Name: Organ Kültür bozulmamış Sığır Kuyruğu İntervertebral Disklerin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Öğrenin, sığır kuyruğundan bozulmamış intervertebral diskleri organ kültürü için hazırlama yöntemini. Jet lavaj sistemi ile temizlenen diskler, biyoreaktörde mekanik yük çalışmaları ve hücre canlılığı analizleri için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF # 310030-127586/1) tarafından desteklenmiştir.

1. İntervertebral Disk Hasat <ol><li> Tüm uzunluğu sığır kuyruğu, cilt varlığı kirlenme şansını artırır (Şekil 2), deri olmadan, mümkünse yerel bir mezbahaya elde edilir. </li><li> Büyük kesme tahtası hazırlayın ve bir kesme tahtası (Şekil 2) üstüne steril çalışma istasyonu ve aletleri hazırlamak. </li><li> 55mm sodyum sitrat içeren% 0.9 sodyum klorür ile nemlendirilmiş steril laminer akış kaputu steril gazlı bez altında hazırlanın ve 6-plaka her bir kuyunun içine koymak. </li><li> Bir havza hazırlayın ve musluk suyu ile 1:100 Betadine çözeltinin. </li><li> 5 dakika boyunca% 1'lik Betadine çözeltisi içeren bir havzada tüm sığır kuyruğu bırakın. </li><li> Kısaca kuru steril gazlı bez ile kuyruk ve steril bir iş istasyonu üzerinde yerleştirin. </li><li> # 22 neşter bıçağı ile dikkatlice kuyruk etrafındaki kas çıkarın. </li><li> Gerekli değildir kuyruk parçaları, nispeten büyük ve çok küçük içeren kuyruk genellikle iki ucunda, uzak doğrayınIVD'ler (Şekil 3). </li><li> IVD etrafında neşter bıçak kullanarak # 10 daha fazla kas ve tendonlar kesin. Disklerin dış anulus kesmek için dikkat edin. </li><li> Mark cerrahi cilt markeri IVD anterior (Bu adım isteğe bağlıdır, bizim biyoreaktör aksiyel rotasyon için merkezi belirlemenize yardımcı olur). </li><li> IVD ve vertebra bağlantı noktası kuyruk hafifçe hareket ettirerek bulun. Donuk bir neşter bıçak yüzü IVD ve kemik arasındaki sınır hissedin. Yarma site vertebra doğru IVD 1-2 mm olmalıdır. Yeri özel yarma sitesi (Şekil 4) endüstriyel bıçak tutucu. </li><li> Cleave IVD ve vertebra ısmarlama endüstriyel bıçak tutucu (Şekil 3) üstüne çekiç ile. </li><li> IVD-vertebranın bağlantısı, diğer tarafta tekrarlayın. </li><li> Wrap 55mm sodyum sitrat içeren% 0.9 sodyum klorür ile ıslatılmış steril gazlı bez ile IVD izole. </li><li> Istenen numune sayısı (genellikle 6 dolaşıp IVD'ler izolasyonu Devam10-20 mm arasında çapı ile hasat edilebilir). </li><li> Jet steril Ringer solüsyonu ile lavaj sistemi (Zimmer, inc.) Bağlayın, 5L çanta (alternatif steril PBS veya% 0.9 salin solüsyonu) kullanışlı bir boyutta. </li><li> IVD Zimmer Pulsavac jet-lavaj sistemi (Şekil 1C) kullanarak forseps ve uç plakası yüzeyinin jet-lavajı her iki tarafında tutun. Jet tabanca 30 arasında bir açıyla uç plakası yüzeyinde çekilmiş olmalıdır - 60 ° her tarafında 30s hakkında. (Şekil 1 ve 7) </li><li> Jet başka bir disk örneği yıkarken IVD'ler ile 6-plaka ve şal geri koyun gazlı bezle temizleyin. </li><li> IVD'ler organ kültür ve aşağı akım uygulamaları (örneğin, hücre canlılığı, mekanik yüklenme, organ kültürü) (Şekil 1D) için hazırız. </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı bir intervertebral disk hazırlık yargılamak için Sonuç ölçümleri difüzyon deneyi olabilir küçük bir molekül ağırlığı (örneğin procion kırmızı floresan boya)PBS 2% 1'lik bir çözüm olarak hazırlanır. IVD sonra en az 100 mL boya çözüm ve boya, daha sonra ücretsiz şişme altında 24 saat için IVD pasif diffüz izin verilir tutulur. IVD sonra, sıvı nitrojen içinde flash dondurulmuş ve oda sıcaklığı ve aseton transferlerin bir dizi (ilk -80 olarak ° C, -20 ° C, daha sonra 4 ° C ve sonunda oda sıcaklığına kadar önceden soğutulmuş susuz geri getirdi. .) Disk sonra poli-metil-akrilat (PMMA) gömülü ve 100 mikron kalınlığında kesitler üretmek için keskin bir bıçak ile kesilir. Bu bölümler daha sonra herhangi bir standart aydınlık mikroskop ama tercihen procion kırmızı kırmızı floresan yayar (Şekil 5-6) bu yana floresan mikroskopi kullanımı ile görülebilir. Kemik yüzeyi trabeculi jet lavaging adım (Şekil 7) sonra çok temiz görünür. Başarılı bir organ kültürü parametreleri, kirlenme, hücre canlılığı muhafaza tüm yokluğu (Şekil 8-9), disk yüksekliği ilk vehistolojik kesitler ve safranin O / hızlı yeşil leke veya Meyer Hematoxilin 3 ile ölçülen genel "disk bütünlüğü". Biz canlı disk dokusu leke ve başka bir konfokal lazer tarama mikroskobu ve canlı / ölü boyama kiti (Moleküler Probları, Invitrogen, Basel, İsviçre) kullanılarak 3 boyutlu hücre canlılığı tarama 4,5 yayınlanan protokolleri ve makrolar geliştirdi. Biz 3D doku veya 4-6 NIH ImageJ platformu kullanarak 3D taşıyıcılar hücre canlılığı tahmin etmek için otomatik hücre sayımı gerçekleştirmek için bir makro ve rutin daha geliştirdi. Alternatif protokolleri disk hücreleri hücre canlılığı pronase ve kollajenaz tip kullanarak ekstraselüler matriks sıralı sindirim kullanarak ilk sindirim belirlemek için 2 ve daha sonra hücre süspansiyonu 7 leke ileri sürülmüştür. Protokolün bir önceki sürümü PBS önce diskler hasat organ cu sonra 10 dakika süreyle on kat daha konsantre penisilin / streptomisin konsantrasyon içeren bir inkübasyon adım söz konusulture. Bu adımı kültür amaçları için yararlı gibi görünüyor bu yana jet lavaj adım ile bu adımı geçersiz olur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 metodolojik adımları bakış, sağlam omurun ve kemik ince bir tabaka halinde (1-2mm) ile sığır coccygeal İntervertebral Diskler hazırlamak için . A) intervertebral disk (IVD) ve besin yollar şematik görünümü. B) Usulü ile IVD bıçak tutucu, özelleştirilmiş ve endüstriyel bir keskin bıçak kesmek için. C) Jet lavaj adım yüksek hücre canlılığı sağlamak ve uç plakaları ve her iki tarafta bağlı kemik 1-2 mm tutmak besin alışverişini sağlamak için. D) Son olarak IVD biyoreaktör numune odasında kültüre olabilir veya herhangi aşağı akım bir uygulama için kullanılmalıdır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 TOP: Tam boy taze sığır kuyruğu (ideal obta2-3 saat içinde incelendiği yüksek hücre canlılığı sağlamak için post-mortem. Alt: kemik omurun (EP) ve vertebra gövdelerinin (VB) arasında büyüme plaklarının (GP), ikincil kemikleşme merkezi, varlığını gösteren yaklaşık 6 ay yaşlı bir sığır kuyruğu X-ray görüntü. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. A) Araçlar, steril koşullar altında sığır kuyruğu incelemek . B) Özelleştirilmiş bıçak tutucu, intervertebral disk kesim sırasında eylem sığır kuyruğu hareket segmentleri-out kesti. C) standart bir endüstriyel bıçak (Lutz, Almanya) ile özelleştirilmiş bıçak tutucu Yan görünümü. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Çizim ve hareket segmentleri kesip yarma siteleri gösteren çevreleyen kas ve ligaman kaldırdıktan sonra sığır kuyruğu resmi. Kısmi vertebra wi "çatlak" olmalıdırısmarlama bıçak tutucu th ideal olarak 1-2 mm uzaklıkta, kıkırdak, omurun tam kemik yüzeyi sağlamak. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 önce jet-lavaj adım etkili temizlik Gösterme (A) ve sonrası (B). Püskürtme işlemi sonrasında intervertebral disk bölümleri temiz kemik yüzeylere dikkat edin. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 büyüme plağı tarafından blokaj etkisi gösteren, 24 saat boyunca% 1 procion kırmızı çözümü sol taze hazırlanmış eksize sığır kuyruğu intervertebral diskler (IVD'ler) Serbest şişme difüzyon deneyi . Bir dijital X-ray sagital görünüm 2'den sonra hala kıkırdak ve kemik uç plakası ile coccygeal sığır intervertebral disk eksplant büyüme plağı ve sagital kesilmiş kemik floresan mikroskopi görüntü ikinci bir tabaka içeren IVD4h serbest difüzyon. GP: büyüme plağı, 2ndry CO: ikincil kemikleşme merkezi. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7, taze hazırlanmış, 24 saat% 1 procion kırmızı çözüm için sol eksize sığır kuyruğu intervertebral diskler (IVD'ler) Serbest şişme deneyi, jet lavaj tedavi temizlik etkisi gösteren. (~ 100 mm), tedavi (Sağ) jet-lavaj tedavi olmadan jet lavaj tedavisi (Sol) Kontrol tarafında yapıldı ~ 1.5-mmthick kemik uç plakaları ile eksize sığır IVD'ler sagittal kalınlığında kesitler. Giriş sprey Zimmer yara debridman sistemi kullanılan desen, 24 saat ücretsiz difüzyon deneyleri,% 1 procion kırmızı sığır intervertebral disk eksplant. Gösterir. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 konfokal Görüntüleme yığınları projeksiyonlar Live / Dead Görüntüler (250μm) bovin alınane intervertebral disk bölümleri düzeyde ayırır Nükleus pulpozusun (NP), iç anulus fibrosus (IA) ve dış anulus fibrosus (OA) için sırasıyla 0 ve 14 gün için serbest şişme altında tutulması bu jet-lavaj yöntemi ile hazırlanmıştır. Ethidium homodimer-1 tarafından boyanmış = Calcein AM (asetil metilester) ile boyanan canlı hücreler, kırmızı hücrelerin ölü hücreleri çekirdeği Yeşil hücreleri. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 9"> Şekil 9, canlı doku ve 3D yığın tarama konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak intervertebral disk hücre Canlılık . Hücre canlılığı düzeyde ayırır Nükleus pulpozusun (NP) ve annulus Fibrozis (AF), serbest-şişme koşul altında 21-gün-kültür üzerinde. (Ortalama ± SEM, N = 6) İstatistiksel farklılıklar non-parametrik Kruskal-Wallis rank sum testi gruplar arasında imzalanan kullanılarak test edildi. Gün 21 ve NP diğer tüm zaman noktaları arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. AF önemli farklılıklar gün 7 arasında iken,gün 0. (* P &lt;0.05, ** p &lt;0.01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Başarılı organ kültürü için ilk adım eksplant kontamine olmaması gerektiğini emin olun. Prosedüre başlamadan önce kuyruk tenli olmalıdır. Herhangi bir hayvan kılı steril bir laboratuvar haline getirdiği kirlenme açısından sorunlu olabilir. Sığır kuyruğu ideal (bu ilk hücre canlılığı etkiler) mümkün olduğunca taze olmalıdır. Ayrıca, betadin yıkama adım daha kontaminasyon riskini azaltmak için önerilmektedir. IVD vertebra gövdesi ayrı bir ölçüye göre bıçak tutucu ve bir çekiç kullanarak yerine, bu histolojik bir testere (...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td colspan="4"> Yerel mezbahasında (ideal saat sonra otopsi içinde ve cilt) Taze sığır sığır kuyrukları intervertebral disk dokusu,. </td></tr><tr><td> Pulsavac Ayrıca AC Sistemi </td><td> Zimmer inc, İsviçre </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Hip-sprey başlığı ile ve AC güç kaynağı ile en iyi performans (8 adet AA pil ile çalışır ancak daha az uygundur.) </td></tr><tr><td> Yüksek Kapasiteli Fan Sprey w / Splash Kalkan, 12.7cm uzunluk </td><td> Zimmer inc, İsviçre </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Çeşitli sprey başları vardır, başarılı bir test </td></tr><tr><td> Neşter bıçaklar # 22 # 10 </td><td> Swann-Mortİngiltere, </td><td> # 10: 0201 # 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Neşter bıçak tutucu # 3 ve # 4 </td><td> Hausmann, Almanya </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz endüstriyel bıçak </td><td> Lutz, Almanya </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Invitrogen, İsviçre </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) </td><td> Gibco, İsviçre </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer solüsyonu (glikoz) </td><td> Bichsel, İsviçre </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6-çok-plaka </td><td> DYP, İsviçre </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine çözüm </td><td> Mundipharma, İsviçre </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Cerrahi cilt markeri </td><td> Porex Cerrahi, İsviçre </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük kesme tahtası </td><td></td><td></td><td> Herhangi bir marka mümkündür </td></tr></tbody></table>

organ kültür bozulmamış sığır kuyruğu İntervertebral disklerin hazırlanması

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Intervertebral disk (IVD) vertebra vertebra için bağlayan omurga ortak. Bu, omurga yükleme aktarmak ve omurga esnekliği sağlamak için fonksiyonlar. Üç bölmeden oluşur: anulus fibrosus (AF) ve her iki tarafta vertebral gövde NP ve AF bağlayan iki kıkırdak omurun kapsayan içteki düzeyde ayırır Nükleus pulpozusun (NP). Muhtemelen dejeneratif intervertebral disk hastalığı (DDH) ve disk hernileri nedeniyle Diskojenik ağrısı, modern toplumda önemli bir sorun olarak tespit edilmiştir. IVD yozlaşma olası mekanizmaları incelemek için, canlı disk hücreleri ile yapılan in vitro organ kültürü sistemleri son derece çekici. Sağlam sığır coccygeal IVD&#39;ler in vitro kültürü, iyi kontrollü fizyolojik ve mekanik ortamda mekanik-biyolojik yönlerini çalışma sağlayan ilgili bir model sistem, ilerlemiştir . Sığır kuyruğu IVD&#39;ler yüksek sayıda nispeten kolay elde edilebilird insan lomber IVD&#39;ler hücre yoğunluğu, hücre popülasyonu ve boyutları bakımından çok benzer. Ancak, beslenme yollarının açıkça pıhtılaşmış kan tarafından bloke edildi yana, kıkırdak omurun ve kemik omurun istinat önceki sığır kaudal IVD hasat teknikleri, kültür 1-2 gün sonra başarısız oldu. IVD&#39;ler büyük avasküler organları, böylece NP hücrelere besin, sadece komşu vertebral gövde kılcal tomurcukları aracılığıyla difüzyon bağımlı. Son plağın yüzeylerde kemik enkaz ve pıhtılaşmış kan varlığı, disk ve uzlaşma hücre canlılığı merkezi haline besin difüzyon engel teşkil edebilir. Grubumuz için düşük kontaminasyon riski ile kuyruk IVD&#39;ler &quot;crack&quot; için görece hızlı bir protokoldür kurdu. Biz taze kesilmiş, kan pıhtılaşması ve kesim artıkları kaldırır ve son derece verimli beslenme difüzyon yolu yeniden açar bir cerrahi jet lavaj sistemi kullanarak kemik uç plakası yüzeyler permeabilize mümkünIVD merkezinde. Her iki tarafta vertebral kemik büyüme plaklarının varlığı kaçınılması gereken ve kültürüne önce kaldırılmalıdır. Bu video, hazırlanması sırasında çok önemli adımlar anahat ve yüksek hücre canlılığı sürdürmek için 14 gün ücretsiz şişme kültürün etkisi altında başarılı bir organ kültürü anahtarı göstermek. Uygun mekanik çevre mekanik yüklenme biyoreaktör kullanılarak korunabilir kültürü süresi uzatılabilir. Burada gösterilen tekniği, domuz, koyun ve tavşangillere kaudal ve lomber IVD izolasyon gibi diğer hayvan türlerinin uzatılabilir.

Bu protokol, organ kültürü için coccygeal sığır intervertebral diskler için hasat tekniği göstermektedir.<em&gt; In vitro</em&gt; Organ kültürü.

Organ Kültür bozulmamış Sığır Kuyruğu İntervertebral Disklerin Hazırlanması

İntervertebral disk (IVD), omurgada omuru omura bağlayan eklemdir. Omurganın yüklemesini iletme ve ... sağlamak üzere işlev görür.

Bu prosedürün genel amacı, kültür ve diğer alt uygulamalar için sığır kuyruğundan bozulmamış intervertebral diskler hazırlamaktır; bizim durumumuzda, karmaşık mekanik yükleme kullanan bir biyoreaktörde kültür için intervertebral diskler hazırlamak hedeflenmektedir. Bu işlem, önce buzağı kuyruğunun dezenfekte edilmesi ve ardından kemik ve disk yapılarının net bir şekilde görülmesini sağlamak için kasların temizlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, özel kesme aleti kullanılarak, her iki yanda iki ila üç milimetrelik kısmi vertebra ilişiği korunacak şekilde tek bir intervertebral disk kesilir.Üçüncü adım, glikoz gibi küçük çözeltilerin intervertebral diskin merkezine difüzyonunu sağlamak amacıyla jet lavaj sistemi ile intervertebral diskin kemikli yüzeylerinin temizlenmesidir. Son adım ise, sonraki uygulamalar için nemli tutmak amacıyla intervertebral diskin stabilize edici bir tampon çözeltiye yerleştirilmesi veya steril gazlı beze sarılmasıdır. Nihayetinde, prosedürün başarısı, intervertebral disk kültürünün başlatılmasından 14 veya 21 gün sonra canlı hücrelerin varlığını kontrol etmek için canlı-ölü boyaması kullanılarak değerlendirilir.Aşağıdaki protokol, mekanobiyoloji ve doku mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilecek organ kültürü için tersine çevrilebilir disk segmentlerinin nasıl korunacağını göstermektedir. Sığır kuyruk diskinin doku mühendisliğinde bir çeşit model sistem haline gelmesinin haklı bir nedeni vardır. İlk olarak, hücre yoğunluğu insan intervertebral diskindeki gibi çok benzer ve oldukça düşüktür.İkinci olarak, buradaki hücre popülasyonunda kordal hücrelerin yokluğu söz konusudur ki bu durum insanlardaki duruma oldukça benzerdir. Üçüncü olarak, boyut ve biyokimyasal bileşim de insanlardaki duruma çok benzerdir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan bireyler zorluk yaşayacaktır çünkü kemikli uç plağı vertebra kemiğinden ayırt etmek zordur ve bu nedenle kıkırdak büyüme plağının varlığından emin olmak güç olacaktır.Bu yönteme dair ilk fikrimiz, bireysel kültür için uç plakalı tersine çevrilebilir diski izole etmek amacıyla hızlı ve steril bir teknik ararken ortaya çıktı. Bu yöntemlerin görsel olarak gösterilmesi önemlidir çünkü kesme bölgesi kemikli plakadan sadece bir milimetre uzaklıkta yer aldığından, burayı belirlemek zordur. İlk olarak, yerel bir mezbahadan bütün bir sığır kuyruğu temin edin.İdeal olarak, kuyruk ölümden sonra dört saatten fazla bekletilmemeli ve deri çıkarılmış halde temin edilmelidir. Derinin varlığı kontaminasyon olasılığını artırdığından, diseksiyon sürecinde kullanılacak tüm aletlerin steril olduğundan emin olun. Ayrıca, çalışma yüzeyine otoklavlanmış bir kesme tahtası yerleştirerek steril bir çalışma alanı oluşturun.Ardından, steril bir laminer akışlı kabinde çalışırken, steril bir gazlı bezi 55 milimolar sodyum sitrat içeren %0.9'luk steril sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin. Islatılmış gazlı bezden bir parçayı altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğun içine yerleştirin. Daha sonra, temiz bir kabı musluk suyu ile seyreltilmiş 1:100 Betadine çözeltisi ile doldurun ve kuyruğu beş dakika boyunca çözeltinin içinde bekletin.Islatma işleminden sonra kuyruğu çıkarın. Steril gazlı bezle kısa süreliğine kurulayın ve steril çalışma istasyonuna yerleştirin. İlk olarak, kuyruk çevresindeki kasları temizlemek için 20 veya 22 numara bistüri kullanın. Ardından, genellikle nispeten büyük ve çok küçük intervertebral diskler içeren proksimal ve distal uçlardan başlayarak kuyruğun istenmeyen kısımlarını kesmek için bir giyotin kullanın.Ardından, intervertebral disklerin etrafındaki kas ve tendonları temizlemek için 10 numara bistüri kullanın. Gerektiğinde, disklerin dış anulusunu kesmemeye dikkat edin. Yönlendirme amacıyla, intervertebral diskin anterior kısmını cerrahi deri markörü ile işaretleyin.Ardından, intervertebral diski ve vertebral bağlantı noktasını belirlemek için kuyruğu nazikçe hareket ettirin. İntervertebral disk ile kemik arasındaki sınırı belirginleştirmek için bir skalpel bıçağının küt tarafını kullanın. Daha sonra, intervertebral diskten vertebraya doğru bir ila iki milimetre uzaklıkta olması gereken ayırma noktasını belirleyin.Özel yapım endüstriyel bıçak tutucuyu kesim alanına yerleştirin. Bu diyagram kesim alanını çok net bir şekilde göstermektedir. Özel yapım endüstriyel bıçak tutucunun üzerine çekiçle vurarak intervertebral diski ve vertebraları kesin. Ardından bıçak tutucuyu, intervertebral disk-vertebra bağlantısının diğer tarafına taşıyın ve intervertebral diski serbest bırakmak için intervertebral disk-vertebra bağlantısının bu tarafına çekiçle vurun.Ardından, 55 milimolar sodyum sitrat içeren %0.9 sodyum klorür ile nemlendirilmiş steril gazlı bez kullanarak intervertebral diski hızla izole edin. İstenilen sayıda intervertebral disk elde etmek için işlemi tekrarlayın. Genellikle tek bir kuyruktan 10 ila 20 milimetre çapında yaklaşık altı disk elde edilebilir.Tüm ters çevrilebilir diskler toplandıktan sonra, jet yıkama sistemini üç litrelik steril laktatlı ringer çözeltisi, steril PBS veya %0,9 steril salin torbasına bağlayın. Ardından, bir ters çevrilebilir diski pensle tutun ve jet yıkama ucunu uç plak yüzeyine 30 ila 60 derecelik bir açıyla tutarak, uç plak yüzeyinin her iki tarafını 30'ar saniye boyunca jetle yıkayın; bu görüntü jet yıkamanın temizleme etkisini göstermektedir. Disklerin üst sırası temizleme öncesindeki ters çevrilebilir diskleri, alt sıra ise aynı disklerin temizleme sonrasındaki halini göstermektedir.İlk intervertebral disk yıkandıktan sonra, diğer intervertebral diskler yıkanırken onu nemli bir gazlı beze sarın. Yıkama işleminin ardından intervertebral diskler organ kültürü için hazır hale gelir. Ayrıca, laminer akışlı kabin içerisinde çalışırken, intervertebral disk hazırlığının başarısını belirlemek için bir difüzyon deneyi gerçekleştirilebilir.Disk başına %5 fetal calf serum içeren 40 mililitre steril DMEM kültür medyumu hazırlayın. Medyumu bir behere aktarın ve ardından tek bir intervertebral diski medyumun içine batırın. Beheri, 37 °C ve %5 karbondioksit değerine ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründeki çalkalama platformuna yerleştirin.İntervertebral diskler bu şekilde yaklaşık 14 gün boyunca kültüre edilebilir. Özel yapım numune odacıklarının kullanımı, kültür süresinin uzatılmasına olanak tanıyan uygun bir mekanik yükün korunmasını sağlar. İlk olarak, daha önce yapıldığı gibi disk başına %5 fetal calf serum içeren 40 mililitre steril DMEM kültür medyumu hazırlayın.Ardından, ters çevrilebilir diski özel yapım kültür odacıklarından birinin içine yerleştirin ve 40 milliliters taze hazırlanmış besiyeri ekleyin. Odacığı laminar akış kabininde kapatın. Özel yapım numune odacığını bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.Disklerin yüzey alanına göre hazneye ağırlık ekleyin. İlk olarak, her bir intervertebral disk için PBS içinde proso red gibi floresan bir boyanın %1'lik çözeltisinden 100 mililitre hazırlayın. Ardından diski çözeltiye daldırın ve aynı koşullar altında gece boyunca inkübe edin.İnkübasyon sonrası serbest şişirme kültürü için, diski sıvı azot içinde şok dondurun ve ardından -80 °C aseton içerisine daldırın. Daha sonra intervertebral disk; -20 °C, 4 °C ve son olarak oda sıcaklığındaki asetonda 24 saatlik inkübasyonlarla yavaşça oda sıcaklığına geri getirilir. Disk oda sıcaklığına döndürüldükten sonra, standart prosedürlere uygun olarak bir ila iki hafta boyunca tamamen polimetil metakrilata gömülür.Tamamen gömüldükten sonra disk, keskin bir bıçakla kesilerek ve bir taşlama makinesiyle cilalanarak işlenir. İşlem tamamlandığında, pro cy red'in disk boyunca difüzyonu mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu görüntüler, bir serbest şişme difüzyon deneyinin sonuçlarını göstermektedir.Panel C, yöntemimizle hazırlanmış iki kemikli uç plakasına sahip tersine çevrilebilir bir diskin röntgen genel görünümünü göstermektedir. Üst tarafta, büyüme plağı çıkarılmadan floresan mikroskobu altında görüntülenmiştir. Kırmızı floresan boyanın difüzyonunun, gp olarak etiketlenen büyüme plağının varlığı tarafından engellendiği ve böylece büyüme plağının kıkırdak uç plakanın derin katmanlarının ve tersine çevrilebilir diskin boyanması için bir bariyer görevi gördüğü görülebilir.Büyüme plağı, co olarak işaretlenen primer ve sekonder ossifikasyon merkezleri arasında yer alır. Büyüme plağı başarıyla uzaklaştırılmışsa, kırmızı floresan boya np olarak işaretlenen nucleus pulposus'a engelsiz bir şekilde difüze olabilir. Bu görüntüler, jet lavaj tedavisinin temizleme etkisini göstermektedir.Sagital kesitler yaklaşık 100 mikron kalınlığındadır ve kemikli uç plaklar yaklaşık 1,5 milimetre kalınlığındadır. Burada, intervertebral disk jet lavaj tedavisine tabi tutulmuştur ve boyanın uç plaka boyunca difüzyonu görülebilmektedir. Ancak, jet lavaj tedavisinin uygulanmadığı kontrol tarafında boya iyi difüze olmamaktadır.Burada, bu jet lavaj yöntemiyle hazırlanan ve serbest şişme koşullarında tutulan sığır invertibıl disk segmentlerinden alınan canlı-ölü konfokal mikroskop görüntülerini görüyoruz; nucleus pole processis np, iç annulus fibrosus IA ve dış annulus fibrosus oa olarak etiketlenmiştir. Yeşil bölgeler kalsiyum asetil metil ester ile boyanmış canlı hücreleri, kırmızı alanlar ise etidyum homodimer-1 ile boyanmış ölü hücrelerin çekirdeklerini göstermektedir. Aynı bölgelerden alınan görüntüler, serbest şişme koşullarının 14. gününden sonra, yeşil floresans ile belirtilen yüksek sayıda canlı hücrenin kaldığını kanıtlamaktadır.Bu grafik, intervertebral disklerin nucleus pulposus ve annulus fibrosis bölgelerinin 21 günlük kültür süresi boyunca hücre canlılığını, altı örnek için ortalama sonuçlar artı veya eksi standart hata ile göstermektedir. Görüldüğü üzere, gruplar arasındaki istatistiksel farklar non-parametrik Wilcoxon işaretli sıralama toplamı testleri kullanılarak test edilmiştir.Nucleus pulposus'ta 21. gün ile diğer tüm zaman noktaları arasında anlamlı farklar bulunurken, annulus fibrosus'ta 7. gün ile 0. gün arasında anlamlı farklar saptanmıştır. Bu prosedürün ardından, mekanik yükleme, besleyici veya büyüme faktörlerinin bu dejenerasyonun veya rejenerasyonun ilerlemesi üzerindeki etkileri gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla bu kültürel koşullar modifiye edilebilir. Protokolümüz, doku mühendisliği yaklaşımları, fizyolojik ölçümler veya mekanobiyoloji çalışmaları için yorumlanabilir disk segmentlerinin elde edilmesini sağlayan hasat tekniğini hızlandırmaktadır. Geleneksel yöntemlerde kullanılan histolojik yöntemler, şerit testere veya taşıma teknikleri, protokolümüzden yaklaşık iki saat daha uzun sürmektedir.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde...

Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür

Bu video, ex vivo koşullarda primer insan plasental villöz ve yaprak döken organ kültürlerinin oluşumunu göstermektedir. Bu modeller, insan maternal-fetal arayüzünde patogenezi incelemek için çok uygundur.

İnsan Maternal-Fetal Arayüzünün Ex Vivo Modelleri Olarak Villöz ve Desidual Organ Kültürlerinin Kurulması

Bu video, enfeksiyon yayılımını incelemek için plasental dokularda bir enfeksiyon modeli oluşturma yöntemini göstermektedir. Bir ex vivo plasental organ kültürü, fakültatif bir hücre içi parazit olan Listeria monocytogenes ile enfekte olur. Bakteriler, plasenta dokusuna girmek için ekstravillöz trofoblastları (EVT'ler) istila eder ve daha sonra hücreden hücreye yayılma yoluyla diğer hücrelere yayılır.

Ex Vivo Organ Kültüründe Bakteriyel Enfeksiyon Modeli Oluşturma Tekniği

Bu video, üç boyutlu bir organ kültürü modeli geliştirmek için biyoreaktörlerde sığır intervertebral disklerinin kültürlenmesine yönelik bir tekniği göstermektedir. Erken evre intervertebral disk hastalığı sırasında gözlenen proinflamatuar ve dejeneratif mikro çevreyi taklit ederek disklere spesifik besininden yoksun ortam ve dejeneratif basınç koşulları uygulanır. Disk yükseklikleri, besin yoksunluğu ve dejeneratif yüklemenin etkilerini analiz etmek için tedavi sonrası ölçülür.

Erken İntervertebral Disk Hastalığını Simüle Etmek için Bir Proinflamatuar Organ Kültürü Modeli Oluşturma

Bu video, TNF-α kullanılarak erken evre intervertebral disk (IVD) hastalığı için bir proinflamatuar ve dejeneratif organ kültürü modelinin geliştirilmesini göstermektedir. TNF-α'in intervertebral diske enjekte edilmesi prosedürünü ana hatlarıyla belirtir ve TNF-α'nin IVD'nin iltihaplanmasını ve bozulmasını indüklediği mekanizmaları açıklar.

Erken evre intervertebral disk hastalığını simüle etmek için bir organ kültürü modeli oluşturma

intervertebral disk (IVD) Whole organ kültür doğal hücre-dışı matrisi, hücre fenotipleri ve hücresel-matriks ilişkilerini kontrol korur. Burada fare bel ve bunların fonksiyonel spinal birimlerinde kaudal IVD'ler ve bu sistemi kullanan birçok uygulamaları kullanarak bir IVD kültür sistemi açıklanmaktadır.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Bu protokol, erken evre intervertebral disk dejenerasyonunu simüle etmek için proinflamatuar, dejeneratif sığır organ kültürünün yeni bir deneysel modelini sunar.

Erken Evre Intervertebral Disk Hastalığını Simüle Etmek için Proinflamatuar, Dejeneratif Organ Kültürü Modeli.

Intervertebral diskin anulus fibrozusunda optik kesit yöntemi kullanarak mekansal kondrosit organizasyonunu araştırmak için bir yöntem sunuyoruz.

Embriyonik Gelişimden Dejenerasyona Kadar Intervertebral Diskin Optik Kesitlenmesi ve Görselleştirilmesi

Bu çalışma, biyomimetik yapay intervertebral diskin (BioAID) implantasyonu için yeni bir cerrahi teknik sunmaktadır. Yöntem, bir keçi modeli kullanarak servikal omurga fonksiyonunu yeniden sağlamayı amaçlayan hassas yerleştirme ve stabilite sağlar. Bu teknik, servikal omurga miyelopatisinden muzdarip hem insan hem de köpek hastalarında klinik uygulama için umut vaat etmektedir.

Bir keçi hayvanı modeline biyomimetik yapay intervertebral diskin implantasyonu için cerrahi teknik

Bu video, hücre kültürü için uygun, uyumlu, ekstrasellüler matriks (ECM) kaplanmamış maddeler imal etmek için kullanılan deneysel teknikler göstermek ve çekiş gücü mikroskopi için uygun ve hücre davranışı üzerindeki etkilerinin gözlenmesi ECM sertlik.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Öğrenin, sığır kuyruğundan bozulmamış intervertebral diskleri organ kültürü için hazırlama yöntemini. Jet lavaj sistemi ile temizlenen diskler, biyoreaktörde mekanik yük çalışmaları ve hücre canlılığı analizleri için uygundur.

Organ Kültür bozulmamış Sığır Kuyruğu İntervertebral Disklerin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet