Name: Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Keşfedin, yeşil floresan protein ifade eden enfeksiyöz Maedi-visna virüsü moleküler klonunun çoğaltılması ve algılanması yöntemini. Bu teknik, viral çoğalmayı floresan mikroskopi ve akış sitometrisi ile izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İzlandalı Araştırma Fonu ve İzlanda Araştırma Fonu Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. Transfeksiyon Moleküler klon sırasıyla 12 kb ve 4.5 kb'lik iki plazmit, p8XSp5-EGFP ve p67r, içinde yer alır. 9,10 <ol><li> Iki plazmit, yani p8XSp5-EGFP 4.4 ug ve Xbal ile p67r 1.6 ug eşit molar miktarlarda kesme ve transfeksiyondan önce Arter. </li><li> Ligasyon için, 16 ° C'da gece boyunca bir 50 ul reaksiyon ile inkübe ligaz 1 Weiss birimi kullanılır. </li><li> Ligasyon tamamlandığında, ligaz inaktivasyonu için 15 dakika süreyle 65 ° C'de inkübe edilir ligasyon karışımı. Bu adım, ihmal edilebilir. </li><li> İki gün önce transfeksiyon, tohum 10 6 SCP bir T25 doku kültürü şişesi hücreleri, ve% 90 confluency bir tek tabaka antibiyotik olmadan 5 ml DMEM +% 10 kuzu serum ve 2mM glutamin iki gün boyunca hücreler büyür. Hücreler iki gün sonra% 90 confluency ulaşmış değil varsa, hücreler ek bir gün büyümeye bırakın. </li></ol> Not: Kuzu serum subs olabilirfetal bovin serumu (FBS) ile tituted. MVV bazı suşları FBS tarafından inhibe edilir beri rutin, kuzu serum kullanın; Bu MVV suşu Ancak, FBS tarafından inhibe edilmez. <ol start="5"><li> Hücrelerin transfeksiyon için hazır olduğunuzda, antibiyotikler olmadan% 1 serum (kuzu serum veya FBS) ile DMEM orta değiştirin. Bu transfeksiyon için Lipofectamin 2000 (Invitrogen) kullanılır. </li><li> 500μl Opti-MEM ortam maddesi içinde DNA seyreltilir. </li><li> 500μl Opti-MEM ortam maddesi içinde 20uL Lipofectamin 2000 seyreltilir ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) olarak bırakın. </li><li> 5 dakika inkübasyondan sonra, seyreltilmiş lipofektamin 2000 (toplam hacim = 1000 ul) ile seyreltilmiş DNA birleştirir. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edilir. </li><li> SCP hücreler ve ortam (5 mi) içeren bir şişeye T25 transfeksiyon karışımı (1 ml) ilave edilir. Hafifçe sallayarak karıştırın. </li><li> 37 ° C'de inkübe edin ve gece boyunca% 5 CO 2 (18-24 saat). </li><li> % 1 serumu, 2mM glutamin ile DMEM ile ertesi gün ortam değiştirme100 IU penisilin ve 100 IU, streptomisin. </li><li> Ters flüoresan mikroskop ile SCP hücrelerde GFP üretim izlenmesi. % 15 - Düşük transfeksiyon verimliliği genellikle 5 bu birincil hücreler ile beklenebilir. </li><li> Inkübe 37 daha fazla ° C,% 5 şişe içerisinde virüsün yayılmasını sağlamak için birkaç gün boyunca CO2. Genellikle tam enfeksiyonu için 7-14 gün sürer. </li><li> Eppendorf tüpleri içine süpernatant aliquoting tarafından virüs Harvest. Hücre enkaz kaldırmak için 5 dakika süreyle 3000 rpm'de bir mikrofuge'de yılında Spin. Yeni tüplere virüs içeren süpernatant aktarın. -80 ° C de saklayınız </li></ol> 2. Virüs titrasyonu <ol><li> Bir 96 oyuklu plaka içinde% 10 serumu, 2mM glutamin, penisilin ve 100IU/ml 100IU/ml streptomisin, kuyu başına ile desteklenmiş 100 ul DMEM ortamı içinde Seed 3x10 4 SCP hücreleri. 37 inkübe ° C,% 5 CO2. </li><li> Ertesi gün hücreler confluent ise,% 1 serum ile DMEM ortamı ile değiştirmek, 2mM glutamin, 100IU/ml penisilin ve 100IU/ml streptomisin, her bir kuyunun 100 ul. </li><li> Aşağıdaki gibi virüs inceltilir <ol><li> 2mM glutamin, 100IU/ml penisilin ve 96 yuvarlak alt veya V-alt plaka 4 x 10 kuyu için kuyu başına 100IU/ml streptomisin,% 1 serum ile 180 ul DMEM ekleyin. </li><li> Dörderli seri on kat dilüsyonları için, numunelerin iyice karışmalarını sağlamak için plaka ilk sütununda 4wells her virüs 20 ul ekleyin ve dört-kanallı pipet kullanarak, ve aşağı yukarı pipetle. Pipet uçları değiştirin ve sonraki 4 kuyu ve böylece 20 ul aktarın. Negatif kontrol için, bir virüs olmadan son kuyu bırakın. </li></ol></li><li> SCP hücreleri ve orta virüs seyreltmeleri 100 ul ekle. </li><li> 37 inkübe ° C ve% 5 CO2. GFP flöresanı ve iki hafta için sitopatik etkiler için dikkate alınmalıdır. Sitopatik etkiler yuvarlak ve normal hücrelere göre daha az şeffaf hale hücre oluşur wITH süreçleri multinükleer görünen hücreleri ve hücre ölümü ile biten, dışarı uzanan. </li><li> Reed Muench yöntemi 11 kullanarak virüs titresi (TCID50) hesaplayın. </li></ol> 3. Enfekte hücreler FACS analizi Not: virüs çoğaltma hızlı izlenmesi için enfekte hücreler flow sitometri ile incelenebilir. <ol><li> Enfekte hücreler (ca 10 5) Trypsinize, 500μl PBS PBS ve tekrar süspansiyon ile 1x yıkayın. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 500 ul% 4 paraformaldehid çözeltisi (% 2 nihai konsantrasyon) ekleyin. </li><li> 5 dakika için 3000 rpm'de bir mikrofüj Pelet hücreler. </li><li> PBS 2x5 dakika ile yıkayınız ve bir FACScan analizöründe analiz. 10,000 olaylar sayın. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: 10 7 TCID 50 / ml - Bu virüs tamamen bulaşıcı ve 10 6 titrede çoğaltılması olmalıdır. Enfekte hücrelerin floresan ve det olabilirflow sitometri ve floresans mikroskobu tarafından etkilenen. Tipik olarak, GFP akış sitometresi kullanılarak hücre kültürlerinde enfekte olmuş (Şekil 1) içinde hücrelerin% 60'ından daha fazla olarak tespit edilebilir. Aynı şekilde, floresan mikroskopisi ile analiz zaman, hücrelerin bir kısmı (Şekil 2A ve B) floresan vardır. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Enfeksiyon 7 gün sonra KV1772-EGFP virüs ile enfekte olan hücrelerin SCP FACScan analizi. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> 7 günlük inkübasyon (A) sonra KV1772-EGFP ile enfekte SCP hücrelerin Şekil 2. Faz kontrast mikroskobu. Aynı hücreler floresan mikroskobu (B) gözlemlenmiştir.

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MVV moleküler klon GFP ifade eden ev sahibi hücre etkileşimleri ve in vitro ve in vivo olarak MVV patojenitesi analiz etmek için yararlı olacaktır. Çoğaltma 7-14 gün sonra elde edilen virüs hiç şüphesiz ters transkriptaz hata nedeniyle bazı mutasyonlar sahip olmuştur. Bununla birlikte, tek bir döngü vektör olarak bu klon kullanımı için bir sınırlama yoktur. Bir klon kullanımı koyun ve keçi kaynaklı hücreler ile sınırlı olmasıdır. Bizim yapısı kullanılarak bu hücrelerden transfeksiyon verimi sadece% 5-15 v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

Çoğaltım ve yeşil floresan proteini ifade maedi-visna virüs bir enfeksiyöz moleküler clone algılama

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virüsü (MVV) yavaş ilerleyen interstisyel pnömoni ve ensefalit 1 neden, koyun lentivirüs olduğunu. In vivo olarak MVV birincil hedef hücrelerin monosit 2 olduğu kabul edilir. MVV Bazı suşları ancak 3,4, diğer hücre tiplerinde çoğaltabilirsiniz. Yeşil floresan protein canlı hücrelerde lentiviruses incelemek için yaygın olarak kullanılan bir göstergedir. Biz MVV dUTPase için geninin içine EGFP gen taktınız. DUTPase geni de çoğu lentivirüs koyun suşu ve keçi korunduğu ve CAEV 5 çoğaltma önemli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, dUTPase in vitro ve in vivo 6 hem de bu çalışmada kullanılan MVV moleküler klon çoğaltılması için vazgeçilebilir olduğu gösterilmiştir. MVV çoğaltma kesinlikle koyun veya keçi kaynaklı hücreler ile sınırlıdır. Biz transfeksiyon ve virüsün 7 yayılması için koyun koroid pleksus (SCP hücreleri) bir birincil hücre hattı kullanın &lt;/&gt; Sup. Floresan MVV tamamen bulaşıcıdır ve EGFP ifadesi en az 6 pasajlar üzerinde 8 sabittir. TCID 50 ve EGFP ölçümleri arasında iyi bir korelasyon vardır. Bu nedenle, virüs hücre tropizm ve in vitro ve in vivo 8 patojen çalışmalarda enfekte hücrelerin hızlı tespit için yararlı olacaktır.

Biz, GFP ifade eden ve tam olarak bulaşıcı olan Maedi-visna virüs bir moleküler klon tanımlamak. Bu virüs çoğaltma floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilebilir.

Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

Maedi-visna virüsü (MVV), koyunlarda yavaş ilerleyici interstisiyel pnömoni ve ensefalite yol açan bir lentivirüstür1. MVV'nin ... içindeki birincil hedef hücreleri...

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein eksprese eden Mildy vs. No virüsünün enfeksiyöz bir klonunu çoğaltmak ve tespit etmektir. Bu yeşil floresan protein, Myy Ner virüs genomundaki D utp Ace kaplama genine klonlanmıştır.Enfeksiyöz klon iki plazmitte yer almaktadır. İlk olarak, myy Ner dizilerini taşıyan iki plazmit xpa one restriksiyon enzimi ile kesilir ve ligasyonu gerçekleştirilir. İkinci olarak, koyun koroid pleksus hücreleri bu konstrükt ile transfekte edilir.Son olarak, myy vino virüsü ile enfekte olmuş hücreler floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilir. Merhaba, ben İzlanda Üniversitesi'ndeki TER Deneysel Patoloji Enstitüsü'nden Stefano Neron. Bugün size, yeşil floresan protein eksprese eden bir vasküler virüsün enfeksiyöz moleküler klonunun çoğaltılması ve tespit edilmesi prosedürünü göstereceğiz.Moleküler klon, sırasıyla 12 kilobase ve 4.5 kilobase büyüklüğündeki P eight XSP five EGFP ve P six seven or plazmitlerinde yer almaktadır. Transfeksiyondan önce, iki plazmitin ekimolar miktarları, yani 4.4 mikrogram P eight XSP five EGFP ve 1.6 mikrogram P six seven or, XPA one ile kesilmeli ve ligasyon işlemi gerçekleştirilmelidir. Ligasyon tamamlandığında, ligasyon karışımını 65 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin; transfeksiyondan iki gün önce, bir T 25 doku kültürü flakonuna 10⁶ SCP hücresi ekleyin ve hücreleri antibiyotiksiz beş mililitre DMEM artı %10 lamb serum ve iki milimolar glutamin içeren ortamda %90 konfluens düzeyinde bir monokatman oluşturana kadar iki gün boyunca büyütведите.Hücreler iki gün sonra %90 konfluense ulaşmadıysa, hücrelerin bir gün daha büyümesine izin verin. Kuzu serumu yerine fetal bovine serum FBS kullanılabilir. Bazı MVV suşları FBS tarafından inhibe edildiği için rutin olarak kuzu serumu kullanıyoruz.Ancak, bu MVV suşu FBS tarafından inhibe edilmez. Hücreler transfeksiyona hazır olduğunda, medyumu %1 serum kuzu serumu veya antibiyotiksiz FBS içeren DMEM ile değiştirin. Transfeksiyon için Lipofectamine 2000 kullanıyoruz; DNA'yı 500 microliters Opti-MEM medyumu ile seyreltin, 20 microliters Lipofectamine 2000'i 500 microliters Opti-MEM medyumu ile seyreltin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.Beş dakikalık inkübasyonun ardından, seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş lipofectamine 2000 ile toplam 1000 µL hacim olacak şekilde birleştirin. Nazikçe karıştırın ve 2-30 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımını SCP hücreleri ve besiyeri karışımı içeren T 25 flaskına nazikçe sallayarak ekleyin.İnkübatörde 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün besiyerini; %1 serum, 2 mM glutamin, 100 IU/mL penisilin ve 100 IU/mL streptomisin içeren DMEM ile değiştirin. GFP üretimini ve SCP hücrelerini ters floresan mikroskobu ile izleyin.Bu primer hücrelerde genellikle %5 ila %15 arasında düşük bir transfeksiyon verimliliği beklenir. Virüsün flask içinde yayılmasına izin vermek için 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda birkaç gün daha inkübe edin. Tam enfeksiyon genellikle 7 ila 14 gün sürer. Süpernatantı eppendorf tüplerine aktararak virüsü hasat edin.Hücre döküntülerini uzaklaştırmak için, 3000 rpm'de beş dakika boyunca mikro santrifüjde döndürün. Virüsü içeren süpernatantı yeni tüplere aktarın.-80 °C'de saklanan 3x10⁴ SCP hücresini; %10 serum, 2 mM glutamin, 100 IU/mL penisilin ve 100 IU/mL streptomisin ile desteklenmiş 100 µL DMEM ortamı içinde kuyuk başına ekleyin.96 kuyucuklu bir plakayı 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. Hücreler ertesi gün konfluen hale gelmişse, besiyerini %1 serum içeren DMEM ile değiştirin. Her kuyucukta 100 µL olacak şekilde virüsü şu şekilde dilüe edin.Dört kez tekrarlanan on katlı seri dilüsyon yapmak için, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı veya V tabanlı bir plakanın 10'lu dört set kuyucuğuna, her birine %1 serum içeren 180 µL DMEM ekleyin. Plakanın ilk sütunundaki dört kuyucuğun her birine 20 µL virüs ekleyin. Örneklerin tamamen karıştığından emin olmak için dört kanallı bir pipet kullanarak yukarı-aşağı pipetleme yapın.Pipet uçlarını değiştirin ve 20 µL'yi sonraki dört kuyucuğa ve benzer şekilde devam ederek aktarın. Negatif kontrol için son kuyucukları virüssüz bırakın. SEP hücrelerine ve ortam inkübatörüne 100 µL virüs dilüsyonu ekleyin.37 °C ve %5 karbondioksit. İki hafta boyunca GFP floresansı ve sitopatik etkiler açısından gözlemleyin. Sitopatik etkiler, hücrelerin yuvarlaklaşması ve uzantıları olan normal hücrelere göre daha az şeffaf hale gelmesiyle başlayıp, çok çekirdekli hücrelerin ortaya çıkması ve hücre ölümüyle sonuçlanır.Virüs replikasyonunun hızlı izlemi için Reid Munch yöntemini kullanarak virüs titresi hesaplayın. Enfekte hücreler, akış sitometrisi tripsin ile incelenebilir. 10⁵ civarında enfekte hücre gözlemleyin.Bir kez PBS ile yıkayın ve 500 µL PBS içinde YENİDEN SÜSPANDİREİN. %2 nihai konsantrasyon sağlayacak şekilde 500 µL %4'lük Paraformaldehit çözeltisi ekleyerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 3000 xg'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün.Beşer dakikalık iki kez PBS ile yıkayın ve bir fakt scan analizöründe analiz edin. 10.000 olayı sayın. Burada sunulan virüsümün GFP eksprese eden moleküler klonu, hem in vivo hem de in vitro olarak nörovirüsümün konak etkileşimlerini ve patojenitesini analiz etmek için faydalı olabilir.Nörovirüsümün insan hücrelerini etkileyebildiği gösterilmemiş olsa da, hem hücrelerin hem de plazmidin laboratuvarımızdan temin edilebileceği göz önüne alındığında, tüm biyogüvenlik seviyesi önlemlerine uymak önemlidir. Deneylerinizde başarılar dilerim.

propagating-detecting-an-infectious-molecular-clone-maedi-visna-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Biz Tat duyarlı LTR ek olarak, bu tür bir lentiviral vektör geliştirdik, HIV-1 Tat ve Rev-bağımlı bir moda muhabiri gen ekspresyonu düzenleyen Rev-yanıt elemanı (RRE). Vektör GFP ifadesi üzerinden canlı hücreler kopyalayan HIV özel algılama izin verir.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Burada, viral partiküllerin veya floresan mikroboncukların yenidoğan fare beynine intraserebroventriküler ve intravasküler enjeksiyonu için basit bir yöntemi açıklıyoruz. Virüs ve nanopartiküllerin lokalizasyon paterni, mikroskobik değerlendirme veya in situ hibridizasyon ile tespit edilebilir.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Bu protokol, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını in vivo olarak incelemek için gereken ikincil yaklaşımların ihtiyacının üstesinden gelmek için K18 hACE2 transgenik farelerde lusiferaz ve floresan eksprese eden rekombinant (r) SARS-CoV-2 ve bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak viral enfeksiyonların dinamiklerini açıklamaktadır.

K18 hACE2 Transgenik Farelerde Viral Enfeksiyonun Canlı Görüntülenmesi ve Raporlayıcı İfade Eden Rekombinant SARS-CoV-2 Kullanılarak Ölçülmesi

Psödotipli virüsler (PV'ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV'lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Keşfedin, yeşil floresan protein ifade eden enfeksiyöz Maedi-visna virüsü moleküler klonunun çoğaltılması ve algılanması yöntemini. Bu teknik, viral çoğalmayı floresan mikroskopi ve akış sitometrisi ile izlemeyi sağlar.

Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

Daha fazla video keşfet