Vasküler Ca Görselleştirme ^{2 +} Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Bu prosedürün genel amacı, perikrin türevli reaktif oksijen türleri veya r os tarafından tetiklenen vasküler kalsiyum sinyalini görselleştirmektir. Bu, ilk olarak aktif makrofajlarda oksidasyona duyarlı boyalar kullanılarak Ros'un görselleştirilmesiyle gerçekleştirilir. ROS, plazmid bazlı floresan sensörler kullanılarak endotel hücrelerinde de görüntülenebilir.

Ardından, bir ko-kültür modelinde hücre izleyiciyi, kırmızı etiketli aktive edilmiş makrofajları ve dört etiketli endotel hücresinin gribini aynı anda görselleştirmeye devam edin. Son olarak, makrofaj türevi R os tarafından tetiklenen endotel hücrelerindeki kalsiyum sinyalini ölçün. Konfokal bir görüntüleme sistemi kullanarak.

Bu sonuçlar, R os seviyelerini bağımsız olarak gösterebilir ve aynı zamanda Peregrine türevi ROS tarafından tetiklenen hücre içi kalsiyum mobilizasyonunu aynı anda değerlendirebilir. Bu yöntem, vasküler bir sinyalleme ve simülatör patofizyolojik ayarını yakından ortaya çıkaran iki farklı sinyal molekülünün aynı anda değerlendirilmesini sağlar. Laboratuvarımdaki iki doktora sonrası araştırmacı olan Karthik ve Raj, ham ve kalsiyum ölçümleri ve makrofaj endotel hücre etkileşimleri ile ilgili prosedürü gösterecekler.

Kültür faresi monositten elde edilen makrofajlar cam tabanlı 35 milimetrelik tabaklarda kullanılır. Daha sonra hücrelere toll benzeri reseptör agonistleri ile meydan okuyun ve 37 santigrat derecede altı saat boyunca inkübe edin. Sitozolik görselleştirme için.

ROS oksidasyona duyarlı boya ekler ve hücreleri 20 dakika inkübe eder. Şimdi hücreleri konfokal bir görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü bir aşamasında görselleştirin. Alternatif olarak, TLR ile aktive edilmiş hücrelerde mitokondriyal ROS'u görselleştirmek için mitokondriyal süperoksit indikatörünü ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Negatif bir kontrol için, pozitif bir kontrol için hücreleri PBS veya DMSO ile tedavi edin. Hücreleri iki milimolar antimisin ile tedavi edin. A, konfokal bir görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü aşamasındaki tüm hücreleri görselleştirmeye devam edin.

Image J yazılımını kullanarak tüm görüntü verilerini analiz edin. Floresan sensör hiper spesifik olarak peroksitin mikromolar altı konsantrasyonlarını algılar ve memeli ifadesine dayalı olarak vektör tasarımı sitoplazma veya mitokondriye hedeflenebilir. Elektroporasyon kullanarak, uygun olmayan hiper ekspresyon plazmidi taşıyan fare pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin stabil çizgileri oluşturun.

Tam TMEM'de düşük yoğunlukta koloni büyüme plakası hücrelerini kolaylaştırmak ve 48 saat boyunca inkübe etmek için, ortamı bir seçim antibiyotiği ile desteklenmiş tam kültür ortamı ile değiştirin. Hiper pozitif hücrelerin en yüksek yüzdesi için klonları tarayın ve bireysel deneylerde kararlı hiper pozitif çizgiler oluşturmak için kültürü çoğaltın. % 0.2 jelatin kaplı örtü fişleri üzerindeki tohum hücreleri ve gece boyunca% 80 birleşime kadar kültür.

Şimdi hücreleri TLR ligandları ile aktive edin ve 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. Sitoplazmik ROS'un tespiti için, hücrelerin örtü kaymalarını bir adelo hücre odasına monte edin. Bir mililitre ön ısıtma tankı ekleyin, tuz çözeltisini dengeleyin ve odayı konfokal görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü bir aşamasına yerleştirin.

Mitokondriyal tespiti için hücrelerdeki floresan değişikliklerini kaydedin. ROS. İki mikromolar antimisin A'nın pozitif bir kontrolünü dahil edin. Daha sonra tedavi edilen hücrelerin kapak fişlerini konfokal mikroskopi için hazırlayın. Image J yazılımını kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin.

Hücre içi kalsiyum değişikliklerinin görselleştirilmesi ve ölçülmesi için jelatin kaplı cam örtü kızakları üzerinde %80'e kadar büyütülmüş endotel hücreleri ile başlayın. Boya kaybını en aza indirmek için floresan boya gribi oh 04:00 oda sıcaklığında hücreleri 30 dakika inkübe edin, hücreleri süen piro bölgesi içeren deneysel görüntüleme solüsyonu ile yıkayın. Şimdi, kapak kızaklarını 800 mikrolitre önceden ısıtılmış deneysel görüntüleme solüsyonundaki bir adelo hücre odasına monte edin ve hücreleri ayrı bir tüpte konfokal görüntüleme sisteminin sıcaklık kontrollü bir aşamasına yerleştirin.

İncelenen makrofaj popülasyonunu etiketlemek için 15 dakika boyunca mililitre hücre izleyici başına 500 nanogram kırmızı C-M-T-P-X kullanın, hücreleri yıkayın ve peletleri 200 mikrolitre deneysel görüntüleme solüsyonunda yeniden süspanse edin. Şimdi etiketli makrofajları grip oh 4:00 yüklü üzerine ekleyin. Konfokal oda düzeneğindeki endotel hücreleri, 10 dakika boyunca her üç saniyede bir yeşil ve kırmızı floresan kaydeder.

Bu deneyde, J 7 74 0.1 hücreleri, altı saat boyunca TLR iki, üç ve dört ligandları ile zorlandı. Temsili konfokal görüntüler, DCF ile ölçüldüğü gibi artmış bir sitozolik Ros gösterir. İlginç bir şekilde, mitozlar çorap kırmızı floresan, mitokondriyal ROS'ta benzer bir artışı gösterir.

Bu floresan değişiklikleri niceldir. Bu nedenle sonuçlar normalleştirilmeli ve tedavi başına nispi kat değişikliği olarak ifade edilmelidir, antimisin a sinyali mitokondriyal ROS üretimi için pozitif bir kontrolü doğrular. Bu şekil, endotelyal, sitozolik ve mitokondriyal peroksit seviyelerinin stabil bir şekilde eksprese eden hiper sito veya hiper D mito'daki görüntülerini göstermektedir.

MP ECS, TLR agonistleri ile uyarılır. Ortalama floresan değişiminin kantitasyonu, bir ko-kültür sisteminde altı saatlik stimülasyondan sonra hiper sito ve hiper D mito floresansının arttığını gösterir. Hem vahşi tip hem de GP 91'den yeni izole edilmiş mirin makrofajları olan Peregrine ROS sinyalini değerlendirmek için, Fox boş fareleri altı saat boyunca mililitre LPS başına bir mikrogram ile aktive edildi.

Makrofajlar C-M-T-P-X ile kırmızı olarak etiketlendi ve yeşil grip dördüne eklendi. Yüklü. MPM ecs. İlginç bir şekilde, vahşi tip farelerden izole edilen LPS ile aktive edilmiş makrofajlar, GP 91 Fox boş farelerden alınan makrofajlara kıyasla MPM ECS'de büyük ve hızlı kalsiyum mobilizasyonunu tetikledi.

LI bu prosedürü uygulamaya çalışırken, uzun süreli indirme veya lazere maruz kalmanın DCF'nin otomatik oksidasyonuna yol açtığını hatırlamak önemlidir. Hiper sito ve hiper D mitralin foto beyazlamasından kaçınmak çok önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, makrofajlarda ve endotel hücrelerinde RA ölçümü, uygun şekilde yapılırsa yedi saat içinde yapılabilir.