Name: Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae mayalarında poliglutamin toksisitesini değerlendirmek için plakalama, noktalama ve sıvı kültür büyüme testlerini kullanmayı. Bu yöntemler nörodejeneratif hastalıklarda protein katlanma bozukluklarını araştırmak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Duennwald laboratuvarda İş Yaşlanma Araştırma (uzaktan), Kalıtsal Hastalık Vakfı (HDF) ve William Wood Vakfı Amerikan Federasyonu hibe ile desteklenmektedir.

1. Maya toksik PolyQ-genişleme Proteinlerin Anlatım Sistematik analizi maya 7 toksisite üretmek için gerekli olan bir polyQ-genişletme proteinin amino asit sekansı hassas oluşturmuştur. Bu toksik polyQ-genişletme proteini Şekil, Huntinğtin protein, bir polyQ bölgeye ve bir karboksi-terminal füzyon orijinal bir flüoresan sekansı protein (GFP veya CFP ya ila 17 amino asit, ardından bir amino-terminal bayrak-etiketi içerir 1. a). Indüklenebilir ve nispi kuvvetli GAL1 promotör 7, 9 kontrolü altında eksprese olduğunda glutamines 46 ya da daha fazla polyQ açılımı olan proteinlerin ifade (72 ve 103 glutamines gibi) maya toksisite üretir. Daha önce açıklandığı gibi, maya polyQ toksisitesi olan prion konformasyonundadır proteini Rnq1p taşıyan hücrelerin sadece açıktır, [RNQ +], örneğin, maya suşu W303 9. Toksik polyQ-genişleme protein rBöyle polyQ boyu bağımlı toksisite (aşağıya bakınız) ve kümeleme (Şekil 1 b) maya polyQ-biyoloji ecapitulates merkezi yönleri. Özellikle, toksik polyQ-genişleme proteinler hemen maya hücrelerini öldürmek değil; onlar yerine bozan veya hücre döngüsü ve hücre devision tutuklu, böylece plaklar veya sıvı kültürler (bizim yayınlanmamış bulgular) maya kolonisi büyümenin yavaşlaması ya da engellenmesi. 2. Maya Hücreleri ile Potansiyel Sorunları Toksik PolyQ-genişleme Proteinler ifade Aksi takdirde zehirli polyQ genişleme proteinleri Maya hücreleri herhangi bir büyüme kusuru 9 göstermeyebilir. PolyQ-toksisite bu bastırıcılarının genetik yapısı basit Mendel mutasyonlara dayalı görünmüyor ve dolayısıyla nispeten yüksek frekans (bizim yayımlanmamış sonuçlar) ile oluşabilir. Biz bu spontan bastırıcılarının benzer için [RNQ +] polyQ toxicity.Thes belirlenmesinde işlev tanımlanamayan prionlar kür neden olduğu spekülasyonpolyQ toksisite e spontan bastırıcılarının polyQ toksisite karakterize etmek ya da tanımlamak ve polyQ toksisite değiştiriciler karakterize amaçlayan bir deney başarılı sonuç tehlikeye sokabilecek. Bu spontan bastırıcılarının sık görülmesi önlemek için, çok etkili olduğu kanıtlanmış aşağıda belirtilen önlemler, izleyin: <ol><li> Toksisite denemeleri için taze maya hücreleri kullanın. Uzun süre için maya saklamayın. Sıkça dondurulmuş stokları taze maya kolonileri almak. </li><li> Sıkça floresan mikroskop ile ifade ve toksik polyQ-genişleme proteinlerin agregasyonu izlemek. </li><li> Herhangi bir zehirlenme ölçümler başlamadan önce her zaman toksik polyQ toksisite (tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren seçici ortam yani) ifadesi bastırmak medyasında maya hücreleri tutun. </li><li> Her polyQ-toksisite deneyi için en az üç bağımsız transformantlar kullanın. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Büyüme Tahliller <ol><li> Her deneysel koşul için, tek karbon kaynağı olarak glukoz ile seçici maya medya 3 ml toksik polyQ-genişleme protein barındıran maya hücrelerinin üç bağımsız transformatlardan her biri koloni aşılamak. </li><li> 30 gece boyunca bu kültürlerin inkübe ° C Ortamda glukoz bunların ifadesi bastıran, çünkü bu koşullar altında, hücrelerin polyQ-genişletme proteini ifade değildir. Bu kültürlerin büyümek izin vermeyin; 1 Aşağıdaki gece kültürlerin OD 600 (600 nm dalga boyundaki ışık absorbans) tutmak. </li><li> Biz rutin olarak toksik polyQ-genişleme proteini ifade maya hücrelerinin büyümesini kusurları izlemek için üç farklı testler kullanabilirsiniz: </li></ol> Plakalar üzerine 3.1 Büyüme <ol><li> Bana seçici 0.0005 bir OD 600 (yani bir OD600 = 0.5 kültürün bir 1:1000 dilüsyon) için gece maya kültürleri (220 rpm çalkalama ile yetiştirilen) sulandırınızdia 7 içeren glikoz. </li><li> Eşit seçici tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren orta ve tek karbon kaynağı olarak galaktoz içeren seçici besiyeri ile bir levha ile bir tabak (10 cm çapında) her seyreltilmiş kültürün 50 ul (ca sonuçlanan plaka başına. 700 koloni) yayıldı. </li><li> 30 ° C'de 3-4 gün süreyle inkübe Inkübasyondan sonra, her plaka fotoğraflarını çekmek ve galaktoz tabaklarda glikoz ve kolonilerin sayısı kolonilerin sayısı. Çok zehirli bir polyQ-genişleme protein (103Q, Şekil 2a) ifade maya hücreleri kullanırken İdeal koşullar altında, galaktoz plaka üzerinde hiç ya da çok az koloniler olmalıdır. </li></ol> 3.2 Spotting deneyleri Bu test kaplama deneyi yukarıda açıklanan daha nicel ve böylece aynı plaka üzerinde aynı deneyi ile polyQ toksisite bile ince farklılıklar ortaya çıkarabilir. <ol><li> Overn sulandırınızight kültürlerin 0.1 bir OD 600 glukoz ile orta büyüdü. </li><li> Pipet 200 steril 96-tabak içine bu seyreltilmiş kültürlerin ul ve çok kanallı pipet ile steril su içinde beş beş kat seri dilüsyonlar hazırlamak. </li><li> Bir Frogger, (ayrıca hücre süspansiyonları transferi için 8 x 6 iğneli bir gözcü olarak adlandırılır) kullanarak tek karbon kaynağı ve tek karbon kaynağı olarak galaktoz seçici ortamı içeren plakalar olarak glukoz ile seçici ortam içeren plakalar üzerinde hücre süspansiyonları aktarın. </li><li> Plaka 30 bunları kuluçkaya ° C'de üç dört gün için önce kurumasını bekleyin. </li><li> Inkübasyondan sonra, her plaka fotoğrafları (Şekil 2b) alır. </li></ol> 3.3. Sıvı kültürleri büyüme maya polyQ toksisite izlenmesi Bu protokol, burada açıklanan üç testlerinin (OD600 numaraları) en nicel ve hatta polyQ toksisite çok ince farkları tespit edebilir. Anılan ocspontan bastırıcılarının currence Ancak, potansiyel olarak yanıltıcı sonuçlar üretebilir. Bu nedenle yukarıda tarif edilen iki kaplama deneyleri en az biri ile bu tahlilde birleştirerek önermektedir. Biz bu deneyler için BioscreenC enstrüman kullanmayı öneriyoruz. BioscreenC tanımlanan ajitasyon ile tanımlanmış sıcaklıklarda inkübe ise otomatik olarak 100 de plaka maya kültürleri optik yoğunluğunu ölçen bir alettir. Maya hücreleri büyüyor ve optik yoğunluk ölçüm için başka yöntemler de uygulanabilir. <ol><li> 3 ml steril su içinde tek karbon kaynağı olarak üç kat glukoz ihtiva eden en az ortamından maya hücrelerinin yıkanır. </li><li> 0.1 bir OD 600 galaktoz orta yetiştirilen gecede kültürleri sulandırınız. </li><li> Maya kültürlerin 300 ul 100 kuyucuklu BioscreenC plakanın her doldurun. </li><li> Kolay Bioscreen Deney programını açın. Eğer (boşlukları ve orta dahil olmak üzere sadece izlemek isteyen örneklerin sayısını belirlemekontrol), 30 ° C sıcaklığı ayarlamak 3 gün deneyler uzunluğunu ayarlamak, 15 dakika ölçüm aralıkları ayarlamak, 600 nm filtre / Kahverengi ayarlayın ve her ölçümden önce 15 saniye sallayarak modunu ayarlamak Orta kuvvette. </li><li> BioscreenC alet ve ekli yaz deney sırasında alınan her bir veri noktasının Excel tabloları üretecek. </li><li> Her numune için Excel ile büyüme eğrileri hazırlayın ve farklı örnekleri (Şekil 2c) büyüme karşılaştırın. BioscreenC deneyler tarafından üretilen verinin analizi ayrıntılı bir açıklaması 10 daha önce sağlanmıştır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.. Maya polyQ modeli. kısa, toksik olmayan polyQ ifade maya hücreleri gösteren zehirli polyQ-genişleme protein. b a) şematik) Floresans mikroskobugenişleme protein (25Q, sol panel) ve maya hücreleri uzun, toksik polyQ-genişleme protein (103Q, sağ panel) ifade. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. PolyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyümesini tahlillerin Temsilcisi sonuçları. a) Kaplama testi. yaklaşık 700 maya hücreleri 30 ° C'de üç gün boyunca plakalar üzerine yayılmış ve inkübe edildi Üst panel glukoz ihtiva eden bir orta plaka gösterir, toksik polyQ-genişletme protein (103Q) ifadesi, yani uyarılan değildir. Alt panelini galaktoz içeren ortam, bir maya plakası gösterir, toksik polyQ-genişletme proteininin ifadesi yani indüklenir. Deneyde Burada gösterilen dikkat, herhangi bir spontan bastırıcı oluştu. B) assay Spotting. Maya hücrelerinin Beş beş kat seri seyreltiler ya bir toksik olmayan polyQ protein (25Q) veya bir toksik polyQ-genişletme protei barındırann (103Q) proteinleri (sol panel) veya onların ifadesi neden galaktoz tabaklarda ifade bastırmak glukoz plakalar üzerinde tespit edildi. Sonra plakalar ° C. C) BioscreenC deneyi. Ya bir toksik olmayan polyQ protein (25Q) veya bir toksik polyQ-genişletme protein (103Q) eksprese maya hücresi kültürlerinin büyümesi ile izlendi 30 az üç gün süreyle inkübe edildi BioscreenC alet. Deneysel koşullar ve BioscreenC deneylerin analizi temel Metin tarif edilmektedir.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazının toksik polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin azalması büyüme dayalı model organizma maya polyQ-toksisite ölçmek için üç tamamlayıcı deneysel yaklaşımlar özetliyor. Maya İş polyQ-genişleme proteinlerin 9,11,12 hatalı katlanması ve toksisite dahil proteinin hatalı katlanması temel hücresel ve moleküler mekanizmalar ve onun ardından gelen toksisitesi, içine derin kavrayışlar teklif etti. Burada sunulan protokolleri esas deneyler zaten polyQ toksisite 5-8,13,14 yatan genetik arttırıc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Cihaz Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 pin) </td><td> V &amp; P Bilimsel, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves ABD </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-iyi Petek plakaları </td><td> Growthcurves ABD </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

büyüme tahliller mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein hatalı katlanması, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı 1 olduğu kadar çok insan hastalığı, nörodejeneratif hastalıkların, özellikle, ile ilişkilidir. Huntington hastalığı (HD) protein Huntinğtin içinde bir poliglutamin (polyQ) bölgenin anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. PolyQ-genişletilmiş Huntinğtin proteini Aberan konformasyonu (yani misfolds) ulaşır ve hücresel toksisite 2 neden olur. En az sekiz daha nörodejeneratif hastalıklar Spinoserebellar ataksiler ve Kennedy hastalığı da dahil olmak üzere 3 polyQ-açılımları, kaynaklanır. Model organizma maya polyQ-genişleme ifade polyQ-toksisite intra-ve inter-moleküler faktörlerin etkisi ve hücre bozulmaktadır hücresel yollarının belirlenmesi de dahil olmak üzere, polyQ-toksisite hücresel ve moleküler temeli içine önemli anlayışlar kolaylaştırdı proteinler 3-8. Önemlily, maya bulundu polyQ-toksisite birçok yönü dolayısıyla polyQ-toksisite yatan temel mekanizmaların keşfi için maya modelinin önemini gösteren diğer deney sistemleri ve HD hastalardan alınan örnekleri bir ölçüde yeniden üretildi. Maya polyQ-toksisite belirlemek için doğrudan ve nispeten basit bir şekilde polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyüme kusurları ölçmektir. Bu yazının polyQ-genişleme proteinleri maya hücrelerinin büyümesini ölçerek maya polyQ-toksisite belirlemek için üç tamamlayıcı deneysel yaklaşımlar anlatılmaktadır. İlk iki deneysel yaklaşımlar plakalar üzerinde maya büyüme izlemek, üçüncü bir yaklaşım BioscreenC aracı kullanarak likit maya kültürlerinin büyümesi izler. Ayrıca, bu yazının maya polyQ modelleri işlerken meydana gelebilir deneysel zorlukların açıklanır ve veya önlemek için yardımcı olacak stratejileri ana hatlarıylaBu zorlukların en aza indirmek. Burada anlatılan protokoller tespit etmek ve genetik yollar ve polyQ-toksisite modüle küçük moleküllerin karakterize etmek için kullanılabilir. Ayrıca, açıklanan deneyler maya modelleri diğer hastalığı ile ilişkili katlanan proteinleri neden olduğu toksisite doğru analizler için şablon olarak hizmet verebilir.

Bu yazıda maya poliglutamin toksisite (polyQ)-genişletme proteinlerin değerlendirilmesi için üç tamamlayıcı protokoller açıklar<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bu protokoller kolayca maya diğer katlanan proteinleri toksisitesini izlemek için değiştirilebilir.

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Protein yanlış katlanması, başta Alzheimer hastalığı ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar olmak üzere birçok insan hastalığı ile ilişkilidir...

Bu prosedürün genel amacı, poli glutamin genişleme proteinlerine ilişkin toksisiteyi değerlendirmek ve analiz etmek için maya hücrelerini deneysel bir platform olarak kullanmaktır. Maya hücreleri, poli glutamin ekspresyonunu baskılayan koşullar altında büyütülür. Toksik bir poli glutamin genişleme proteini eksprese eden maya hücrelerinin toksisitesini güvenilir bir şekilde değerlendirmek amacıyla, ilk büyüme analizinde gösterilen üç tamamlayıcı büyüme analizi gerçekleştirilir.Burada, poliglutamin toksisitesi bir plaka deneyi aracılığıyla izlenmektedir. Tamamlayıcı bir ikinci büyüme deneyi olarak, hücre büyümesindeki çok küçük farkları bile tespit etmek için bir nokta deneyi (spotting assay) kullanılmaktadır. En kantitatif yaklaşım ise, maya hücrelerinin sıvı kültürlerde büyütüldüğü ve toksisitenin 600 nanometredeki optik yoğunluğun gözlemlenmesi yoluyla izlendiği üçüncü deneyde gösterilmiştir; bu yöntemle sonuç olarak tekrarlanabilir ve kantitatif sonuçlar elde edilebilir.Bu belge, maya hücrelerinin plakalarda ve sıvı kültürlerdeki büyümelerinin dikkatli bir şekilde incelenmesi yoluyla poli glutamin toksisitesini belgelemektedir. Bu yöntem, poli glutamin proteinleri dahil olmak üzere yanlış katlanmış proteinlerle ilişkili toksisitenin genetik ve hücresel temellerinin çözülmesi gibi, protein yanlış katlanma bozukluklarının temelindeki temel sorulara yanıt verebilir. Sistematik bir analiz, mayada toksisite oluşturmak için gerekli olan bir poli Q genişleme proteininin kesin amino asit dizisini belirlemiştir.Bu toksik poly Q genişlemiş protein, amino terminalinde bir flag etiketi, ardından Huntington proteininin orijinal dizisinden 17 amino asit, bir poly Q bölgesi ve karboksi terminalinde floresan bir proteine füzyondan oluşur; aksi takdirde toksik olan poly Q genişlemiş proteinleri eksprese eden maya hücreleri, poly Q toksisitesinin spontan baskılayıcıları nedeniyle herhangi bir büyüme kusuru göstermeyebilir ve bu durum, poly Q toksisitesini veya modifikatörlerini karakterize etmeyi amaçlayan herhangi bir deneyin başarılı sonucunu tehlikeye atabilir. Bu spontan baskılayıcıların sıkça ortaya çıkmasını önlemek için, toksisite deneylerinde taze maya hücrelerinin kullanımı da dahil olmak üzere önleyici tedbirler aldığınızdan emin olun. Mayaların uzun süreler boyunca saklanmasından kaçının ve dondurulmuş stoklardan sık sık taze maya kolonileri alın.Toksik poly Q ekspansiyon proteinlerinin ekspresyonunu ve agregasyonunu floresan mikroskobu ile düzenli olarak izleyin. Maya hücrelerini, toksik proteinlerin ekspresyonunu baskılayan besiyerinde her zaman tutun. Herhangi bir toksisite ölçümüne başlamadan önce.Son bir önleyici tedbir olarak, her deney için birden fazla bağımsız transformant kullanın. Başlangıç olarak, bu protokolde gösterilen büyüme analizleri, glikoz içeren üç mililitre seçici maya besiyeri kullanılarak poly Q ekspansiyon proteinlerinin ekspresyonunu kodlayan maya hücreleri elde eder. Tek karbon kaynağı olarak, üç bağımsız transformanttan üç kültürü inoküle edin ve kültürleri 30 degrees Celsius sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.Bu koşullar altında hücreler, glikozun baskılaması nedeniyle poly Q genişleme proteinini eksprese etmezler. Plakalar üzerindeki büyümeyi izleyerek kusurları takip edebilmek için, 600 nanometredeki optik yoğunluğu birin altında tutarak gece boyu büyütülen kültürlerin aşırı büyümesini önleyin. İlk olarak, OD 600 değeri 0,5 olan gece boyu büyütülmüş bir maya kültürünü, glikoz içeren selektif ortam ile 1:1000 oranında dilüe edin; her bir dilüe kültürden 50 µL'yi, tek karbon kaynağı olarak glikoz içeren selektif ortamlı bir plakaya eşit şekilde yayarak, her bir dilüe kültür için plaka başına yaklaşık 700 koloni elde edin.Ayrıca galaktoz içeren seçici besiyerine ekim yapın. Tek karbon kaynağı olarak, inkübasyondan sonra plakaları 30 °C'de üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Her plağın fotoğrafını çekin ve glukoz ile galaktoz plaklarındaki koloni sayılarını sayın.İdeal koşullar altında, yüksek derecede toksik bir poly Q ekspansiyon proteini eksprese eden maya hücreleri kullanıldığında, galaktoz plakasında hiç koloni olmamalı veya çok az koloni bulunmalıdır. Spotting analizi (damlatma analizi), plaka analizinden daha kantitatif bir yöntemdir ve bu nedenle poly Q toksisitesindeki çok küçük farkları bile ortaya çıkarabilir. Aynı plaka üzerinde gerçekleştirilen aynı deney kapsamında, glukoz içeren besiyerinde spotting analizlerine başlamak için, gece boyunca büyütülmüş kültürleri OD 600 değeri 0.1 olacak şekilde dilüe edin; dilüe edilmiş her kültürden 200 µL'yi steril 96 kuyucuklu plakalara pipetleyin ve çok kanallı bir pipet ve transfer aparatı kullanarak steril su ile beş adet beş katlı seri dilüsyon hazırlayın.Hücre süspansiyonlarını, tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren seçici besiyerli plakalara ekleyin. Ayrıca, plakların kurumasına izin verdikten sonra hücreleri, tek karbon kaynağı olarak galaktoz içeren seçici besiyerli plakalara aktarın ve her bir plakanın fotoğraflarını çekmeden önce 30 °C'de üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Sıvı büyüme analizi, mayalarda poly Q toksisitesini izlemek için burada açıklanan üç analiz arasında en kantitatif olanıdır.Bio screen C, tanımlanmış sıcaklıklarda ve belirlenmiş ajitasyon altında inkübe edilen 100 kuyucuklu plakalardaki maya kültürlerinin optik yoğunluğunu otomatik olarak ölçen bir cihazdır. Maya hücrelerini büyütmek ve optik yoğunluklarını ölçmek için diğer yöntemler de kullanılabilir; tek karbon kaynağı olarak glukoz içeren minimal medyada gece boyunca büyütülen maya hücrelerini çöktürmek için santrifüj işlemine başlayın. Santrifüj işleminin ardından, hücreleri üç mililitre steril su ile yıkayın.Hücreleri her yıkama arasında galaktoz içeren besiyeri kullanarak santrifüjleyip çökerterek yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Yıkanmış hücreleri 0.1 OD 600 değerine kadar seyreltin. Ardından, 100 kuyucuklu bio screen C plakasının her bir kuyucuğunu 300 µL seyreltilmiş maya kültürü ile doldurun ve plakayı cihaza yerleştirin.Easy bio screen deney programını açın. İzlenecek örnek sayısını belirleyin. Sıcaklığı 30 °C olarak ayarlayın.Deney süresini üç gün ve ölçüm aralıklarını 15 dakika olarak ayarlayın. Ayrıca, filtreyi 600 nanometre kahverengiye ve çalkalama modunu her ölçümden önce orta şiddette 15 saniyeye ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra deneye başlayın.Biyo tarama cihazı (cihaz kısmına bakınız) ve ekli yazılım, deney sırasında alınan her bir veri noktası için Excel hesap tabloları oluşturacaktır. Excel kullanılarak her örnek için büyüme eğrileri hazırlanabilir ve farklı örneklerin büyümesi karşılaştırılabilir. Burada, plaka deneyi sonuçları gösterilmektedir.Yaklaşık 700 maya hücresi plakalara yayılmış ve glukoz besiyeri içeren plakada 30 °C'de üç gün boyunca inkübe edilmiştir. Toksik poly Q ekspansiyon proteininin ekspresyonu indüklenmez. Buna karşılık, maya hücreleri galaktoz besiyerine ekildiğinde, toksik poly Q ekspansiyon proteininin ekspresyonu indüklenir.Burada gösterilen deneyde herhangi bir spontane baskılanmanın meydana gelmediğine dikkat edin. Benzer şekilde, spotting assay'de toksik Poly Q genişleme proteininin ekspresyonu galaktozda gözlemlenmekte, glukozda ise gözlemlenmemektedir. Beşinci ortamda, ya toksik olmayan bir poly Q proteini ya da toksik bir poly Q genişleme proteini taşıyan maya hücrelerinin ardışık beş katlı dilüsyonları, proteinlerin ekspresyonunu baskılayan glukoz plaklarına veya bio screen C deneyinde ekspresyonlarını indükleyen galaktoz plaklarına damlatılmıştır.Toksik olmayan bir poly Q proteini veya toksik bir poly Q ekspansiyon proteini eksprese eden maya hücre kültürlerinin büyümesi, bu videoda açıklandığı üzere bio screen C cihazı ile izlenmiştir; toksik poly Q ekspansiyon proteininin ekspresyonunun hücre büyümesi üzerindeki etkisi burada açıkça görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, mayadaki poly glutamin proteinlerinin toksisitesinin nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sıvı büyüme analizi, poly glutamin toksisitesindeki çok küçük farkları bile tespit edebildiği için üç analiz arasında en kantitatif olanıdır.Ancak, poliglutamin toksisitesinin spontan baskılanmasıyla ilgili sorunlardan kaçınmak için lütfen bunu iki plaklama analizinden en az biriyle birleştirmeyi unutmayın.

growth-assays-to-assess-polyglutamine-toxicity-in-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Bu videoda, bir test bileşiği olan astragalan'ın, poliQ aracılı nörotoksisiteden Caenorhabditis elegans'ta nöronal sağkalım üzerindeki nöroprotektif etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Test, test bileşiği tedavisini takiben nöronal sağkalımı ölçmek için ASH nöronlarında GFP'ye kaynaşmış anormal şekilde genişlemiş poliQ tekrarlarını ifade eden Caenorhabditis elegans'ı kullanır.

Solucanlarda PolyQ Aracılı Nörotoksisiteye Karşı Test Bileşiğinin Etkisini İncelemek İçin Bir Test

Maya proteinopati modelleri, hastalıkta rol oynayan proteinlerin toksisitesini ve agregasyonunu değerlendirmek için değerli araçlardır. Burada, toksisite baskılayıcılar için Hsp104 varyant kitaplıklarını taramak için yöntemler sunuyoruz. Bu protokol, mayada toksik olan herhangi bir proteinin toksisite baskılayıcıları için herhangi bir protein kütüphanesini taramak üzere uyarlanabilir.

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Bu iletişim kuralı işlevsel olarak protein bazlı miras S. cerevisiaeiçin ekran için bir yüksek-den geçerek metodoloji açıklar.

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Bu makalede bir dizilmiş plazmid kütüphaneyi kullanan mayası overexpression tarama kolaylaştırmak için bir çiftleşme tabanlı yöntem sunuyor.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae mayalarında poliglutamin toksisitesini değerlendirmek için plakalama, noktalama ve sıvı kültür büyüme testlerini kullanmayı. Bu yöntemler nörodejeneratif hastalıklarda protein katlanma bozukluklarını araştırmak için değerlidir.

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Daha fazla video keşfet