olduğu büyük potansiyel, diğer yöntemlerle tespit edilemeyen, farklı beyin yapılarındaki seçici peptid işlenmesine ilişkin bulgularla vurgulanmaktadır.Burada, kırmızıyla gösterilen spesifik DES tirozin metabolitleri, yeşil ile gösterilen ana peptid ile aynı konumda yer almış ve diskinezik sıçanların sadece striatumunda gözlemlenmiş, ancak substantia nigra'da görülmemiştir. Substantia nigra görüntüsünün analizi, kırmızıyla gösterilen degradasyon ürünü lu ve kelin arch'ın, yeşil ile gösterilen di norphine B ile ters konumlandığını ortaya koymuştur; bu durum, diskinezi sırasında DI norphine B'nin lateral substantia nigra'da lokal olarak salındığını ve ardından lu ve careful in AR One düzeneğinde metabolize olduğunu göstermektedir. MALDI görüntüleme kullanan tek bir deney, örnek hazırlama ve veri toplama için bir veya iki günde gerçekleştirilebilir.Bunu veri değerlendirmesi için bir veya iki günlük bir süre daha takip eder. Örnek boyutuna bağlı olarak, doğrulama deneylerinin düzgün bir şekilde yürütülmesi durumunda, laboratuvarda bir veya iki günlük ek uygulama gerekecektir. Aşağıdaki adımlarda özellikle dikkatli olunması önemlidir.Pep bozunmasını önlemek için doku diseksiyonu ve dondurma işlemi hızlıca yapılmalı; yıkama ve matriks uygulama protokolü her deney için optimize edilmelidir. Aşırı normalizasyon etkileri veya zayıf pik tespitleri nedeniyle oluşabilecek yanlış pozitiflerin önüne geçmek için veri değerlendirmesi ve istatistiksel analizler dikkatle incelenmelidir.

maldi-imaging-mass-spectrometry-neuropeptides-parkinson-s

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada elektrofizyoloji ve Ca2 + görüntüleme için uygun agar-gömülü retina dilim hazırlanması için bir protokol. Bu yöntem, tek presinaptik sinir uçları doğrudan patch-klemp kayıtları kullanarak retina mikrodevreler şerit-tip sinaps bir çalışma sağlar.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Yeni bir kantitatif yaklaşım sunan bir ELISA açıklanmaktadır. Spesifik olarak, bir transgenik fare modeli (M83) içindeki (M83) sinoleinopatide, Ser129 fosforile αS formu veya proteinin C-terminal kısmına karşı çeşitli antikorlar kullanarak hastalıkla ilişkili α-sineulini (αSD) tespit etmektedir.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.

Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Bu protokol, substantia nigra'nın nöromelanine duyarlı manyetik rezonans görüntüleme verilerinin nasıl elde edileceğini gösterir.

Substantia Nigra'nın Nöromelanine Duyarlı Manyetik Rezonans Görüntülemesi için Standartlaştırılmış Veri Toplama

Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.

Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol

Nöropeptitlerin kütle spektrometrik karakterizasyonu sekans, kantitasyon ve lokalizasyon bilgileri sağlar. Bu optimize edilmiş iş akışı sadece nöropeptit çalışmaları için değil, aynı zamanda diğer endojen peptitler için de yararlıdır. Burada verilen protokoller, LC-ESI-MS, MALDI-MS lekeleme ve MALDI-MS görüntüleme kullanılarak nöropeptitlerin örnek hazırlama, MS edinimi, MS analizi ve veritabanı oluşturmayı açıklamaktadır.

Callinectes sapidus'ta Nöropeptitlerin Çok Yönlü Kütle Spektrometrik Araştırması

Fare merkezi sinir sisteminin histolojik analizi için uygun bir yerçekimi beslemeli perfüzyon yöntemi sunulmaktadır. Fosforile α-sinükleinin immünofloresan tespiti, Parkinson hastalığının bir fare modelinde gösterilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda transkardiyal perfüzyon, diseksiyon, doku dondurma/gömme ve dondurulmuş kesit adımlarını kapsamlı bir şekilde tanımlamaktadır.

Fare Merkezi Sinir Sisteminin Histolojik Analizi için Yerçekimi Beslemeli Transkardiyal Perfüzyon Yöntemi

Bu çalışma, fare beyin dokusunda immün boyama ve görüntü analizine dayalı olarak mitokondri morfolojisini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bunun Parkinson hastalığı modellerinde protein agregasyonunun neden olduğu mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri nasıl tespit etmesine izin verdiğini de açıklar.

Bir Parkinson Hastalığı Modelinde Mitokondriyal Morfolojinin Histolojik İncelemesi

Bir protokol unilateral 6-OHDA lezyonlar, farelerde medyal önbeyin demet gerçekleştirmek için tarif edilmektedir. Bu yöntem, striatal dopamin ve 90,63&gt;% 95 kaybı gösteren hayatta kalan hayvanların% 89 ile düşük mortalite oranı (% 13.3) ±% -4,02, lezyonun tarafa doğru ipsiversive dönme önyargı vardır.

Parkinson Hastalığının tek taraflı lezyonlanmıştır 6-OHDA Mouse Model Geliştirme

Öğrenin, Parkinson hastalığında L-DOPA tedavisine bağlı diskinezi ile ilişkili neuropeptid değişikliklerini sıçan beyinlerinde MALDI görüntüleme kütle spektrometresi ile tespit etmeyi. Bu yöntem yüksek moleküler özgüllük sağlar.

Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

Daha fazla video keşfet