Name: Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Öğrenin kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyallerini konfokal mikroskopi ile izole etme yöntemini. Bu teknik, farklı sürelerdeki kalsiyum akışlarını analiz ederek hücre sinyalleşmesini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Sağlık hibe 2R01 GM53132 ve P50 GM071558 Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.

1. Kalsiyum göstergeleri ile yükleme hücrelerle <ol><li> 35mm cam alt Mattek yemekleri Levha hücreleri (veya başka bir cam alt odaları inceleyen). </li><li> Kullanarak birincil miyositler kat odaları 1 gün önce 10μg/ml laminin. KB tampon Levha (K-ters Tyrode tampon kardiyak miyositler (yetişkin köpekler, yenidoğan sıçan ya da diğer bir organizmayı izole) 35 Hepes mmol / L, 140 mmol / L KCl, 8 KHCO 3, 2 mmol / mmol / L MgCl 2 L ve 0.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.5) ve 37 az% 15 fetal sığır serumu ve% 1 streptamycin ve% 0.5 gentamisin ve inkübe ile desteklenmiş M199 orta yavaş yavaş değiştirmek ° C% 5 CO 2. </li><li> Hücreleri veya oda sıcaklığında 30-45 dakika için herhangi bir istenen kalsiyum göstergesi; kalsiyum yeşil AM (Molecular Probes 1-5 mcM) ile inkübe edin. Boya photobleaching önlemek için tabak alüminyum folyo ile örtün. </li><li> Leibovitz15 14mm EGTA orta (hücreler üç kez yıkayındüşük kalsiyum deneyler) veya herhangi bir uygun görüş medya performans. </li><li> Leibovitz15 orta containing14mM EGTA bir 30-45 dakika inkübe edin. </li><li> Inhibitörlerinin etkilerini test ikinci inkübasyon sırasında (yani 10μM U73122 PLC inhibitörü) ekleyebilirsiniz. </li></ol> 2. Microinjecting hücreleri <ol><li> 24 saat için cam alt Mattek yemekleri (ya da diğer izleme odaları) Kültür kardiyomiyositlerde. </li><li> 14 mM EGTA fenol-Leibovitz-15 orta Değişim (kardiyomiyositlerde kalsiyum serbest ortamda enjekte olması orta içeren kalsiyum, diğer hücreler enjekte edilebilir). </li><li> Mikroenjeksiyon çözüm hazırlayın çalışmalar Gα q ortadan kaldıran bir peptid - caveolae etkileşimleri. Hacminin sadece küçük bir miktar (~ fL) hücre içine enjekte edilir ve böylece makul konsantre stoklarını kullanmış olmalıdır aklınızda bulundurun. Bu peptid 2 mcM Cav3-iskele, kalsiyum-serbest ortamda DAPI ile kullandı. DAPI bir blue boya lekeleri çekirdeğin ve microinjected hücrelerin kimlik sağlar. DAPI birçok kalsiyum göstergeler floresan engel değildir. DAPI miktarı değişken ve biz genellikle çekirdeğin görselleştirmek için yeterli kullanmak (0.5 ve 2 mcM) </li><li> Yalnız boya tracer - DAPI içeren kontrol çözümü hazırlayın. </li><li> Microinjections kendi kendine çekti ya da piyasada bulunan iğne kullanmak için. Uygun iğne parametrelerini belirlemek için boya enjeksiyonu ile uygulayın. Biz, farklı hücrelerin farklı iğne çapları ve mikroenjeksiyon baskılara gerektirebilir unutmayın. </li><li> Örneğin bir InjectMan NI2 Eppendorf FemtoJet'te pompa, otomatik mikroenjeksiyon sistemi kullanın. 90 enjeksiyon basıncı P i hPa ve 45 tazminat basınç P c hPa ayarlayın. 0.7 enjeksiyon süresi t ayarlayın s Gerek enjeksiyon parametrelerini yeniden ayarlayın. </li><li> Ters bir mikroskop (örneğin Zeiss Axiove microinjections gerçekleştirinrt 200M) uzun çalışma mesafesi faz kontrast hedefi (örneğin hava 40x faz 2 hedefi için) ile donatılmıştır. </li><li> Hızlı bir şekilde mümkün olduğu kadar çok hücreler olarak enjekte edilir. Faz kontrast, canlı hücreleri seçmek için kullanarak hücreleri enjekte inceleyin. </li></ol> 3. Co-immunofloresan çalışmalar <ol><li> PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve 30 dakika boyunca% 3,7 paraformaldehid ile düzeltmek. Gerekirse, hücrelerin fiksasyonu önce uyarılır. </li><li> Sabit hücreler PBS ile üç kez yıkayın ve 5minutes için PBS içinde 0.2% NP40 kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> PBS 1 saat için% 4 keçi serumu (ya da diğer uygun serum) içeren kullanarak engelleyin. </li><li> 1 saat için PBS içinde% 1 keçi serumu ile uygun dilüsyon hücrelerin primer antikor ile inkübe edin. </li><li> Alexa-Fluor-488 anti-tavşan veya Alexa-Fluor-647 sulandırılmış anti-fare sekonder antikoru gibi floresan etiketli ikincil antikor Ayrıca, 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.6 ile 10 dakika hücreler üç kez yıkayın 1: 1000 PBS içinde% 1 keçi serumu (birincil antikorlar iki farklı proteinlerin problama farklı türler ortaya olmalıdır ve ikincil ilgili türlerine karşı olmalıdır dikkat edin). </li><li> 37 ° ° C'de 1 saat, üç kez TBS ile yıkayın. </li><li> TBS tampon ya da başka bir uygun görüş orta hücreleri. </li></ol> 4. Hızlı kalsiyum görüntüleme <ol><li> (Örneğin Fluoview 1000 Olympus) konfokal mikroskop lazer tarama kullanın. </li><li> Yüksek sayısal diyafram objektif kullanın. </li><li> Satın parametreleri ayarlayın. Kalsiyum yeşil kullanımı 488 nm eksitasyon ve uzun 515 emisyon filtreleri geçmek. </li><li> 2 μs / piksel piksel saati ayarlayın - hızlı kalsiyum ölçümleri için ayarlayın. </li><li> 0.05 - 0.3 mikron piksel boyutu ulaşmak için görüntü yakınlaştırma ayarlayın. </li><li> Belirli bir bölgede tercih edilen bir hücre satırı seçin. </li><li> Zaman kontrol penceresinde zaman zaman diliminde istenilen almak için en az 1500 taramaları (satın alma seçeneğinitepkisi - 1.3 ms / satır) 2 saniye doğuracak. </li><li> Kayıt arka plan önceden uyarılması için okuma. </li><li> 5 mcM karbakol ile hücreleri uyarmak ve kayıt verileri hemen başlayabilirsiniz. Hücreleri Leibovitz15 orta 1 mL tutun Leibovitz15 10 mcM karbakol hazırlamak ve hafifçe çanak içine 1 ml eklemek </li></ol> 5. Veri analizi <ol><li> Kaydedilen görüntü her bir piksel için şiddetleri ayıklayın. Fluoview 1000 yazılımını kullanarak bir tablo olarak yoğunluğu verileri kaydetmek. </li><li> Sigmaplot al'ı yoğunluğu veri veya benzer bir veri analiz programı ve bin ~ 9-40 bidonları içine veriler. Deneyler ve elektronik gürültü kontrolü ile karşılaştırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Biz multi-line lazer uyarma ve 40x/1.2 NA apochromat suya daldırma hedefi ile donatılmış konfokal mikroskop LSM510 (Zeiss Jena, Almanya) lazer tarama hücreleri görüntülenmiş. Şekil. Biz distributio 1 (kırmızı)n, bu hücrelerin 9 önemli yapısal caveolar protein kaveolin-3 antikor ile sabit olmuştur ve lekeli köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde caveolae . Kaveolin-3 immunolabelled Alexa-647 ve 633 nm hattı ile bir O heyecanlıydı: Ne lazer. Görüntüler LP650 nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Alexa-488 (yeşil) ile immunolabeled Gα q kaveolin-3 dağılımı karşılaştırıldı. Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer çizgisi ile heyecanlı ve görüntü BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Bu ko ölçümleri, iki fluorophores Çok Parça satın alma kullanarak sıralı bir şekilde heyecan vardı. Bu prosedür, kanal çapraz-tartışma en aza indirir. Veri analizi için ko-Zeiss LSM510-Meta ile sağlanan AIM yazılımı kullanılarak yapıldı. Görüldüğü gibi, iki protein kolokalize. Belirlemek için nasıl kaveolin-3 ve Gα arasındaki kaplin Ca 2 + Yeşil ile yüklendi . Biz bir 488nm Argon iyon lazer ile boya heyecanlı ve bir LP515 emisyon filtresi aracılığıyla görüntüleri toplanır. Resim çerçeveleri 500 ms aralıklarla toplanmıştır. Olympus yazılımı ve ImageJ kullanarak, her bir piksel için yoğunluğu değerleri çıkarıldı. Çizgi tarama modu hızlı Ca 2 + transientler ve Ca 2 + kıvılcım kantitatif analiz için kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan piksel büyüklüğü 0.1-0.3 mikron idi. Line-tarama hızı hakkında birkaç yüz satır başına ms'den oldu. Şekil. 2 biz bir çizgi tarama Ca 2 + Yeşil-yüklenmiş kardiyomiyosit piksel diyi süresi 2 μs 142 μs, hat zaman oldu. 1200 satır görüntü oluşur. Her tarama hattı Ca 2 yoğunluğu dalgalanma karşılık + Yeşil oluşan 142 μs aralığı üzerinden alınan 71 puan ve hızlı bir kalsiyum yanıtları için salt olarak kullanılabilir. Örneğin, Şekil. 3 Ca 2 + Ca 2 ile ölçülen tek bir satır ayrı bir kardiyomiyosit aktivite, önce saniyeler içinde zamanın bir fonksiyonu (üst) ve sonra + Yeşil floresan (alt) artırır 5 mcM karbakol ek hücre içi Ca 2 + Gα q-PLCβ aktivite ile. Kadar satır ortalaması alınır, karbakol stimülasyon, Ca 2 ~ 1,8 kat artış üretir + Yeşil yoğunluğu . Deneysel koşullar altında (oda sıcaklığında, lazer gücü, dedektör cevabı, boya dağılımları, vb) farklılıklar nedeniyle, bu artış bireysel görülebilir olmayabilirsatırlarını tarar. Yoğunluk değerleri (y ekseni değerleri) benzer olsa da, altta karbakol ile uyarılmış arsa uyarımı daha önce görülmemiş dar dalgalanma zirveleri çok daha sürekli bir kalsiyum düzeyleri ilgili çok daha geniş zirveleri, sahip olduğu açıktır. Şiddeti Bu genişletilmesi ve göreceli bir artış, küçük, yavaş salınımları gizler. Amacımız daha iyi kalsiyum dalgalanmaların bu farklı görünür türleri arasında ayrımcılık. Şekil bu hızlı kalsiyum dalgalanmaların Başka bir örnek gösterilmiştir. 4. Üst grafik uyarılmış ventriküler kardiyomiyositlerde (kırmızı) ve ortalama 3 satır izleri siyah gösterilir için ham hat verileri gösterir. Bu kalsiyum dalgalanmalar Gα q aracılığı ile olduğu ölçüde belirlemek için caveoline3 etkileşimleri, kaveolin-3 aldırır bir peptid microinjected uzun Ca 2 ortadan kaldırır Gα q etkileşimler (yani Cav3 peptid) + mevcut ve bu veriler mavi ile yazılmıştır.(Biz iki izlerini daha iyi ayırt edilebilir böylece Cav3 peptid yoğunluğu 500 çıkarılır unutmayın). Excel dosyaları içine Sigmaplot (Jandel, Inc.) Ham veri sütunları ithal ve histogram analizi yapıldı. Bu analizde, olayların sayısının bir histogram kutuları üretmek için eşit sayıda (bidonları) gruplandırılmıştır. Bin genişliği eşit bir zaman aralığını temsil eder. Yoğunlukları farklı zaman eklenir, belirli bir bin yükseklik yoğunluğu belirli bir zaman penceresi oluşur sayısını temsil eder o kadar bağlanır. Bu tür bir analiz, sadece aynı tarama hızında veri toplama bağlı olduğundan, aynı anda birçok izlerini analiz edilebilir. Ayrıca, bu analiz, boya düzeylerinde farklılıklar, lazer gücü, vb, elektronik ve arka plan gürültü zaman ölçeklerinde çok hızlı gerçekleşir duyarlı değildir ve sadece ilk 1-2 kutularına görülür. Ilgili histograŞekil ham veri ms. 4 sayfanın alt kısmında gösterilmiştir. Kontrol hücreleri için histogram kırmızı hat (çizgi göz rehberlik ve hiçbir modeli kabul edilir) tarafından tasvir gibi geniş bir zaman dağılımı, ilgili kutuları çok sayıda yayılmıştır. Buna karşılık, Gα q-Cav3 etkileşim peptid tarafından kesintiye uğramıştır hücrelerinin yanıt için kutulara peptidin varlığını uzun süre akıları ortadan kaldırır düşündüren dar bir bin dağıtım sınırlı. Mikroenjeksiyon Gα q-Cav3 bozmayan bir kontrol peptid un enjekte edilen hücrelerin 8 'e benzer bir histogram üretir. Şekil. 5 Ca 2 + yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve taze hızlı yoğunluk dalgalanmaları, caveolae (sağda) eksikliği unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde karşılaştırın. Burada, 3 dakikalık bir süre içinde şiddetlerinin ilgili histogramlar binned 35 yavaş kalsiyum olayları görüntülemek için. Yenidoğan kardiyomiyositlerde daha yapılandırılmış bir bazal yetişkin hücreler için ise daha yavaş Ca 2 + aktivite eksikliği gösteren düz bir başlangıç ​​hızlı dalgalanmalar gösterir unutmayın. Bu farklılıklar en kolay histogramlar görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Gα q dağılımını gösteren köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerinin Şekil 1. Görüntüleri Alexa-488 488nm Argon-iyon lazer hattı ve görüntü ile heyecanlıydı Alexa-488 ile immunolabeled BP505-530nm emisyon filtre kullanarak kaydedildi. Sağ üst 633-nm hattı ile heyecan Alexa-647 ile immunolabeled kaveolin-3 lokalizasyonu ile ilgilenen aynı görüntüyü O: Ne lazer ve LP650 nm emisyon filtre kullanılarak kaydedilmiş. Genişletilmiş bir görüntü ile sağ sol alt ko-turuncu renkte görülür birleştirilen görüntü. "Pdflinebreak"&gt; <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Kalsiyum görüntüleme yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit, Ca 2 + Yeşil ile yüklenir . Görüntü 40x hedefi ile 488nm Argon iyon lazer ve LP515 emisyon filtre kullanarak bir konfokal lazer tarama mikroskobu sistem üzerinde alınmıştır. 1200 satır görüntü oluşur, piksel süresi 2 μs yaşamak ve piksel boyutu 0.1 mikron idi. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3505/3505fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 TOP Yoğunluk dalgalanmalar yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler Ca 2 + Yeşil yüklü olarak tarif görüntülü kardiyomiyosit ve ALT 5 mcM karbakol'ün ek tarafından uyarılır aynı hücrede bir çizgi izlemesi. / 3505fig4.jpg "/&gt; Şekil 4 Ca 2 ile yüklenen yaşayan bir köpek yetişkin ventriküler kardiyomiyosit çizgi izleri bir örnek TOP ortalama 3 izlerinin, siyah bir çizgi olarak gösterilir ve microinjected bir hücre göre 180 ms üzerinden alınan + Yeşil (kırmızı ) bir peptid ile ortalama üç izleri siyah Gα q-kaveolin 3 derneği (kırmızı) bozar. Biz alt görüntüleme amaçlı veri kümesinden 400 yoğunluğu sayıları çıkarılır unutmayın. Alt paneller metinde açıklandığı gibi binned verilerin ilgili histogramlar ve bin sayısı isteğe bağlıdır ve bin sayısı (ya da sayısı) o belirli bin yoğunluğu toplam tutarı karşılık. Biz kontrolü (solda) ve peptid (sağ) histogramlar çizilen çizgi, kırmızı ve mavi çizgiler, verilerin kolay bir şekilde belirlenmesine ve karşılaştırmalar için izin vermek ve bir model kabul olduğunu unutmayın. files/ftp_upload/3505/3505fig5.jpg "/&gt; Şekil 5 Yoğunluğu dalgalanmalar Ca 2 + yetişkin köpek ventriküler kardiyomiyositlerde Yeşil (solda) ve caveolae (sağda) ve bunlara karşılık gelen histogramlar eksikliği taze, unstimulated sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde aşağıda gösterilmiştir.

<ol><li>Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks+and+%5BCa2%2B%5Di+waves+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium Sparks.</a> Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).</li>
<li>Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+control+of+phosphoinositide-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Physiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase.</a> C. Physiol.Rev. 80, 1291-1335 (2000).</li>
<li>Suh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+phosphoinositide-specific+phospholipase+C+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+reports%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of phosphoinositide-specific phospholipase C isozymes.</a> BMB reports. 41, 415-434 (2008).</li>
<li>Schlegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowded+little+caves%3A+structure+and+function+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Crowded little caves: structure and function of caveolae.</a> Cell. Signal. 10, 457-463 (1998).</li>
<li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caveolae+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225 (1998).</li>
<li>Sengupta, P., Philip, F., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin-1+alters+Ca2%2B+signal+duration+through+specific+interaction+with+the+G%7Balpha%7Dq+family+of+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Caveolin-1 alters Ca2+ signal duration through specific interaction with the G{alpha}q family of G proteins.</a> J. Cell. Sci. 121, 1363-1372 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Golebiewska, U., Scarlata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+Activity+in+Cardiomyocytes+through+Caveolae-G%5Balpha%5Dq+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical.+Journal%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ Activity in Cardiomyocytes through Caveolae-G[alpha]q Interactions.</a> Biophysical. Journal. 100, 1599-1607 (1016).</li>
<li>Rybin, V. O., Xu, X., Lisanti, M. P., Steinberg, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+targeting+of+beta+-adrenergic+receptor+subtypes+and+adenylyl+cyclase+to+cardiomyocyte+caveolae.+A+mechanism+to+functionally+regulate+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential targeting of beta -adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase to cardiomyocyte caveolae. A mechanism to functionally regulate the cAMP signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 275, 41447-41457 (2000).</li>
<li>Tovey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+puffs+are+generic+InsP3-activated+elementary+calcium+signals+and+are+downregulated+by+prolonged+hormonal+stimulation+to+inhibit+cellular+calcium+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium puffs are generic InsP3-activated elementary calcium signals and are downregulated by prolonged hormonal stimulation to inhibit cellular calcium responses.</a> J. Cell. Sci. 114, 3979-3989 (2001).</li>
<li>Lohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ignition+of+Calcium+Sparks+in+Arterial+and+Cardiac+Muscle+Through+Caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ignition of Calcium Sparks in Arterial and Cardiac Muscle Through Caveolae.</a> Circ. Res. 87, 1034-1039 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyalleri görüntüleyebilir ve izole etmek için bir yöntem geliştirdik. Bu ölçümlerin deneysel koşullar altında, daha önce diğer hücre sistemleri 10 gibi kardiyomiyositlerde 11 uygulanmış olsa da, histogramlar ve bin analiz birçok Ca 2 + olayları elde edilecek veri sağlar. Daha hızlı olaylar yavaş olanlar ve bunların altında yatan mekanizmaları anlamak için uyarlanmış modelleri kolayca izole edilebilir. Kültürleme kardiyomiyositlerde, çok sayı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

hızlı kalsiyum dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Kardiyomiyositlerde fonksiyonu 1,2 optimize etmek için birlikte çalışma süresi değişen birden fazla Ca 2 + akıları var . Değişiklikler Ca 2 + ekstrasellüler ajanlar yanıt olarak faaliyet ağırlıklı olarak, asetilkolin 3,4 gibi ajanlar tarafından uyarılan plazma membran lokalize fosfolipaz Cβ Gα q yolağı tarafından düzenlenir . Biz son zamanlarda caveolae 5,6 olarak adlandırılan plazma membran proteini etki alanı Gα q 7 aktif tuzağa olduğunu bulduk . Bu tuzak Gα q aktive devlet istikrar ve uzun süreli Ca 2 + kardiyomiyositlerde ve diğer hücre tipleri 8 sinyalleri sonuçlanan bir etkiye sahiptir. Biz yaşam kardiyomiyositlerde hızlı bir ölçekte dinamik kalsiyum tepkileri ölçerek bu şaşırtıcı bir sonuç ortaya çıkardı. Kısaca, hücreler bir floresan Ca 2 + gösterge ile yüklenir. Çalışmalarda, Ca 2 + Yeşil (Invitrogen,kalsiyum iyonlarının bağlanması üzerine floresans emisyon yoğunluğunda bir artış sergileyen c.). Floresan konfokal mikroskop bir lazer tarama bir satır tarama modunu kullanmak için kaydedilir. Bu yöntem, seçilen bir hat boyunca piksel floresan yoğunluğu zaman elbette hızlı veri toplama mikrosaniye zaman ölçeği üzerinde zaman izleri yüzlerce üreten sağlar. Bu çok hızlı izleri excel ve sonra analiz için Sigmaplot içine transfer edilir ve elektronik gürültü, boya, ve diğer kontroller için elde edilen izleri ile karşılaştırıldığında. Ca 2 incelemek için farklı akı oranları + tepkiler, zamanla piksel yoğunlukları binned histogram analizi yapıldı. Binning tarama 500 izlerini üzerinden grup ve tek bir arsa üzerinde mekansal ve zamansal olarak derlenmiş sonuçları görselleştirmek için bize izin verir. Böylece, tarar, farklı pik yerleştirme ve gürültü nedeniyle, üst üste zaman ayırt etmek zor yavaş Ca 2 + dalgalarının kolayca görülmektedir.binned histogramlar. Çok hızlı ölçüm zaman ölçeği tozlar, uzun Ca 2 ise çok kısa bir süre kutularına yoğunluğu dar bir dağılım gösterir + dalgaları uzun süre kutuları üzerinde geniş bir dağıtım binned verileri göstermektedir . Bu farklı zaman dağılımları, Ca 2 + akıları zamanlaması bize hücreleri incelemek ve çeşitli hücresel olayları üzerindeki etkilerini belirlemek için izin verir .

Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak canlı hücreler yavaş akıları hızlı (mikrosaniye) kalsiyum olayları izole etmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem, bir hücrede birkaç yüz piksel kayıt satırı tarar kalsiyum göstergeler floresan dalgalanmaları ölçer. Histogram analizi, bize farklı kalsiyum akıları zaman ölçeklerinde izole etmek için izin verir.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Kardiyomiyositler, işlevi optimize etmek için birlikte çalışan, farklı sürelerde gerçekleşen çoklu Ca2+ akışlarına sahiptir 1,2. ... yanıtındaki Ca2+ aktivitesindeki değişiklikler...

Bu prosedürün genel amacı, farklı sürelerdeki hızlı kalsiyum sinyallerini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin hücre tutunmasına ve görüntülemeye olanak tanıyan bir lam veya kuyucuk üzerinde kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hücreler floresan bir kalsiyum indikatörü ile yüklenir.Ardından hücrelere bir ilaç veya ilgilenilen diğer bir protein mikroenjeksiyonla aktarılır. Son adım, konfokal mikroskopta hızlı floresan görüntüleme yapmaktır. Nihayetinde, farklı zaman ölçeklerindeki kalsiyum yanıtları değerlendirilebilir.Benim adım ULA Ska. Dr. Scar laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bu yöntem, belirli bir ilacın hücrelerdeki kalsiyum mobilizasyon yollarını nasıl değiştirebileceği gibi, hücre sinyalizasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin uygulamaları, kardiyak aritmilerin tedavilerine kadar uzanmaktadır. Kardiyak aritmilerin bazal kalsiyum akımlarındaki bozulmalardan kaynaklandığı belirtildiğinden, prosedüre başlamadan bir gün önce 35 mm cam tabanlı görüntüleme odalarını 10 µg/mL laminin ile kaplayın. Ertesi gün, KB tamponunda süspande edilmiş 1 mililitre taze izole hücreyi odalara ekleyin; hücreler odaların tabanına

measuring-fast-calcium-fluxes-in-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.

İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Bu makale, sıçan kalbinden izole edilen kardiyak miyositlerde kasılma sırasında miyofilament Ca2+ duyarlılığındaki değişiklikleri değerlendiren bir protokolü açıklamaktadır. Kardiyak elektrofizyoloji, sistolik/diyastolik sitozol Ca2+ seviyeleri ve kasılma/gevşeme ile birlikte bu ölçüm, sağlıklı ve hastalıklı kalplerde kardiyak uyarılma-kasılma eşleşmesine aracılık eden mekanizmaların desteklenmesinde zorunludur.

Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve...

Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi

Mevcut protokol, yüksek verimli ilaç taraması ve toksisite testi için iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerde (iPSC-CM'ler) tetiklenen hücresel aktivitenin tüm optik kontrolünü ve gözlemini açıklamaktadır. Zaman ve uzaydaki fenotipik kalıpların multi-parametrik nicelleştirilmesi gösterilmiştir. İlaçların saatler boyunca uzun vadeli etkileri veya günler boyunca sıralı ölçümler gösterilmiştir.

Toksisite Testi ve Fenotipik İlaç Taraması için iPSC Türevi Kardiyomiyositlerde Yüksek Verimli Optik Kontrol ve Kalsiyum Sinyalinin Kaydedilmesi

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Öğrenin kardiyomiyositlerde hızlı kalsiyum sinyallerini konfokal mikroskopi ile izole etme yöntemini. Bu teknik, farklı sürelerdeki kalsiyum akışlarını analiz ederek hücre sinyalleşmesini anlamaya yardımcı olur.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Daha fazla video keşfet