Çoğaltım ve Yeşil floresan proteini ifade Maedi-visna Virüs bir Enfeksiyöz Moleküler Clone algılama

Bu prosedürün genel amacı, yeşil floresan protein eksprese eden Mildy vs. No virüsünün enfeksiyöz bir klonunu çoğaltmak ve tespit etmektir. Bu yeşil floresan protein, Myy Ner virüs genomundaki D utp Ace kaplama genine klonlanmıştır.

Enfeksiyöz klon iki plazmitte yer almaktadır. İlk olarak, myy Ner dizilerini taşıyan iki plazmit xpa one restriksiyon enzimi ile kesilir ve ligasyonu gerçekleştirilir. İkinci olarak, koyun koroid pleksus hücreleri bu konstrükt ile transfekte edilir.

Son olarak, myy vino virüsü ile enfekte olmuş hücreler floresan mikroskopisi ve akış sitometrisi ile tespit edilir. Merhaba, ben İzlanda Üniversitesi'ndeki TER Deneysel Patoloji Enstitüsü'nden Stefano Neron. Bugün size, yeşil floresan protein eksprese eden bir vasküler virüsün enfeksiyöz moleküler klonunun çoğaltılması ve tespit edilmesi prosedürünü göstereceğiz.

Moleküler klon, sırasıyla 12 kilobase ve 4.5 kilobase büyüklüğündeki P eight XSP five EGFP ve P six seven or plazmitlerinde yer almaktadır. Transfeksiyondan önce, iki plazmitin ekimolar miktarları, yani 4.4 mikrogram P eight XSP five EGFP ve 1.6 mikrogram P six seven or, XPA one ile kesilmeli ve ligasyon işlemi gerçekleştirilmelidir. Ligasyon tamamlandığında, ligasyon karışımını 65 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin; transfeksiyondan iki gün önce, bir T 25 doku kültürü flakonuna 10⁶ SCP hücresi ekleyin ve hücreleri antibiyotiksiz beş mililitre DMEM artı %10 lamb serum ve iki milimolar glutamin içeren ortamda %90 konfluens düzeyinde bir monokatman oluşturana kadar iki gün boyunca büyütведите.

Hücreler iki gün sonra %90 konfluense ulaşmadıysa, hücrelerin bir gün daha büyümesine izin verin. Kuzu serumu yerine fetal bovine serum FBS kullanılabilir. Bazı MVV suşları FBS tarafından inhibe edildiği için rutin olarak kuzu serumu kullanıyoruz.

Ancak, bu MVV suşu FBS tarafından inhibe edilmez. Hücreler transfeksiyona hazır olduğunda, medyumu %1 serum kuzu serumu veya antibiyotiksiz FBS içeren DMEM ile değiştirin. Transfeksiyon için Lipofectamine 2000 kullanıyoruz; DNA'yı 500 microliters Opti-MEM medyumu ile seyreltin, 20 microliters Lipofectamine 2000'i 500 microliters Opti-MEM medyumu ile seyreltin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Beş dakikalık inkübasyonun ardından, seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş lipofectamine 2000 ile toplam 1000 µL hacim olacak şekilde birleştirin. Nazikçe karıştırın ve 2-30 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımını SCP hücreleri ve besiyeri karışımı içeren T 25 flaskına nazikçe sallayarak ekleyin.

İnkübatörde 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün besiyerini; %1 serum, 2 mM glutamin, 100 IU/mL penisilin ve 100 IU/mL streptomisin içeren DMEM ile değiştirin. GFP üretimini ve SCP hücrelerini ters floresan mikroskobu ile izleyin.

Bu primer hücrelerde genellikle %5 ila %15 arasında düşük bir transfeksiyon verimliliği beklenir. Virüsün flask içinde yayılmasına izin vermek için 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren ortamda birkaç gün daha inkübe edin. Tam enfeksiyon genellikle 7 ila 14 gün sürer. Süpernatantı eppendorf tüplerine aktararak virüsü hasat edin.

Hücre döküntülerini uzaklaştırmak için, 3000 rpm'de beş dakika boyunca mikro santrifüjde döndürün. Virüsü içeren süpernatantı yeni tüplere aktarın.

-80 °C'de saklanan 3x10⁴ SCP hücresini; %10 serum, 2 mM glutamin, 100 IU/mL penisilin ve 100 IU/mL streptomisin ile desteklenmiş 100 µL DMEM ortamı içinde kuyuk başına ekleyin.

96 kuyucuklu bir plakayı 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. Hücreler ertesi gün konfluen hale gelmişse, besiyerini %1 serum içeren DMEM ile değiştirin. Her kuyucukta 100 µL olacak şekilde virüsü şu şekilde dilüe edin.

Dört kez tekrarlanan on katlı seri dilüsyon yapmak için, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı veya V tabanlı bir plakanın 10'lu dört set kuyucuğuna, her birine %1 serum içeren 180 µL DMEM ekleyin. Plakanın ilk sütunundaki dört kuyucuğun her birine 20 µL virüs ekleyin. Örneklerin tamamen karıştığından emin olmak için dört kanallı bir pipet kullanarak yukarı-aşağı pipetleme yapın.

Pipet uçlarını değiştirin ve 20 µL'yi sonraki dört kuyucuğa ve benzer şekilde devam ederek aktarın. Negatif kontrol için son kuyucukları virüssüz bırakın. SEP hücrelerine ve ortam inkübatörüne 100 µL virüs dilüsyonu ekleyin.

37 °C ve %5 karbondioksit. İki hafta boyunca GFP floresansı ve sitopatik etkiler açısından gözlemleyin. Sitopatik etkiler, hücrelerin yuvarlaklaşması ve uzantıları olan normal hücrelere göre daha az şeffaf hale gelmesiyle başlayıp, çok çekirdekli hücrelerin ortaya çıkması ve hücre ölümüyle sonuçlanır.

Virüs replikasyonunun hızlı izlemi için Reid Munch yöntemini kullanarak virüs titresi hesaplayın. Enfekte hücreler, akış sitometrisi tripsin ile incelenebilir. 10⁵ civarında enfekte hücre gözlemleyin.

Bir kez PBS ile yıkayın ve 500 µL PBS içinde YENİDEN SÜSPANDİREİN. %2 nihai konsantrasyon sağlayacak şekilde 500 µL %4'lük Paraformaldehit çözeltisi ekleyerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 3000 xg'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün.

Beşer dakikalık iki kez PBS ile yıkayın ve bir fakt scan analizöründe analiz edin. 10.000 olayı sayın. Burada sunulan virüsümün GFP eksprese eden moleküler klonu, hem in vivo hem de in vitro olarak nörovirüsümün konak etkileşimlerini ve patojenitesini analiz etmek için faydalı olabilir.

Nörovirüsümün insan hücrelerini etkileyebildiği gösterilmemiş olsa da, hem hücrelerin hem de plazmidin laboratuvarımızdan temin edilebileceği göz önüne alındığında, tüm biyogüvenlik seviyesi önlemlerine uymak önemlidir. Deneylerinizde başarılar dilerim.