Name: Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Keşfedin Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi ile canlı hücrelerde lipid raft bölünmesini ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre zarı mikrodomainlerinin dinamiklerini ve sinyal iletimini anlamak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Agence Nationale de la Recherche (ChoAD) bir hibe ile desteklenmiştir. Biz de kendi mali destek için Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) minnettarız.

1. FCS Kur Kalibrasyon <ol><li> Konfokal mikroskop, lazerler, bilgisayarlar, sıcaklık için kuvöz ve CO 2 kontrolü başlatın. </li><li> SPAD (Single Photon Çığ Diyot) üzerindedir ve SPAD içinde floresan filtre iyi numunenin uygun olduğundan emin olun. SPAD zaman içinde senkronize olup olmadığını kontrol edin. Lütfen SPAD ayarları edinimi için hazır kez sadece FCS yazılımı başlatmak için dikkat edin. </li><li> 1 ug / ml (17.5 nM) bir konsantrasyona ulaşmak için PBS ile seyreltilerek kolera toksini-Alexa488 taze bir çözeltisi hazırlayın. </li><li> Mikroskop iç algılama kullanarak çözüm konfokal görüntüleme Optimize. </li><li> Tarama modu gelin ve çözüm örnek bir nokta seçin geçin. Lazer aydınlatma süresi (&gt; 5 dakika) sizin FCS alımları gerçekleştirmek için yeterince uzun olduğundan emin olun. </li><li> SPAD dış algılama ve FCS yazılım geçin. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi sui olduğundan emin olunSPAD için ted (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 50 000 sayımları 000 / s iyidir). Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin. </li><li> 30 saniye ölçümleri 10 takım edinin. Zaman kazancı (en iyi örnekleme ve photobleaching sorunları arasında uzlaşma) için numune için optimize edilmelidir. </li><li> Eğer çözüm difüzyon bir floresan türlerin karşılık gelen bir oto-korelasyon eğrisi (Şekil. 2 denklemi) sahip olmasını sağlamak ve montaj sonrası elde edilen difüzyon süresi (Şekil (yaklaşık 0,2 ms) doğru olduğunu verilerinizi (bkz: adım 4) analiz . 3). </li></ol> 2. Lipid Rafts Marker ile Yaşayan hücreler boyanması <ol><li> Poli-L-lisin (1mg/ml) yapışmasının doğru olduğundan emin olmak için görüntüleme önceki gün kaplı 8-iyi Labteks üzerine Plaka HEK293 hücreleri. Floresan sinyal hiçbir karışıklık yoktur sağlamak için fenol kırmızısı olmadan orta kullanın. </li><li>HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın. </li><li> 37 de 30 dakika boyunca hücrelere 500 ul HBSS kolera toksini-Alexa488 (1 ug / ml) / BSA (% 0.1) ekleyin ° C. Kolera toksini tercihen lipid sallar bölümlenmiş olması bilinen gangliozid GM1, bağlanacaktır. </li><li> HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) ile iki kez hücre yıkayın. </li></ol> 3. Yaşayan hücreler üzerindeki FCS Veri Toplama <ol><li> Mikroskop sahnede boyanan hücrelerin yerleştirin. 2 durumları bu difüzyon zamanlarda eserlerin yol açabilir aksi takdirde uygun olduğundan emin Sıcaklık ve CO olun. </li><li> Mikroskop iç algılama (Şekil 4) kullanarak bir ilgi hücrenin konfokal görüntüleme Optimize. </li><li> Tarama modunu işaret ve faiz hücrenin plazma membranı bir nokta seçin geçin. Hücre edinimi sırasında hareket olmadığından emin olmak için hücrenin 1-2 canlı görüntüleri gerçekleştirin. </li><li> SPAD dış algılama geçin ve FCS yumuşakware. Lütfen floresans sinyal izlemek ve iyi (yeterli sinyal ancak doygunluk, 10 000 50 000 sayım / s ince) SPAD uygun olduğundan emin olun. Gerekirse, z konumunu, kazanç ve / veya doğru floresan sinyal elde etmek için lazer gücü değiştirin. Bu yeterli değil ise, boyama, değişen koşullara düşünebilirsiniz. </li><li> 30 saniye ölçümlerin 10 örnek edinin. En hücreleri otomatik floresan olduğundan, otomatik floresans solma nedeniyle, ilk satın almalar sırasında floresans bir düşüş görebilirsiniz. </li></ol> 4. FCS Veri Analizi <ol><li> Korelasyon aralığı ayarlayın ve FCS yazılımı ile oto-korelasyon eğrileri oluşturmak. Korelasyon aralığı genellikle kısa çözülebilir gecikme zaman kadar olası en uzun süre (ölçüm istatistikleri daha yetersiz maksimum korelasyon zaman toplam satın alma zamanı yaklaştığında olur, azami gecikme süresini% 80 ile sınırlıdır uzanacağım Picoqua üzerine alma süresint yazılım). </li><li> Her numune için, zamanın bir fonksiyonu olarak floresans dalgalanmalar ve oto-korelasyon karşılık gelen dosyaları ihracat. </li><li> Bir veri analizi ve bu dosyaları almak için Pro Origin gibi uydurma yazılımı kullanın. </li><li> Her bir örnek için, floresans 30 saniye boyunca sabit kalır yani hiçbir photobleaching edinimi sırasında olduğundan emin olun. Bu yapay uzun difüzyon kez neden olabilir photobleaching gösteren herhangi bir önlem atın. </li><li> Kalan FCS eğrilerinin şekli (Şekil 5) doğru olup olmadığını kontrol edin. Ortalama FCS eğrisi belirleyin. </li><li> Uygun matematiksel model (Şekil 2) ile eğrisi uyar. Bu uygun bir difüzyon süresi (ler) ve bunun (ese) difüzyon süresi (lar) ile difüzyon moleküllerinin oranı verecektir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Bir kolera toksini-Alexa488 solüsyonu ile bir FCS kalibrasyon bir örneği, Şekil 3 'de gösterilmiştir (Şekil 3A), bireysel göstermek ve FCS eğrileri gelmediğini kontrol ettikten sonra hesaplandı. Anlamına FCS eğrileri çeşitli difüzyon modelleri (Şekil 2'de örnekler) tekabül eden denklem ile donatılmış edildi. Klasik bir uyum kalitesini belirlemek için kabul parametre belirleme katsayısı R 2 dir. R 2 yakın daha iyi bir uyum, 1 etmektir. Bu durumda, ortalama FCS eğrisi uyacak şekilde en doğru modeli üç boyutlu (Şekil 2 ve Şekil 3B, denklem 1) serbestçe difüzyon flüoresan moleküller nüfusu tarif biridir. Uyum elde difüzyon süresi 0.32 ms. Eğri (Şekil 3C) ve R 2 faktörü (0,99906) gelen artıklar uyum kaliteli bir tahmin sağlar. Kolera toksini-Alexa488 lekeli HEK2 için FCS analizi bir örneği93 hücreleri Şekil 5 de gösterilmiştir. Multifazik ortalama FCS eğrisi şekli farklı difüzyon kez floresan moleküllerin nüfusun varlığını ortaya koymaktadır. Bir engel difüzyon (membran düzlemde gibi, iki boyutlu difüzyon) ve üç boyutta serbestçe difüzyon biri (Şekil 2 ve Şekil 5 denklem 2) iki: Bu eğri için en uygun floresan probların üç nüfusa sahip bir model tekabül . Bu ikinci nüfusu salgılanması veya geri dönüşüm yol aracılığıyla membran ulaşan veya endositoz ile membran bırakarak, bunların membran hedefler için bağlayıcı ya da bağlantısını kesme düzlemi membranı, yani, hareket dışındaki moleküller flüoresan karşılık gelir. GM1 bağlı kolera toksini tekabül membran iki kez difüzyonu, lipid salların dışında difüzyon tekabül 2 MS (moleküllerinin% 25), ve lipid sallara difüzyon karşılık gelen 75 ms (moleküllerinin% 50), idi . Unutmayın ki herhangi bir photobleachedinimi sırasında ing yapay uzun difüzyon kez böylece muhtemelen lipid sal alanlarda GM1 lokalizasyonu konusunda bir önyargı oluşturmaya yol açacaktır. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. FCS kurulumu (Marquer ark modifiye resim. 12) şematik <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Difüzyon modelleri ve otokorelasyon eğrileri sığdırmak için kullanılacak karşılık gelen denklem örneği. Yapısı parametresi S 1 / e 2 yoğunluğu ve W0 etkili la azından optik ekseni boyunca S = z z 0 / W 0 0 etkili odak uzunluğu gibi yazılabilir1 / e 2 yoğunlukta teral odak yarıçapı. Bu değerler, klasik bir nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ölçümü elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. FCS kalibrasyon için çözüm kolera toksin Alexa488 difüzyon zaman değerlendirilmesi. Bir 30 saniye kazanım bir temsili örneğin zamanın bir fonksiyonu olarak A) Floresans dalgalanması. B) denklemi 1 ile donatılmış 30 saniye edinimi 10 örnek (bkz. Şekil 2). C) eğri gelen artıklardan elde edilen otokorelasyon eğrisi ortalama. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. HEK-293 hücre kolera toksin Alexa488 ile boyandı. Hücreler iç 488nm lazer çizgisi ile bir SP5 konfokal mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya) görüntülendi. Floresans 500 arasında bir x60 planı apochromat immersiyon yağı amacı ile toplanmışve 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. HEK293 hücrelerinin plazma membranında kolera toksini-Alexa488 yayılma süresi değerlendirmesi. A) (bkz. Şekil 2) denklemi 2 ile donatılmış otokorelasyon eğrisi ortalama. B eğri itibaren) artıklar. (Marquer ve ark modifiye. 12)

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Simons, K., Gerl, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalizing+membrane+rafts%3A+new+tools+and+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalizing membrane rafts: new tools and insights.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).</li>
<li>Simons, K., Ehehalt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol%2C+lipid+rafts%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol, lipid rafts, and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).</li>
<li>Munro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+elusive+or+illusive%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: elusive or illusive.</a> Cell. , 115-377 (2003).</li>
<li>Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%3A+now+you+see+them%2C+now+you+don%27t%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts: now you see them, now you don't.</a> Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).</li>
<li>Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid-cholesterol+rafts+diffuse+as+small+entities+in+the+plasma+membrane+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+sphingolipid-+and+cholesterol-rich+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts.</a> J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).</li>
<li>Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+lipid+rafts%3A+an+identity+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).</li>
<li>Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+lipid+mobility+of+raft-exhibiting+model+membranes+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+relates+rafts+in+model+and+native+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes.</a> Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in living cells.</a> Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).</li>
<li>Marquer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cholesterol+increase+triggers+amyloid+precursor+protein-Bace1+clustering+in+lipid+rafts+and+rapid+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.</a> FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).</li>
<li>Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review+of+biochemical+and+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications.</a> Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Ilien, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pirenzepine+promotes+the+dimerization+of+muscarinic+M1+receptors+through+a+three-step+binding+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process.</a> J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).</li>
<li>Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-receptor+kinetics+measured+by+total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).</li>
<li>Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+surface+dynamics+of+biomolecules+by+total+internal+reflection+fluorescence+with+photobleaching+recovery+or+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy.</a> Biophys. J. 33, 435-454 (1981).</li>
<li>Thompson, N. L., Steele, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+with+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).</li>
<li>Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+nanoscale+dynamics+of+membrane+lipids+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell.</a> Nature. 457, 1159-1162 (2009).</li>
<li>Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+correlation+spectroscopy%3A+measuring+number+densities%2C+aggregation+states%2C+and+dynamics+of+fluorescently+labeled+macromolecules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells.</a> Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).</li>
<li>Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differently+anchored+influenza+hemagglutinin+mutants+display+distinct+interaction+dynamics+with+mutual+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts.</a> J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).</li>
<li>White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holin+triggering+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Holin triggering in real time.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fast+dynamics+in+solutions+and+cells+with+a+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.</a> Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).</li>
<li>Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+correlation+spectroscopy+with+a+laser-scanning+microscope%3A+exploiting+the+hidden+time+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure.</a> Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+GPI-anchored+proteins+on+the+surface+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells.</a> Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys. J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Bates, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lateral+diffusion+and+capture+of+CFTR+within+transient+confinement+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones.</a> Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

FCS yöntemi burada sunulan canlı hücrelerin ilgi floresan probların lipid sal bölümleme bir hassas ve hızlı analiz sağlar. FCS tek foton sayma duyarlılığı ile konfokal mikroskopi lokalizasyonu doğruluğunu birleştirir. FCS ve standart biyokimyasal teknikler arasındaki temel fark DRMS ​​izolasyon ya da eş-yama için olduğu gibi FCS hedef lipid sallar bölümü değil, göreceli bölüm mutlak belirlenmesi olanak tanımasıdır. FCS veri kazanım her bir örnek için yaklaşık 5 dakika (30 saniye 10 satın) al...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kolera toksini B alt birimi-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamer) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık ve CO 2 kontrolü için İnkübatör </td><td> Yaşam görüntüleme hizmetleri </td><td> Küp ve Kutu </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Çığ Diyot) </td><td> MPD (Photon Micro Devices) </td><td> PDM serie (100 mikron Hassas Alan) </td><td></td></tr><tr><td> Yüksek geçiren 488 nm filtre </td><td> Semrock </td><td> Kenar BrightLine uzun-pass filtre engelleme 488 nm Part #ails.aspx? id = FF01-488/LP-25 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS algılama ünitesi </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 modülü </td><td></td></tr><tr><td> Toplama ve oto-korelasyon yazılımı </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Fitting yazılım </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

lipid raft belirlenmesi flüoresan korelasyon spektroskopisi (fcs) tarafından yaşayan hücreler içinde floresan etiketli soruşturmasının bölümleme

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Son on beş yıl içinde hücre zarları homojen değildir ve işlevleri sarfetmek microdomains güveniyor görüşünü yaygın olarak kabul haline gelmiştir. Lipid sallar kolesterol ve spingolipitler zenginleştirilmiş membran microdomains vardır. Bunlar sinyalizasyon gibi hücresel fizyolojik süreçlerin bir rol oynar ve ticareti 1,2 değil, aynı zamanda viral veya bakteriyel enfeksiyonlar ve nörodejeneratif hastalıklar 3 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli oyuncular olduğu düşünülmektedir. Ancak varlıklarını hala tartışma 4,5 meselesidir. Gerçekten de, lipid sal boyutu böylece doğrudan görüntüleme engelleyen, çok konvansiyonel mikroskobu (200 nm dolaylarında) çözünürlük sınırının altında, yaklaşık 20 nm 6 olarak tahmin edilmiştir. Şimdiye kadar, lipid sallar içinde ilgi proteinlerin bölümü değerlendirmek için kullanılan ana teknikleri Deterjan Dayanıklı Membranlar (DRMS) antikorları ile izolasyon ve co-yama vardı. Rağmen yaygın olarak kullanılan becaonların yerine kolay uygulama kullanımı, bu tekniklerin eserler eğilimli oldukları ve böylece 7,8 eleştirdi. Teknik gelişmeler dolayısıyla bu eserlerin aşmak ve canlı hücrelerin lipid sallar bölüm soruşturma edebilmek için gerekli idi. Burada yaşayan hücrelerin plazma membranında floresan etiketli protein veya lipitlerin lipid sallar bölümünün hassas analizi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) olarak adlandırılan, lipid salların içinde veya dışında bulunan flüoresan prob difüzyon zamanlarda eşitsizliği dayanır. Aslında, yapay membranlar ve hücre kültürlerinde hem de kanıtlandığı, probları çok daha hızlı dışında yoğun lipid sallar 9,10 içinde daha dağılırdı. Difüzyon kez belirlemek için, dakikalık bir floresans dalgalanmaları (Şekil bir konfokal mikroskop ile hücre plazma membranında bulunan, bir odak hacmi (yaklaşık 1 femtoliter) zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülmektedir1). Oto-korelasyon eğrileri sonra bu dalgalanmaların alınan ve uygun matematiksel difüzyon modelleri 11 ile takılabilir. FCS bunlar floresan etiketlenmiş olduğu sürece, çeşitli prob bölümleme lipid sal belirlemek için kullanılabilir. Floresan etiketleme flüoresan füzyon proteinlerinin ifadesini ya da flüoresan ligand bağlanması ile elde edilebilir. Ayrıca, yakın zamanda 12 FCS olarak tanımlanan, suni membranları ve hücre çizgileri, ama aynı zamanda primer kültürler olarak değil yalnızca kullanılabilir. Ayrıca ilaç eklenmesi veya membran lipid kompozisyonunda değişim 12 sonrası lipid sal bölümleme dinamiklerini takip için kullanılabilir.

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Son on beş yılda, hücre membranlarının homojen olmadığı ve işlevlerini yerine getirmek için mikrodomainlere dayandığı görüşü yaygın olarak kabul görmüştür. ...

Lipid salları, sinyal iletimi ve taşınma gibi hücresel süreçler için organizasyon merkezleri olarak görev yapan plazma membranındaki mikro domenlerdir. Burada, ganglioside GM1'in lipid salı partisyonunu incelemek için canlı hücrelerin plazma membranındaki lipid salı partisyonu, floresan korelasyon spektroskopisi kullanılarak nicelendirilmektedir. Memeli hücreleri, Alexa 488 ile işaretlenmiş kolera toksini B alt birimleri ile analiz edilmektedir.Floresan proteinler, konfokal mikroskopi kullanılarak öncelikli olarak lipid sallarına bölünen gangliosid GM1'e bağlanır. Plazma membranındaki dakiklikteki floresan dalgalanmalar ölçülür. Flor'un difüzyon sürelerini belirlemek için otokorelasyon eğrileri oluşturulur ve uygun matematiksel difüzyon modelleriyle uydurulur.Problar, yoğun lipid salları dışındaki ortamlarda içerisindekine göre çok daha hızlı difüze olduğu için, elde edilen sonuçlar partisyon seviyesini göstermektedir. Deterjana dirençli membran izolasyonu veya antikorlarla birlikte yamalama gibi mevcut yöntemlerimize kıyasla bu tekniğin temel avantajı, FCS'nin hedefin göreceli değil, mutlak lipid salı paterninin belirlenmesine olanak sağlamasıdır. Dahası, floresan olarak işaretlendikleri sürece hem lipidler hem de proteinler için kullanılabilir.Bu yöntem, Alzheimer hastalığı alanındaki "amiloid beta üretiminde lipidlerin önemi nedir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu durum, spesifik olarak lipid grefti bileşenlerine bağlanan yeni inhibitörler gibi önemli keşiflere yol açacaktır. Bu prosedüre, floresan korelasyon spektroskopisi veya FCS sistemini kalibre ederek başlayın.Bu FCS düzeneği; bir tespit filtresi ve bir avalanche fotodiyot içeren harici bir tespit ünitesine bağlı konfokal mikroskop ve zamanla ilişkili tek foton sayım sisteminden oluşmaktadır. Konfokal mikroskop lazerlerini, konfokal görüntüleme bilgisayarını ve FCS veri toplama bilgisayarını başlatın. Ardından inkübatörü açın ve 37 °C ve %5 karbondioksit olarak ayarlayın.Tek foton çığ diyotunun (spad) açık olduğundan ve spad içindeki floresan filtresinin numuneye uygun olduğundan emin olun. Spad'in zamanla senkronize olduğunu kontrol edin. Spad ayarları veri toplama için hazır olduğunda, FCS PICO quant yazılımını başlatın.PBS içinde dilüe edilerek son konsantrasyonu 1 µg/mL olacak şekilde taze bir kolera toksini Alexa 488 solüsyonu hazırlayın. Solüsyonu bir lam üzerine pipetleyin. Ardından, floresansın en yoğun olduğu düzlemi bulmak için mikroskop üzerindeki Z ayarlarını düzenleyin.Nokta tarama moduna geçmek için beyazlatma noktası (bleach point) düğmesine tıklayın, ardından çözelti örneği içinde bir nokta ilgi alanı seçmek için görüntü ekranına tıklayın. Yazılımı kullanarak pozlama süresini beş dakikanın üzerine ayarlayın. Bu işlem, lazer aydınlatmasının FCS kazanımlarını gerçekleştirmek için yeterince uzun olmasını sağlar.Ardından FCS yazılımını kullanarak, spad ile harici deteksiyona geçin. Floresan sinyalinin saniyede 10.000 ile 50.000 sayım aralığında olduğundan emin olun. Amaç, doygunluk oluşmadan iyi bir sinyal elde etmektir.Aynı alanda 32 ölçümlük 10 set elde edin. Kazanım süresi, fotobleaching olmadan yüksek kaliteli örnekleme sağlanacak şekilde örneğe göre optimize edilmelidir. Optimizasyon örnek verileri elde edildikten sonra, floresan türlerin difüzyon sürelerinin belirleneceği otokorelasyon eğrilerini oluşturmak için kullanılır. İlk olarak.FCS yazılımını kullanarak korelasyon aralığını ayarlayın ve çözeltide difüzyon yapan floresan türlere karşılık gelen bir otokorelasyon eğrisi oluşturun. Her 32. ölçüm için yazılım, her 32. örneği bağımsız olarak analiz edecek ve gözlemler arasındaki benzerliği, aralarındaki zaman farkının bir fonksiyonu olarak raporlayan klasik bir matematiksel fonksiyon kullanarak floresans yoğunluklarından otokorelasyon eğrileri üretecektir. Korelasyon aralığı tipik olarak, çözünürlebilir en kısa LAC süresinden mümkün olan en uzun süreye kadar değişecektir.Burada görülebileceği üzere, maksimum korelasyon süresi toplam veri toplama süresine yaklaştıkça ölçüm daha az hassas hale gelir. Burada, maksimum gecikme süresi veri toplama süresinin %80'i ile sınırlandırılmıştır. Ardından, her örnek için zamana bağlı floresan dalgalanmalarına ve otokorelasyona karşılık gelen dosyaları dışa aktarın. Daha sonra, veri toplama sırasında fotobeyazlama (photo bleaching) meydana gelip gelmediğini kontrol etmek için dosyaları Origin Pro gibi bir veri analizi ve fitleme yazılımına aktarın.Floresans dalgalanmaları dosyasını inceleyin. Floresansın 30 saniye boyunca stabil olması ve düz bir çizgi şeklinde temsil edilmesi gerekir. Floresans ölçümleri fotobeyazlamayı (photo bleaching) gösterdiğinde.Kalan FCS eğrileriyle yapay olarak daha uzun difüzyon sürelerine neden olabileceği için, ilgili FCS eğrilerini daha sonraki analizlerde kullanmayın. Her bir zaman noktası için otokorelasyon değerlerinin ortalamasını alarak ortalama FCS eğrisini belirleyin. Son olarak, eğriyi uygun matematiksel modelle uydurmak için Origin Pro'nun uydurma modülünü uygun denklemle birlikte kullanın.Bu uyum, moleküllerin ve çözeltinin difüzyon süresini verecektir. Bu durumda, difüzyon içerisinde serbestçe difüze olan tek bir popülasyon bulunmaktadır. Elde edilen difüzyon süresi doğruysa, yaklaşık 0,2 milisaniyedir.Düzenek iyi şekilde kalibre edilmiştir ve sonraki deneyler için kullanılabilir. Kalibrasyon kontrolü tamamlandığından, sistem bir floranın lipid RAF bölüşümünü ölçmek için kullanılabilir. İlgilenilen dört canlı hücre örneği için HEC 2 93 hücrelerini inkübatörden çıkarın.Hücrelerin yapışmaları için zaman tanıması amacıyla, bir gün öncesinde polilizin kaplı sekiz yuvalı lab Tech lamlarına ekilmiş olması gerekir. Floresan sinyalinin bozulmadığından emin olmak için fenol kırmızısı içermeyen besiyeri kullanılmalıdır. Hücrelerin kurumasına izin vermediğinizden emin olarak, kuyucuktaki besiyerinin çoğunu nazikçe uzaklaştırmak için bir pipet kullanın.Ardından, kuyucuğa nazikçe HBSS ekleyin. Bu yıkama işlemini her kuyucuk için bir kez daha tekrarlayın. Hücrelere 30 dakika boyunca 500 microliters seyreltilmiş kolera toksini, Alexa 4 88 ekleyin.İnkübasyonun ardından, kolera toksini lipid salları içinde öncelikli olarak bölündüğü bilinen gangliyozid GM1'e 37 °C'de bağlanacaktır. Hücreleri daha önce yapıldığı gibi iki kez HBSS ile yıkayın; hücreler artık FCS veri toplama işlemi için hazırdır. Boyanmış hücreleri mikroskop tablasına yerleştirin ve sıcaklık ile karbondioksit ayarlarını kontrol edin.Mikroskobun dahili detektörünü kullanarak ilgilenilen bir hücrenin konfokal görüntülemesini optimize edin. Membranı iyi boyanmış bir hücre bulun. Daha önce olduğu gibi nokta tarama moduna geçin ve ilgilenilen hücrenin plazma membranında bir nokta seçin.Görüntüleme sırasında hücrenin hareket etmediğinden emin olmak için hücrenin bir veya iki fotoğrafını çekin. Uygun sinyalin 10.000 ile 50.000 arasında olduğunu doğrulamak için, daha önce yapıldığı gibi spad dış deteksiyona ve FCS yazılımına geçiş yapın. Z pozisyon kazancını ve/veya lazer gücünü düzenleyin.Çoğu hücre otofloresan olduğu için 32. ölçümlerden 10 örnek alın. Otofloresansın sönümlenmesi nedeniyle ilk alımlarda floresan azalması görülebilir. Ortalama FCS eğrisini belirlemek için floresan dalgalanmalarını daha önce olduğu gibi analiz edin.Ardından, çok fazlı ortalama FCS eğrisini uygun matematiksel model ile fit edin. Origin Pro'nun fit modülünü uygun denklemle birlikte kullanın. Bu fit işlemi, difüzyon sürelerini ve bu difüzyon süreleriyle difüze olan moleküllerin oranını verecektir.Bu şekil, kolera toksini Alexa 488 çözeltisi ile yapılan bir FCS kalibrasyon örneğini göstermektedir. Floresansın zamana bağlı bireysel ölçümlerinin herhangi bir fotobeyazlama göstermediği kontrol edildikten sonra, bireysel ve ortalama FCS eğrileri hesaplanmıştır. Ortalama FCS eğrileri, çeşitli difüzyon modellerine karşılık gelen denklemlerle fit edilmiştir.Bir uyumun kalitesini belirlemek için klasik olarak kullanılan parametre, belirlilik katsayısı olan R kare değeridir. R kare değeri bire ne kadar yakınsa, uyum o kadar iyidir ve bu durumda en doğru modelle uyum sağlanmış olur. Ortalama FCS eğrisi, üç boyutta serbestçe difüzyona uğrayan floresan molekül popülasyonunu tanımlayan eğridir.Uyumdan elde edilen difüzyon süresi 0,32 milisaniyedir. Eğri uydurmadan gelen artıklar ve R kare faktörü, buradaki uyumun kalitesine dair bir tahmin sunar. R kare değerinin 0,99906 olması, iyi bir uyuma işaret etmektedir.Alexa 4 88 ile boyanmış kolera toksini uygulanan HC 2 93 hücreleri için bir FCS analiz örneği burada gösterilmektedir. Bu örnekte, difüzyonu değerlendirmek için küçük hücre içi floresan noktaların varlığıyla kanıtlandığı üzere, toksin endositoz edilmeye başlanmıştır. Plazma membranındaki Alexa 4 88 işaretli kolera toksininin süresi.Veriler, bu videoda açıklandığı şekilde toplanmış ve analiz edilmiştir. Çok fazlı ortalama FCS eğrisi şekli, farklı difüzyon sürelerine sahip floresan molekül popülasyonlarının varlığını ortaya koymaktadır. Bu eğriye en uygun uyum, ikisi engellenmiş difüzyona sahip olan üç floresan prob popülasyonlu bir modele karşılık gelmektedir.Membran düzleminde olduğu gibi iki boyutta difüzyon ve üç boyutta serbestçe difüzyon yapanlar. Bu son popülasyon, membran düzleminin dışında hareket eden floresan moleküllere karşılık gelir. Diğer bir ifadeyle, floresan moleküller ya sekresyon veya geri dönüşüm yoluyla membrana ulaşan membran hedeflerine bağlanmakta veya onlardan ayrılmakta ya da endositoz yoluyla membrandan ayrılmaktadır.Membranda iki farklı difüzyon süresi gözlemlendi. Moleküllerin %25'i, lipid salların dışındaki difüzyona karşılık gelen iki milisaniyelik difüzyon hızlarına sahipti. Moleküllerin %50'si, lipid salların içindeki difüzyona karşılık gelen 75 milisaniyelik difüzyon sürelerine sahipti.Alternatif bir optik konfigürasyon eşleşmesiyle bu prosedürün takip edilmesinin ardından, difraksiyon limitinin altında tek molekül tespiti gerçekleştirilebilir; bu durum, geliştirme sonrasında daha geniş bir difüzyon süresi aralığına erişilmesine olanak tanır. Bu teknik, lipid sal işlemleri alanındaki araştırmacıların, ilaç uygulaması sonrası hücre hatlarında ve primer kültürlerde membran lipid kompozisyonu değişimine bağlı olarak lipid sal bölümlenmesinin hastalıkla ilişkili dinamiklerini incelemelerine yol açmıştır.

determination-lipid-raft-partitioning-fluorescently-tagged-probes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Burada, tek bir molekül duyarlılık ve ~ 15 msn zaman çözünürlüğü ile polarize TIRFM kullanılarak lipozomlar ve mikroakışkan kanallarda desteklenen iki katmanlı arasındaki tek tuzak aracılı füzyon olayları tespit etmek için bir protokol mevcut. Lipid ve çözünür kargo sürümü aynı anda tespit edilebilir. Lipozom boyutu, lipit yayınım ve füzyon gözenek özellikleri ölçülmüştür.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Hedef reseptörleri hücre yüzeyinde bağlanan antikorlar uyum ve küme değişikliklerini görüşmek. Bu dinamik değişiklikler ilaç geliştirme hedef hücrelerdeki karakterize konusunda da etkileri vardır. Bu iletişim kuralı confocal mikroskobu ve görüntü korelasyon spektroskopisi ile hücre yüzeyinde kümeleme reseptör kapsamını ölçmek için ImageJ/FIJI kullanır.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Keşfedin Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi ile canlı hücrelerde lipid raft bölünmesini ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre zarı mikrodomainlerinin dinamiklerini ve sinyal iletimini anlamak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme (Video) | JoVE Journal

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Daha fazla video keşfet