Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, tek moleküllü biyofiziksel çalışmalar için drosophila embriyolarından aktif tam uzunlukta kinesini izole etmektir. İşlemin ilk adımı embriyoların toplanması ve bunların çamaşır suyu ile kaplanmasıdır. Daha sonra, kaplanmış embriyolar homojenize edilir ve lizatlar arıtılır.

Daha sonra mikrotübüller arıtılmış embriyoda polimerize edilir, lizat ve kinesin mikrotübüllere stabil bir şekilde bağlanır. Son olarak, kinesin mikrotübül kompleksi çökeltilir ve kinesin mikrotübüllerden salınır. Sonuç olarak, kinesinin mikrotübüller boyunca yürüme yeteneği, bir optik tuzak kullanılarak tek moleküllü bir boncuk tahlilinde değerlendirilebilir.

Bu protokol, drosophila kinesin'i saflaştırmak için bi Saxton tarafından geliştirilen bir protokolün bir modifikasyonudur. Ve birçok yeni başlayan biyofizikçinin karşılaştığı zorluklardan biri de fonksiyonel proteine duyulan ihtiyaçtır. Fizikçiler genellikle protein yapma konusunda eğitimli değildirler, bu yüzden bu protokolü, biyofizikçilerin kolay bir kinesin kaynağına sahip olmaları için proteini nasıl saflaştırabileceğinizi açık ve kolay bir şekilde denemek ve kolaylaştırmak için geliştiriyoruz.

Kinesin ilginç çünkü mekanik bir enzim, yani sadece bir protein değil, aynı zamanda yürüyor ve kuvvet uyguluyor, ve çok küçük bir nano makine veya moleküler motor, ve nasıl çalıştığını anlamak istiyoruz ve bu protokol insanların onu daha iyi anlamasını mümkün kılacak. Genel olarak, bu konuda yeni olan bireyler bu saflaştırma protokolü için yeterli embriyo elde etmek için mücadele edeceklerdir. Bu, yaklaşık 10 gram embriyodan 58 yumurtlama kabı elde etmek için sinekleri dikkatli bir şekilde koruyarak başarılabilir, bu protokolün sonunda yaklaşık 200 mikrogram kinesin elde edeceğiz.

Sinekler iyi yumurtlamıyorsa, üç set toplama plakası, gece boyunca tabak toplayabilir ve dört derecede saklayabilirsiniz. Alternatif olarak, en fazla bir ay boyunca her lysates'i, her gecelik toplama mağazasını eksi 80'de gerçekleştirebilir ve daha fazla devam edebilirsiniz. Yeterli BR sekizine sahip olduğunuz anda protokole devam edin.

Sinekler en iyi iki ila günlük, iki ila 10 günlük arasında yanar ve 15 gün sonra geciktirme yeteneği azalır. Sinek kapları hazırlamak için, 100 mililitrelik üç boynuzlu at beherlerinin yanlarında ana hatlar yapmak için bir işaretleyici kullanarak başlayın, ısıtılmış bir bıçak kullanarak, delikler açın. Delikleri naylon ağ ile kapatmak için yapışkan goril bandı kullanın.

Yaklaşık 50 şişe sineği maksimum kapasiteye yükselttikten sonra, yükseltilmiş sinekleri, şişe yüksekliğinin bir inçine ulaşana kadar boş bir plastik şişeye çevirin. Sinekleri sinek kaplarına aktarın, sineklerin kaçmasını önlemek için bardakları sürekli olarak bir yüzeye vurun. Her kabı bir maya macunu içeren bir agar plakası ile örtün ve sinekleri 25 santigrat derecede 24 ila 48 saat inkübe edin.

Stabilize etmek için, gece boyunca agar plakalarını 50 bardaktan toplayın ve temiz bir boya fırçası ve akan su kullanın. Plakaların içindekileri bir elek tutucuya yıkayın. Tüm maya macunu yıkanana kadar embriyoları bol su ile yıkayın.

Kaplamanın ardından embriyoları üç dakika boyunca %50 çamaşır suyuna batırın. Daha sonra embriyoları çamaşır suyu kokusunu kaybedene kadar yoğun bir şekilde durulamak için damıtılmış su kullanın. Kafesi embriyolarla birlikte katlanmış bir kağıt havluya tekrar tekrar yerleştirerek kurulayın.

Embriyoları temiz bir tartı kabına aktarın ve ağırlığı kaydedin. Embriyoları önce 1.5 hacim buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu olan bir dans homojenizatörüne yerleştirerek homojenize edin. Bir havaneli ile beş vuruş yapın, ardından homojenatı temiz santrifüj tüplerine ayırın.

Homojenatı 15.000 G'de dört santigrat derecede 40 dakika santrifüjleyin. Berrak süpernatan sıvıyı, üst beyaz lipit tabakası veya alt pelet olmadan dikkatlice toplayın. Temiz santrifüj tüplerine aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 50.000 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı hemen kullanın veya çekin, dondurun ve kinaz ve bağlanma testine başlamak için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dondurulursa, bir mililitre süpernatanı bir mikrolitre 0.3 molar GTP ve iki mikrolitre 10 milimolar Taxol ile birleştirerek yüksek hızlı süpernatanı oda sıcaklığında polimerize mikrotübüllere çözerek başlayın. Dönen bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 20 dakika hafifçe çalkalayın.

Daha sonra, hidrolize edilmemiş A TP analogu A-M-P-P-N-P'den 2.5 milimolar ekleyerek kinesini mikrotübüllere bağlayın ve dönen bir çalkalayıcı tortusunda 10 dakika boyunca çalkalanmış oda sıcaklığında, kinesin içindeki mikrotübüller, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 23.000 G'de santrifüj sapması ile eşit hacimli bir sükroz yastığı aracılığıyla. Peletleri 10 mikromolar Taxol ve 75 milimolar sodyum klorür içeren ekstraksiyon tamponu ile yıkayın. Sedimantasyonu başka bir eşit hacimli sükroz yastık resüsü ile tekrarlayın.

Peletleri, 20 mikromolar Taxol 75 milimolar sodyum klorür, 10 milimolar magnezyum sülfat ve 10 milimolar A TP içeren %5'lik ekstraksiyon tamponunda tuz yıkamasından askıya alın. Numuneyi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 120.000 G'de çökeltin. Daha sonra süpernat ihlali içeren kinesin toplayın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 14.000 G'de santrifüjlü filtrasyon yapın.

Konsantre numuneyi geri kazanın ve yeni bir filtre kullanarak filtrelemeyi 30 dakika boyunca tekrarlayın. Konsantre numuneyi toplayın ve protein konsantrasyonunu belirlemek için tahlil edin ve sıvı nitrojen içinde dondurun. Ardından eksi 80 santigrat derece saklayın.

Bu şekil, bir kinaz sırasında toplanan fraksiyonların gümüş lekeli bir jelini göstermektedir ve saflaştırma şeritleri bir ve ikinci, sırasıyla yüksek hızlı süpernatant ve pelettir. Açıklığa kavuşturulduktan sonra, şeridin üç ila altısı, birinci ve ikinci sükroz yastıklarından sonra sırasıyla süpernatanları ve peletleri temsil eder. Blaine yedi, son sedimantasyondan sonraki pelettir.

Lane'in sekizi ve dokuzu, saflaştırılmış ve son filtrelenmiş kinaz ve 115 kilodalton kinaz ve ağır zinciri gösteren örneklerdir. Burada gösterilenlerden biri, kinaz kinesin ağır zincir antikoru kullanılarak tespit edilen saflaştırılmış kinaz fraksiyonunun batı lekesidir. Antikor, A-K-I-N-O bir A, diğer kinesin ailesi üyeleriyle önemli ölçüde çapraz reaksiyona girmez.

Kinesin prosesifi, yazılı protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan bir in vitro tek moleküllü mikrotübül bağlama testi ile değerlendirildi. Bu film, mikrotübüller boyunca yürüyen tek bir kinesin motorlu 500 nanometre çapında bir boncuğu göstermektedir. Video ekranının uzunluğu 20 mikronu temsil eder.

Bu şekil, tek tam uzunlukta saflaştırılmış drosophila kinesin molekülleri için çalışma uzunluklarının ölçülen dağılımını temsil eder. Dağılıma üstel uyum, filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler için sırasıyla 1.55 artı veya eksi 0.1 mikron ve 1.28 artı veya eksi 0.12 mikron olarak tek kinesinin ortalama çalışma uzunluğunu sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokol yedi saat içinde tamamlanabilir.

Embriyo yıkama adımından başlayarak, en önemli son adım, saflaştırılmış sentin işlevselliğini laboratuvarımızda teyit etmektir. Bu, bir optik tuzak sistemi içeren tek moleküllü bir B testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tek molekül deneylerinde, genellikle saflaştırılmış kinon'un motor hareket mesafesi, hız ve kuvvet üretimi gibi biyofiziksel özelliklerini ölçtük.

Bu ölçülen parametre değerleri, kinon'un işlevselliğine dair doğrudan kanıt sağlayabilir. Bu protokolü gördükten sonra, drosophila kinesin'i drosophila embriyolarından alınan hafif zincirlerle tam uzunlukta nasıl saflaştıracağınız konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız ve bu, kinesin üzerinde çalışabilmeniz için çok yararlı bir süreç olmalıdır. Kinesin bir motor proteindir ve başarısızlığı çok fazla nörodejenerasyonda rol oynar ve bu nedenle birçok mekanik çalışma, hastalık ve motor fonksiyon arasındaki mekanik bağlantı arasındaki bağlantıyı anlamamıza yardımcı olmalıdır.