Name: Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin, kronik nikotin maruziyetinde fare beynindeki nikotinik asetilkolin reseptörlerindeki değişiklikleri spektral konfokal mikroskopi ve lineer spektral ayrıştırma ile nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, bağımlılık mekanizmalarını anlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anthony Renda Victoria Yüksek Lisans Burs Ödülü bir üniversite tarafından desteklenmiştir. Myre ve Winifred Sim Fonu, İnovasyon hibe, bir British Columbia Bilgi Geliştirme Fonu için bir Kanada Vakfı - Bu araştırma, Doğa Bilimleri ve Kanada Discovery Hibe Mühendislik Araştırma Kurumu, bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü (RN), bir Victoria Vakfı tarafından desteklenen ve Doğa Bilimleri ve Kanada Araştırma Araçları ve Enstrümantasyon Hibe Mühendislik Araştırma Konseyi. Biz mükemmel fare hayvancılık Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald ve Daniel Morgado teşekkür ederiz.

1. Pompa implantasyonu <ol><li> Pompası implantasyonu önce, doldurma ve hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak Alzet mini-osmotik pompalar (Alzet, Model 2002, Cupertino, ABD) hazırlamak. Ozmotik mini pompa Bu model 14 gün boyunca 0.5 ul / saat arasında bir oranda bir çözüm sunar. Steril koşullar olun. Boş ve dolu pompaları tartılır. Deneme (10 gün sonra implantasyon) bitiminde, pompada kalan sıvı bir şırınga ve iğne ile çıkarılır ve pompalanan hacmi hesaplamak için tartılır edilebilir. </li><li> Kontrol solüsyonu ile Pompalar (% 0.9 w / v, Teknova, S5819, Hollister, ABD) serum fizyolojik içerirler. (-)-Nikotin hidrojen tartrat tuzu (Sigma, kedi # N5260) tuzlu su ile seyreltilir (% 0.9 w / v) ve 0.22 um bir şırınga filtresinden uç filtre edilerek sterilize nikotin çözeltisi, bir 1 M stok solüsyonu hazırlamak üzere. Daha önce 10 gün boyunca 0.4 ve 2 mg / kg / saat (nikotin, serbest baz olarak hesaplanır) azından nikotin tatbik var. </li><li> Üç tuzlu su banyoları (üç hazırlayın10 cm tuzlu) petri doldurdu. Pompa doldurulmuş ve kapatılmış edildikten sonra, dış kabuk üzerinde ilacın herhangi izlerini kaldırmak için her başarılı tuzlu su bulunan pompa iyice yıkayın. Immerse ayrı salin kaplarda kontrolü ve nikotin pompalar tutarak, cerrahi kadar, depolama için tuzlu su çözeltisi içinde pompalar doldurulur. </li><li> Sağlıklı bir kurtarma teşvik ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için, uzun vadeli iyileşme için hazırlanan temiz kafesleri var. </li><li> Hemen ameliyat sonrasında kısa vadeli iyileşme için, bir ısıtma yastığı ve bir ısı lambası içeren bir kafes hazırlar. </li><li> Kronik nikotin etkilerini araştırmak için biz 5 ila 6 homozigot α4YFP var knock-in her grupta farelerin (2-3 aylık) (kontrol veya nikotin). Α4YFP knock-in fare hattı C57BL/6J fare suşu, 10 nesiller için backcrossed edilmiştir. Hepimiz farelerin yaş ve cinsiyet çalışmaları için aynıdır ve tüm ameliyatlar değişkenliği en aza indirmek için aynı gün emin olun. HY önlenmesi içinAmeliyat sırasında ve sonrasında farelere pothermia, steril cerrahi örtü kaplı bir ısıtma yastığı ile cerrahi masa donatmak. </li><li> 3 L / dk oksijen ve% 3 izofluran ile α4YFP vuruntu-fare indükleyin ve daha sonra 2.5 L / dk oksijenin az anestezi ve% 1 izofluran korumak. Ameliyat bitiminde izofluran hızla sistemi temizler çünkü izoflurandan tercih ve fareler ~ 2 dakika içinde bilinçli ve hareketlidir. Kornea hasarı önlemek için (Yırtma-Gel, Novartis) hemen düşer göz uygulayın. </li><li> Pompalar ensesine bir cilt kesisi ile deri altına implante edilir ve pompa geri dorsalinde aşağı kaudal itilir. Mat% 95 etanol kürk ile ön ayakları arasında arka alanı silin. 0.8mm Graefe forsepsi ile cilt (Güzel Bilim Araçları, 11050-10) sıkın ve iris makası (Güzel Bilim Araçları, 14060-10) kullanarak 1 cm merkezi yanal kesim yapmak. </li><li> Standart desen makas eklemek, pompa için bir subkutan alanı oluşturmak içins (Güzel Bilim Araçları, 14101-14) insizyon içine ve hayvanın kuyruk sonuna doğru dikkatle itin. </li><li> 1.0 mm Graefe forsepsi (Güzel Bilim Araçları, 11650-10) kullanarak, salinden pompa kaldırın. Insizyonu, açık forseps kullanarak tutun ve hayvan kaudal ucuna bakacak osmotik pompa kapağı ile kesi içine pompayı yerleştirin ve kaudal sonuna pompa itin. </li><li> Pinch 0.8mm forseps kullanarak kapatmaya yara ve Vetbond yeterli miktarda (3M, kedi # 1469SB) yapıştırıcı uygulanır. Yara kapatılır kadar basılı tutun. </li><li> Izofluran maskesi gelen hayvan çıkarın, bilinçli ve mobil kadar kısa süreli bir kurtarma kafesin içine, analjezik ile meloksikam (0.1 mg / kg sc) ve yerine enjekte edin. Daha sonra, gıda ve su ad libitum mevcut olan bir uzun dönemli geri kazanım kafese yerleştirin. </li></ol> 2. α4YFP knock-in fare fiksasyon intrakardiyak perfüzyon ile <ol><li> Prosedürü öncesinde çözümleri bir gün yapın ve tüm fareler değişkenliği en aza indirmek için 4 ° C de bırakınaynı gün ve çözümlerin aynı partiden ile perfüze edilecektir. </li><li> Iyi havalandırılan bir alanda perfüzyon fiksasyon gerçekleştirin. GKD 2 O. ile; peristatic pompası (Masterflex Pompa Kontrolörü, 60.648 Masterflex Kolay Yükleme, 7518-00) ve Flush hattı </li><li> 20 ml PBS pH 7.6 (Invitrogen, kedi # 70011) heparin ~ 0.0015g (Sigma, kedi # H4784), bir antikoagülan, ekleyin. </li><li> Uyuştur α4YFP arka bacak kas içine intramüsküler ketamin bir karışımı (25 mg / kg, Wyeth Hayvan Sağlığı) ve medatomidine hidroklorür (0.25 mg / kg, Pfizer) enjekte edilerek knock-in fare ve hemen eve kafese geri hayvan yerleştirin. </li><li> Metal bir tepsi içine yerleştirilen bir strafor kapak hayvan Pin. % 95 etanol ile toraks silin. Adson forsepsi (Güzel Bilim Araçları, 91106-12) ve kelepir sıkıştırmadan, cilt iris makası ile göğüs boşluğuna açılır. Ultra ince hemostat (Güzel Bilim Araçları, 13021-12) kullanarak göğüs kafesi Kelepçe ve kalp maruz bırakmaktadır. </li><li> 4 ml / dak ve ben de PBS pompalama başlayınhayvanın sol ventrikül içine 23G kelebek iğne (Becton Dickinson, 367.253) nsert. Hemen kan izin ve kaçmak için perfüzat için sağ atrium snip. </li><li> PBS (pH 7.6) perfüze 20 ml,% 4 paraformaldehid (PFA% 16'lık bir stoktan PBS ile seyreltilerek pH 7,6, Elektron Mikroskobu Sciences, kedi # 15710) ve ardından 30 ml% 5, daha sonra 20 ml sakaroz (pH 7,6) . Biz üzerinde tespit otofloresans artırdığı bulundu. % 5 sukroz ile perfüzyon otofloresans düşürür beyin, kalıntı PFA durular. </li><li> 3 gün için% 30 sakkaroz beyin ve mağaza çıkarın. </li><li> Koronal kesit için beyinleri dondurmak için, Ekim Montaj Bileşik (Doku-Tek, kedi # 4583) yılında (VWR, kedi # 18986-1) plastik bir kalıp içinde gömme rostral tarafında yukarı ve batığın bir jilet ve bir yerde beyin ile serebellum kesti . Dilimleme önce -20 ° C'de kuru buz ve mağaza içinde dondurun. </li><li> Bir kriyostat ve daha sonra Bölüm beyinleri (30 mikron kalınlığında) kaplı slaytlar transfer. Ve -20 azından beyin bölümleri depolamakdeg; susuz kalsiyum sülfat taş içeren slayt kutuları C. -20 ° C'de muhafaza edildiğinde slayt kutusu nemi önlemek ve sonraki dondurucu yakmak için bir zip kilit mühürlü torba içinde olmalı </li></ol> 3. Spektral konfokal mikroskopi kullanılarak Görüntüleme floresan nAChRs <ol><li> Slaytlar photobleaching en aza indirmek için herhangi bir ışık kaynağına maruz az olduğundan emin olun. </li><li> Floresan protein flüoresan inhibe etmez bir montaj orta beyin bölümünde slaytlar Coverslip. Biz birkaç saat sonra sertleşir Mowiol 4-88 ile iyi bir başarı (Tris-HCI ve gliserol, pH 8.5, EMD-Calbiochem, kedi # 475904) var. Mowiol hava kabarcıklarını önlemek için kayma kapağı önce oda sıcaklığına equilibrates emin olun. Bu YFP floresans gidermek olacak gibi kaymasını kapak olduğunda tırnak cilası kullanmayın. </li><li> Görüntüler bir Nikon C1si spektral konfokal mikroskop sistemi kullanılarak elde edilir. Spektral konfokal görüntüleme ve doğrusal Karışmama yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi vardırd başka bir yerde 13-15. Bir spektral konfokal mikroskop kullanımı için gerekçe sabit beyin dokusu doğasında otofloresans olmasıdır. Nikon C1si Spektral konfokal görüntüleme örnek floresan yayılan ışığın dalgaboyu aralığındaki, sadece renklerin bir gökkuşağı içine beyaz ışık kırıcı bir prizma gibi bir ızgara dağılımlı elemanı vasıtasıyla da farklı dalga boyları içine mekansal kırılan bu 32 photomultiplier tüp dedektörler bir dizi kullanır 16. Bir emisyon spektrumu görüntülerin bir lambda yığının her piksel için toplanır, böylece ışığın farklı dalga boylarında toplanan görüntüleri - Ne toplanan görüntülerin bir lambda yığını olduğunu. YFP ve doku otofloresansı her bir karakteristik spektral imzaların sahip olduğundan, lambda yığın ayrı YFP ve autofluorescent sinyallerini (Şekil 2) içine bir lineer Karışmama cebirsel algoritmasını kullanarak deconvolved edilebilir. Böylece, YFP floresans çok hassas miktarının önemli miktarda Au ile daha da doku belirlenebilirtofluorescence. </li><li> Çeşitli ayarları, görüntü kalitesi ve floresan toplama verimliliği optimize etmek için ayarlanabilir. Biz genellikle kullandığınız ayarları bildirir ancak bu ayarlar örnek ve konfokal mikroskop bağlı olarak ayarlanabilir. Doğru α4YFP alt birimi ifade değişikliklerini ölçmek için kronik nikotin ile hepimiz piksel sinyallerinin gri tonlama seviyesi yoğunluğu (12 bit gri tonlama için &lt;4095) doyurarak değerin altında olduğundan emin olun. Dahası, bu piksel etrafında bir doyurarak değerinin üçte biri (~ 1300-1400) veya daha az olacak şekilde konfokal ayarları yaparak nedeniyle reseptör uyarılması için sinyal potansiyel artış için uygun. Ayarlarını optimize sonra, ayarları tüm görüntüleme oturumları ve örnekler için aynı tutulur. </li><li> 40 mW Argon lazer% 15 maksimal iletim de 488 nm lazer çizgisi: Bir 60X petrol CFI Planı Apo VC nesnel (NA 1.40, 0.13 mm çalışma mesafesi) kullanarak görüntüleme α4YFP için aşağıdaki ayarları kullanın, 220 spektral dedektör kazanç, 5 nm çözünürlükte 496,5 nm 656,5 nm görüntülendi spektral aralığı, 50 um x 50 mikron alana 512 x 512 piksel, orta iğne deliği boyutu (60 mikron çap), bir 4.08 piksel, bekleme süresi iki tarama ve gri ölçek 12 bit üzerinden ortalama. </li></ol> 4. Spektral konfokal görüntü ve görüntü analizi Lineer Karışmama <ol><li> Bir spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir örnek görüntü üzerinde lineer spektral Karışmama gerçekleştirmek için, bir ilk YFP için bir referans spektrumu ve doku otofloresans için bir referans spektrumu almanız gerekir. </li><li> Herhangi bir referans spektrumu için önemli bir koşul da örnekleri görüntüleme için kullanılan aynı lazer hattı ile görüntülendi gürültü floresans spektrumu yüksek bir sinyal elde etmektir. Argon 514 nm lazer çizgisinin daha iyi YFP tepe emisyon ayrıştırılması ve 488 nm hat daha az l var çünkü 488 nm lazer hattı ile görüntü YFP tercih YFP heyecanlandırmak için daha yüksek bir uyarım verimliliği olmasına rağmenikely pik deforme etmek ve bir zirveye yükselişi de dahil olmak üzere tüm YFP emisyon spektrumunu elde edebilirsiniz. Biz görüntüsü çözünebilir YFP kuvvetli bir YFP sinyal elde edilir, böylece, bir hücre serisi içinde transfekte edilmiş ve sonuçtaki YFP tayfı referans spektrumları kütüphane saklanır. Aynı zamanda arka spektrumu için yüksek bir sinyal sağlar çünkü hücre çizgileri ile ifade içinde transfekte α4YFP da kullanılabilir. </li><li> Biz α4YFP fare görüntü düşündüğünüz çeşitli beyin bölgelerinden bir wild tip fare beyin bölümünden otofloresans biz görüntü otofloresans bir referans spektrumu elde etmek ve bunlara karşılık gelen spektrumları edinin. Için Biz, lazer yoğunluğu dedektör kazanç değiştirmek veya gürültüye sinyal üst düzeye çıkarmak için ortalama görüntüleme gerçekleştirmek rağmen biz, aynı lazer çizgisi, 488 nm, ve hemen hemen aynı parametreleri kullanarak resim kullanmak. </li><li> Α4YFP fare bir beyin bölgesinden bir spektral konfokal görüntü alındıktan sonra, görüntüyü daha sonra kendi YFP ve autofluor içine deconvolved edilirAynı beyin bölgesi YFP referans spektrumu ve wild tip fare otofloresansı referans tayfı kullanılarak doğrusal bir spektral Karışmama algoritmasının uygulanması ile escence sinyaller. </li><li> Karışmamış α4YFP resim gibi sonra ImageJ (gibi bir görüntü analiz yazılımı açılabilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) ve sonra ortalama piksel yoğunluğu ilgi bölge için hesaplanmaktadır. ImageJ için bir eklenti "loci_tools.jar" (denir <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) Nikon ics / kimlikleri konfokal dosyaları almak için kullanılabilir. </li><li> Biz bir arka plan artık değeri elde etmek için aynı beyin bölgesinde farelerin wild tip için aynı doğrusal spektral Karışmama ve analiz tekrarlayın. </li><li> Sonra bir ortalama düzeltilmemiş α4YFP değeri (4.5) arka plan kalıntı değeri (4.6) çıkarılarak düzeltilmiş ortalama α4YFP yoğunluğu alır. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Biz bir spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir homozigot α4YFP fare (Şekil 3A) medial habenula görüntülerinin bir lambda yığını bir temsilcisi gerçek renk projeksiyon göstermektedir. Biz de aynı lambda yığını görüntüsü (Şekil 3B) α4YFP pozitif nöron içeren bir ilgi bölgeden emisyon spektrumunu göstermektedir. Bir farklı emisyon tepe ~ 527 nm dalga boyunda açıktır, hangi YFP pik floresans emisyon olduğunu. Medial habenula komşu bölge α4YFP nAChR alt birimlerinin olmadığını bildiren, 527 nm dalga boyunda spektral pik yoksun bir emisyon spektrumu gösterir. Önemli bir emisyon bindirme (Şekil 4), YFP ayrılması ve autofluorescent sinyali ile YFP referans spektrası ve fare beyin autofluoresence kullanılarak lineer spektral Karışmama takiben verimli bir α4YFP karıştırılmamış resim, bir görüntünün autofluorescent karıştırılmamış ve geriye kalan kanal mümkündür. Α4YFP gribi net lokalizasyonunuorescence medyal habenula (Şekil 4) ve sıkışık soma tespit edilebilir. Hipokampus α4YFP ağırlıklı olarak medial perforant yolu, tempero-ammonic yolu ve Alveus 12 lokalize olur. Bunlar, hipokampus her glutamaterjik innervasyon vardır. Biz hipokampal perforant yolu (Şekil 5) α4YFP ifade kronik nikotin etkisi incelenmiştir. Nikotin Kronik idaresi (10 gün için 2 mg / kg / saat) kronik nikotin tedavi edilen farelerde (p = 0.001, Wilcoxon rank sum testi) kontrol serum fizyolojik tedavi farelerin α4YFP floresans anlamlı bir artış (69 ±% 14) neden ( Şek. 5). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Kronik nikotin ile α4YFP nAChR alt birimden görüntü değişikliklere prosedürü gösteren Şekil 1. Akış çizelgesi. Mini-osmotik pompalar serum fizyolojik ya da nikotin ya da dolu ve &amp; alp içinde deri altına implanteha 4YFP homozigot fareler. 10 gün fareler% 4 formaldehit ve fare beyinleri ile perfüze ve sabitlenir sonra slaytlarda (30 mikron kalınlığında) kesitler vardır. Beyin bölümünde bir spektral konfokal mikroskop (Nikon C1si) üzerindeki yansıması ve Işıksal YFP ve autofluorescent görüntü içine karışmamış edilir. Sonra α4YFP görüntü ImageJ yazılım ile daha da analiz edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bir spektral konfokal mikroskop ile yansıma ve doğrusal olarak spektral bileşenleri içine karışmamış bir lambda yığın şematik diyagramı. (A) görüntülerin bir lambda yığını elde edilir. (B) bir lambda yığın bir emisyon spektrumunu tamamını yığın boyunca, her bir piksel için alınır, böylece ışık, farklı dalga boylarına sahip toplanan görüntü oluşur. YFP ve doku otofloresans her karakteristik spektral imzaları olduğundan (C), lambda yığını s içine doğrusal bir Karışmama cebirsel algoritması kullanılarak deconvolved edilebilirkolay kurulum YFP ve autofluorescent sinyalleri. Böylece, YFP floresans çok hassas miktar daha otofloresansı düzeyi yüksek olan doku tespit edilebilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Α4YFP nAChRs ifade eden bir beyin bölgesi spektral konfokal görüntü. Nikon C1si spektral konfokal mikroskop ile çekilen bir α4YFP fareden medial habenula görüntülerinin bir lambda yığını (A) gerçek renk projeksiyon. (B) α4YFP içeren nöronların (yeşil) ve medial habenula (kırmızı) dışında bir ilgi bölgesini kapsayan bir ilgi bölgesinden spektrumlarının Arsalar. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Medial habenula Lineer spektral Karışmama. Karışmamış α4YFP (A) Görüntüler ve (B) otofloresans izleyerek lineer spektral Karışmama. YFP (C) Referans spektrumları (yeşil triaçıları) ve otofloresans (sarı daireler) spektral Karışmama için kullanılır. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Ve hipokampus α4 nAChRs arasında ekspresyonunun α4YFP knock-kronik nikotine maruz kalan farelerin. (A), hipokampusdan α4YFP floresans döşenmiş bir montaj. İki kesik seçimi alanlarda analizler her fare için yapıldı hipokampusun perforant yolun alt bacak ilgili yaklaşık yerlerdir. (B) α4YFP floresans kronik tuzlu (*, p = 0.001, Wilcoxon rank sum testi) göre kronik nikotine maruz kalan farelerin perforant yolunu anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Sonuçlar temsil ortalama ± SEM n serum fizyolojik hem de kronik nikotin tedavi edilen farelerde (her bir tedavi grubunda 5 fare) için = 20 ölçüm. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Daha iyi dα4YFP bir epth ifadesi olarak antikor etiketleme göre. Ikincil bir etiket (B) olarak Cy5 ile α4YFP floresans (A) ve VGlut2 antikor XZ ortogonal görünümler. (C) α4YFP (açık daireler) kıyasla antikor boyama (siyah kareler) için derinliği üzerinde daha fazla floresan sinyal yoğunluğu düşüşü gösteren Arsalar.

<ol><li>Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+receptors+in+brains+from+smokers%3A+membrane+binding+and+autoradiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).</li>
<li>Schwartz, R. D., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+receptor+binding+sites+in+the+brain%3A+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo.</a> Science. 220, 214-216 (1983).</li>
<li>Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+nicotine+infusion+on+tolerance+development+and+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).</li>
<li>Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+GluR1+in+the+midbrain%3A+a+trigger+for+sensitization+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse.</a> Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).</li>
<li>Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+increase+the+expression+of+GluR1+and+NMDAR1+glutamate+receptor+subunits+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+common+adaptations+among+cross-sensitizing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents.</a> J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).</li>
<li>Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+trigger+a+common+synaptic+adaptation+in+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons.</a> Neuron. 37, 577-5782 (2003).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+%CE%B14%CE%B22+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).</li>
<li>Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%C3%8E%C2%B14%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional Î±4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-spectral+imaging+and+linear+unmixing+add+a+whole+new+dimension+to+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy.</a> BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).</li>
<li>Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNashmi%2C+R+%22Molecular+imaging%3A+fret+microscopy+and+spectroscopy%22">Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy</a>. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Larson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution%2C+high+sensitivity%2C+and+high+acquisition+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li>
<li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures%3A+implications+for+optical+disector-based+designs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li>
<li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+doesn%27t+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li>
<li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li>
<li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li>
<li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li>
<li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86%5BRb%5D%2B+efflux+and+125%5BI%5D-epibatidine+binding+sites+in+C57BL%2F6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li>
<li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li>
<li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li>
<li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li>
<li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li>
<li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+containing+the+%C3%8E%C2%B22+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li>
<li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habenular+%CE%B15+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li>
<li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li>
<li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li>
<li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution%3A+more+than+pretty+pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li>
</ol>

Biz ifşa şey var.

<p class="jove_content"&gt; Miktar ve belirli bir iyon kanalı lokalizasyonunu belirlemek için bir itici içinde fare modelinde, bir flüoresan reseptörünün kullanımı bir dizi avantaj sağlar. Gibi her yerde görülen Tüm hücreler olarak ifade edilir aktin, proteinler gibi tersine, iyon kanalları çok daha az sayıda bulunan ve bunların ifade zorlayıcı geleneksel teknikler vasıtasıyla immunohistokimyasal doğru analiz hale nöronal alt türleri arasında değişir. Α4YFP gen ürünü aynı rehberleri, arttırıcılar ve kaçakçılık mekanizmalarının kontrolü altındad...

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> mini-osmotik pompalar </td><td> Alzet </td><td> model yılı 2002 </td><td></td></tr><tr><td> tuzlu </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nikotin hidrojen tartrat tuzu </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> göz damlası </td><td> Novartis </td><td> Tear-Jel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond tutkal </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> ketamin </td><td> Wyeth Hayvan Sağlığı </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine hidroklorür </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G kelebek iğne </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> plastik gömme kalıp </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ekim Montaj Bileşik </td><td> Doku-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8.5 </td></tr></table>

kronik nikotin İdaresi fareler knock-in içinde floresan etiketli nikotinik reseptör spektral konfokal görüntüleme

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Merkezi sinir sistemi (MSS) ligand kapılı iyon kanalları ciddi tıbbi ve sosyal sonuçları ile sayısız koşullarda sorumlu tutulmaktadır. Örneğin, sigara ile nikotin bağımlılığı erken ölümü tüm dünyada (Dünya Sağlık Örgütü) önde gelen nedenidir ve büyük olasılıkla beyinde 1 iyon kanal dağıtım bir değişikliğe neden olur. 1-3 beyin dokusunda nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChRs) sayısı artırılmış hem de kemirgenler ve insanlarda sonuçlar kronik nikotin maruziyeti. Benzer şekilde, glutamaterjik GluN1 veya GluA1 kanalları değişiklikler gibi kokain, amfetamin ve opiatların 4-6 gibi diğer bağımlılık yapan ilaçlara duyarlılığın tetiklenmesi suçlanmıştır. Sonuç olarak, spesifik iyon kanalları dağıtım ve ifade kalıpları eşleştirmek ve sayısal yeteneği bağımlılık mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Beyin bölgeye özgü ef çalışmabireysel ilaçların fects bu radyoaktif ligand olarak tekniklerinin ortaya çıkmasıyla tarafından geliştirilmiştir. Bununla birlikte, radyoaktif ligandı bağlama düşük uzaysal çözünürlüğü nöronların belirli alt türleri olarak ligand kapılı iyon kanalları ölçmek yeteneği önler. Böyle yeşil floresan protein (GFP) ve birçok renk çeşidi olarak genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere, biyoloji 7 alanında devrim yarattı. Genetik etiketleyerek bir in vivo 7-10 proteinlerin görselleştirebilirsiniz endojen bir protein için bir floresan muhabiri. Bir prob ile floresan etiketleme proteinlerin bir avantajı nonspecificity ve hedef proteine ​​erişilebilirlik sorunları var antikor kullanımının ortadan kaldırılması vardır. Biz transfekte Kültür hücrelerinde 11 Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kullanarak reseptör montaj çalışması etkin floresan etiketi nAChRs, bu stratejiyi kullanmışlardır. Daha yakın zamanlarda, biz Knoc kullandıkk-spektral konfokal mikroskopi 12 üzerinden MSS nöronlarda submicrometer çözünürlükte reseptör ex vivo hassas ölçümü sağlayan α4 nAChR alt birimden (α4YFP) tagged sarı floresan protein ile mühendis farelere yaklaşımı. Hedeflenen flüoresan zincirleme mutasyon wild tip farelerde etiketsiz reseptörlerine göre ifade ve reseptör düzenlenmesi normal seviyede üreten, endojen odağı ve onun doğal arttırıcının kontrolü altında dahil edilir. Bu çarpık yaklaşım floresan diğer iyon kanalları etiketlemek için genişletilmiş ve MSS reseptörleri görselleştirilmesi ve nicel güçlü bir yaklaşım sunuyor olabilir. Bu yazıda kronik nikotin maruz kaldıktan sonra özel MSS nöronlarda nAChR ifade değişikliklerini ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bizim yöntemleri mini ozmotik pompa implantasyonu, intrakardiyak perfüzyon fiksasyon, görüntüleme ve floresan etiketli nikotinik rec analizini içerirden eptor altbirimleri α4YFP knock-in fare (Şekil 1). Biz detaylı doğru α4YFP floresan sinyal elde etmek için autofluoresent sinyali çıkarmak için doğrusal bir spektral Karışmama algoritması ile birlikte bir spektral konfokal mikroskop kullanarak bizim görüntüleme yöntemi tarif sabit beyin tissue.We gelen otofloresans en aza indirmek için fiksasyon tekniği optimize etmiş. Son olarak, hipokampüsün medyal perforant yolu α4YFP reseptörlerinin Kronik nikotin ile endüklenen uyarılması sonuçlarını göstermektedir.

Biz daha iyi bir yaklaşım knock-in ve spektral kullanarak reseptör floresan protein etiketleme dahil yaklaşımların bir arada kullanılarak nikotin bağımlılığı mekanizmalarını anlamak için MSS nöron spesifik alt tiplerinin Subselüler bölgeler içinde nikotinik asetilkolin reseptör değişiklikleri nicel yeni bir teknik geliştirdik konfokal görüntüleme.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Merkezi sinir sistemindeki (MSS) ligand kapılı iyon kanalları, ciddi tıbbi ve sosyal sonuçları olan çok sayıda durumda rol oynamaktadır. ... için

Bu prosedürün genel amacı, kronik nikotin uygulamasıyla fare beynindeki floresanla işaretlenmiş nikotinik reseptörlerdeki değişimleri nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle alpha four YFP knockin farelere salin veya nikotinle doldurulmuş mini ozmotik pompaların implante edilmesiyle gerçekleştirilir. Tedavinin ardından, fareler intra-kardiyak olarak tespit edilir ve beyinleri kriyoseksiyon yöntemiyle kesilir.Ardından, kapağı kaydırılmış beyinler spektral ve fokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Prosedürün son adımı, doğrusal spektral karışım (linear spectral unmixing) ve alfa dört YFP ekspresyon seviyelerinin analizidir. Sonuç olarak veriler, spektral konfokal mikroskobinin ve doğrusal karışımın, kronik nikotine maruz kalmış fare beyni nöronlarında alfa dört YFP nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin artışını submikron çözünürlükte doğru şekilde quantify etme yeteneğini göstermektedir.Bu tekniğin antikor veya radyoligand işaretleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, Y FPS'nin reseptöre bağlanacak şekilde genetik olarak kodlanmış olmasıdır; bu sayede etiketli reseptörün doğrudan ve daha hassas bir şekilde görüntülenmesi sağlanır. Bu durum, MSS nöronlarında res

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, fare ventral hipokampusundaki nikotinik asetilkolin reseptörlerinin nikotin aracılı aktivasyonunun aksonlar boyunca sürekli kalsiyum sinyalizasyonu ile nasıl sonuçlandığını göstermektedir.

Sinaptik Ko-Kültürlerde Ventral Hipokampal Aksonlar Boyunca Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyalinin Görüntülenmesi

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Nikotinik asetilkolin reseptörlerinin (nAChR'ler) aracılı sinaptik iletimin presinaptik mekanizmalarını analiz etmek için doğrudan canlı görüntülemeye izin veren in vitro ventral hipokampal - accumbens devresinin gen-kimerik bir preparatını geliştirdik. Bu hazırlık aynı zamanda sinaptik plastisitenin sinaptik öncesi ve sonrası mekanizmalarını incelemek için bilgilendirici bir yaklaşım sağlar.

Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Bu makalede nikotin uncaging tarafından fare Beyin dilimleri nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChRs) çalışmak için bir yöntem sunar. Eşzamanlı yama kelepçe kayıt ve mikroskobu tarama 2-foton lazer ile birleştiğinde nikotin uncaging nikotinik reseptör işlevi kolinerjik Nörobiyoloji daha derin bir anlayış sağlayan hücresel morfoloji ile bağlanır.

Fare beyin dilim Photoactivatable nikotin lazer Flash Photolysis üzerinden nikotinik asetilkolin reseptör işlevinde sondalama

Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

Bu protokol, memeli Neuro-2a hücre hattı kullanılarak nöronal nikotinik asetilkolin reseptör alt birimlerinin ifadesi ve nicelendirilmesini açıklar. pH duyarlı floresan etiketler ve konfokal mikroskopi, plazma membranındaki reseptör lokalizasyonunun pH-nötr hücre içi bölmelerdeki ekspresyonlarla karşılaştırıldığında hassas bir şekilde değerlendirilmesini sağlar; bu da nAChR taşığı ve farmakolojik modülasyonun incelenmesini kolaylaştırır.

Memeli Hücrelerinde Nicel Görüntüleme Kullanılarak Plazma Zarı ve Hücre İçi Nikotinik Asetilkolin Reseptörlerinin Lokalizasyonu

Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri...

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Doğum sonrası beyincik gelişimi sırasında, germinal bölgeden köken alan olgunlaşmamış granül hücreleri, nihai hedeflerine ulaşmak ve nöronal ağlar kurmak için farklı göç yöntemleri sergilerler. Bu protokol, serebellar kesitlerin hazırlanmasını ve nöronal göçü düzenleyen faktörleri araştırmak için kullanılan konfokal makroskopik yaklaşımı tanımlar.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

Gömme sonrası immünogold yöntemi, spesifik moleküllerin hücre altı lokalizasyonunun yüksek çözünürlüklü analizlerini sağlamanın en etkili yollarından biridir. Burada, retinal şerit sinapslarında glutamat reseptörlerini kantitatif olarak analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Öğrenin, kronik nikotin maruziyetinde fare beynindeki nikotinik asetilkolin reseptörlerindeki değişiklikleri spektral konfokal mikroskopi ve lineer spektral ayrıştırma ile nicel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, bağımlılık mekanizmalarını anlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Kronik Nikotin İdaresi fareler Knock-in içinde floresan etiketli Nikotinik Reseptör Spektral Konfokal Görüntüleme

Daha fazla video keşfet