Name: Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Keşfedin hücre yüzeylerindeki reseptör-ligand etkileşim kinetiğini ölçmek için yapışma frekans testi yöntemini. Fonksiyonelleştirilmiş alyuvarlar sensör olarak kullanılarak bağlanma afinitesi ve off-rate parametreleri analiz edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH hibe programı R01HL091020 R01HL093723, R01AI077343 ve R01GM096187 tarafından desteklenmiştir.

1. Tam kan eritrosit izolasyonu <ol><li> EAS-45 çözümleri hazırlayın. Tablo I tüm malzemeyi tartılır ve 100-200ml DI su içinde çözülür. 1000ml çözüm yapmak ve 8.0 pH ayarlamak için su ekleyin. 50ml Filtre ve kısım. Saklama için -20 ° C'de dondurun. </li></ol> Not: Adım 1.2 Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmış protokol ile, bir hemşire olarak, eğitimli bir tıbbi profesyonel gibi olmalıdır. <ol start="2"><li> , EDTA içeren bir 10ml tüp içine medyan kübital venden kan 3-5ml çizin ve hemen EDTA ile kan hafifçe karıştırın ve iyice pıhtılaşmasını önlemek. </li><li> Süreç kan örneği mümkün olan en kısa sürede. Santrifüj dışında tüm aşağıdaki adımları hazırlık steril tutmak için kaputun altında yapılmalıdır. 50ml santrifüj tüpüne kan transferi 5dk @ 1000rpm, 4 ° C soğuk ve steril 1077 Histopaque ve santrifüj 10ml eklemek Iki kez tekrarlayın. </li><li> 10 ekleml soğuk ve steril PBS, 5min @ 1000rpm için santrifüj, 4 ° C Süpernatantı. 4 kez toplam 5 kez tekrarlayın. </li><li> Iki kez steril EAS-45 (5 dk @ 1000rpm, 4 ° C) yıkayın. Çamaşır hareket eritrositlerde, yeni steril bir 15ml tüpe son sırasında. </li><li> Süspanse edin eritrositlerde in10ml EAS-45. </li></ol> 2. Eritrositlerde biyotinilasyon <ol><li> Adım 1 eritrositlerde tüp alın. 5min @ 1000rpm, 4 ° C için santrifüj sonra tüm süpernatantı Her biri için birkaç flakon eritrositlerde pelet 10μl koyun ve her flakon PBS karşılık gelen miktarı (örneğin altı farklı eritrositlerde biyotinilasyon konsantrasyonlarda hazırlanması Tablo II). </li><li> Tablo II göre taze Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 dilüsyonları olun. </li><li> Her flakon 0.1M borat tampon 10μl ekleyin. </li><li> Hemen hesaplanan her flakon biotin çözüm miktarı (Örnek olarak bkz. Tablo II) ve vorteks ekleyin . </li><li> Her RBC flakon yerleştirin.50ml konik bir tüp ve oda sıcaklığında 30 dakika rotator üzerinde inkübe içinde. </li><li> 2min @ 2000rpm EAS-45 800μl her flakon 3 kere yıkayın. </li><li> EAS-45 4 Her flakon ve saklamak için 100μl ekle ° C Nihai çözüm her 1μl eritrositlerde ~ 1mln olmalıdır. </li></ol> 3. Eritrositlerde biotin bağlantılı ligandlar * Functionalizing <ol><li> 2mg/ml streptavidin çözüm üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Aliqouted çözümü, -20 ° C'de saklanabilir </li><li> Hemen streptavidin çözüm, girdap adım 2.7 (10μl) eritrositlerde eşit miktarda karıştırın ve 30 dakika için 4 rotator üzerinde inkübe ° C </li><li> 2min @ 2000rpm EAS-45 500μl ile 3 kere yıkayın. 15μl EAS-45 / depolama için% 1 BSA ekleyin. </li><li> 20μg/ml ligand çözüm, girdap adım 3.3 (10μl) hemen eritrositlerde eşit miktarda karıştırın ve için rotator oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> , 500μl ile iki kez yıkayın EAS-45 / 1% BSA 2dk @ 2000rpm. Depolama için EAS-45 / 1% BSA 15μl ekle. </li></ol> * Protein biotin bağlantı varsa protein biyotinilasyon için ticari kitler mevcuttur birini (örneğin, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS PEG4 biyotinilasyon Kit) kullanımı ya da gösterildiği gibi bir ara adım olarak biotinlenmiş yakalama antikorlar video. 4. Reseptörü ve ligand yoğunlukları Kantitasyonu <ol><li> Doyurarak konsantrasyonları ile ilgili mAbs farklı bir flakon, reseptör taşıyan hücrelerin oda sıcaklığında 30 dakika için, adım 3 ligand kaplı eritrositlerde inkübe. Ayrı şişeleri hücrelerinde kontrolü için alakasız izotip-uyumlu antikorlar ile inkübe edin. Birincil antikorlar floresan etiketli değilse, üreticinin talimatlarına göre floresan-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. </li><li> Ilgili floresan cal akış cytometery adım 4.1 'de hazırlanan numunelerin analizkullanılarak tespit boncuk. Şekil yoğunluklarını hesaplayınız. 1. </li></ol> 5. Mikropipet ve hücre odası için hazırlık <ol><li> PN-30 Narishige 'Manyetik Cam Mikroelektrod Yatay Çektirme veya Sutter Aletleri Mikropipet Çektirme kullanarak kılcal tüpler mikropipetler çekin. </li><li> Microforge ile mikromanipülatör çekti mikropipet ucu istenen boyutta (genellikle 1-5μm gerekli çap aralıkları çalışmada kullanılmak üzere hücrelerin büyüklüğüne göre) ayarlamak için kullanın. </li><li> Istediğiniz boyuta Mikroskop Kapak Cam keserek hücre odasına hazırlayın. Deneme sırasında ozmolarite değiştirmek için orta buharlaşmasını önlemek için her iki tarafın Madeni Yağ haznesi Seal. </li><li> Reseptör-ligand taşıyan hücreleri odasına ekleyin. </li></ol> 6. Mikropipet yapışma frekans tahlil <ol><li> Ilgili pipetler etkileşim hücreleri aspire ve bilgisayar programlı piezoelectr ic çevirmen kontrollü temas alanı ve süresi ile diğer hücre ile temas içinde ve dışında RBC sürücü. Hücre ayrılması üzerine RBC uzama gözlemleyerek yapışma olayları algılama. </li><li> Belirli bir temas süresi, temas retraksiyon döngüsü 50-100 kez tekrarlayın. Excel elektronik tablonun bir sütununda herhangi bir yapışma için yapışma ya da "0" için "1" ekleyerek gözlenen yapışma olayları kaydedin. Mikroskobik görüntüler için, örneğin, dijital medya ve video kaset kayıt cihazı kullanabilirsiniz. </li><li> Yapışma frekansı karşı temas süresi eğrisi ortalama ve SEM elde etmek için her bir temas süresi için en az üç farklı hücre çiftleri kullanarak kaydedin. </li><li> Kendi özel fonksiyonel abluka mAbs kullanarak ligandlar veya reseptörlerini bloke ilgisiz ligandlar (örneğin BSA) ve / veya kaplanmış eritrositlerde kullanarak kontrol için nonspesifik bağlanma eğrisi kaydedin. , Her temas süresi noktasında spesifik adezyon frekans nonspesifik yapışma frekansı 1 çıkarılması ile hesaplanır . </li></ol>ove_title "&gt; 7 Veri analizi <ol><li> Fit özel yapışma frekansı P ileriye ikinci mertebeden ve birinci dereceden reseptörlerinin tek bir türün ve ligandlar 1 tek bir türün arasında ters, tek adım etkileşimi açıklayan olasılıksal bir model (Denklem 1) karşı temas süresi t veri : <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 1"> K 2B etkili afinitesi, k off off hızı, m r ve m l 4. adımda ölçülen ilgili reseptör ve ligand yoğunlukları vardır, ve c iletişim alanıdır. Eğri-fit, c ve K etkili 2B afinitesi gibi aynı kefeye ve topluca olarak iki parametre, A c K a ve k kapalı, vardır . Off oranı ile ürün etkin 2D oranı: c k = A c K x k kapatır. Spesifik adezyon frekans P çıkarma tarafından ölçülen toplam yapışma (P) 1,21 ölçülür nonspesifik yapışma fraksiyonu (P nonspesifik) hesaplanır: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 2"></li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Integrin α L β 2 nötrofil sitesi yoğunluğu Şekil 1 Belirlenmesi. Nötrofiller ilk Rakamlar 3,4 veya E-selektin-Ig olmadan kullanılan deneysel durumu maç 10dk E-selektin-Ig 1μg/ml ile inkübe ve sonra PE-konjuge anti doyurarak konsantrasyonları (10μg/ml) -insan CD11a mAb (Klon HI111, özel Tablo bakınreaktifler ve ekipman) veya kontrol için alakasız fare IgG1, yıkanmış ve hemen analiz. Numuneler standart QuantiBRITE PE kalibrasyon boncuk BD LSR akış sitometresinde okundu. Panel A, E-selektin-Ig tedavi (mavi renk) veya tedavi edilmemiş hücreleri (yeşil renkli) ile birlikte kalibrasyon boncuk floresan histogramları (pembe) gösterir. Özel CD11a mAb boyama katı eğrileri ve ilgisiz izotip eşleştirilmiş kontrol antikor boyama, noktalı eğriler gösterilmiştir gösterilmiştir. E-selektin-Ig (tüm yıkama adımları ve FACS tampon varlığı) ile muamele edilen hücreler CD11a yoğunluğu tedavi edilmezse hücreleri ile karşılaştırıldığında görüldüğü gibi etkilemedi. Panel B yoğunluğu nicelikleme süreci gösterir. Log10 Masası'nda dört kalibrasyon boncuk histogramlar her tepe değeri ortalama floresan yoğunluğu (FI) için hesaplanmıştır (pembe daireler) ve boncuk başına çok özel PE moleküller için (üretici). Log10 fluoresc karşı boncuk başına Log10 PE moleküllerin lineer regresyonence çizilen oldu. E-selektin ile tedavi edilen hücreler için respectivly 3.99 (mavi katı daire) ve 2.23 (açık mavi daire), özel mAb ve kontrolü antikor, eşit Log10 FI (y ) değerleri. Biz x (değerler Panel B, yeşil ve mavi daireler olarak çizilir) lineer denklem çözüldü x = Log10 PE / PE olarak hücre ve:, nötrofil α L β 2 toplam sayısı mAb oranı 1:1 idi. 9587 olarak hesaplanmıştır. Yüzey yoğunluğu, nötrofil çapı 22 olarak 8.4μm kullanarak, 43 moleküller / mm 2 olarak hesaplanmıştır . ICAM-1 Yoğunluk benzer 65 mol / mikron 2 egale PE-anti-insan CD54 mAb kullanılarak akış cytometery ölçüldü. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Mikropipet sistem şemaları. Bizim mikropipet ev sistemi monte edilmiş ve üç alt sistemlerin oluşan bir görüntüleme alt sistemi bir rec gözlemlemek için izinord ve analiz mikropipet aspire hücre hareketleri, bir hücre odasından hücreleri seçmek için etkinleştirmek için bir mikromanipülasyon alt sistemi, bir basınç alt sistemi bir mikropipetler hücreleri aspire için izin vermek. Görüntüleme alt sistemi merkezi bir 100x immersiyon yağı NA 1.25 amacı ile parça (Olympus IMT-2 IMT2) mikroskop ters. Görüntü, bir şarj çift cihazı (CCD) kamera ile bir video kaset kaydedici gönderilir. Video zamanlayıcısı zaman takip sistemi ile birleştirilir. Her mikropipet mikroskop üzerine monte edilir ve üç eksenli hidrolik mikromanipülatör yerleştirilmiş ince mekanik bir sürücü tarafından manipüle edilebilir. Newport Mekanik manipülatörler de kullanılabilir. Mikropipet sahiplerinden biri, bir piezoelektrik çevirmen üzerine monte edilmiş, sürücü piezo aktüatör için gerilim yükseltici (ev yapımı) ile, bir bilgisayar LabView kodu (istek üzerine) ve DAQ kurulu aracılığıyla sinyal çevirir tarafından kontrol edilir. Bullows bir pipet, tam bir yapışma test döngüsünde ve repeatably taşımak için. Basınç regülasyonu alt sistemi deney sırasında emme kontrol etmek için kullanılır. Hidrolik hat mikropipet tutucu bir sıvı rezervuar bağlanır. A fine mekanik pozisyoner rezervuar yüksekliği tam olarak değiştirilmesine olanak sağlar. Mikropipetler KIMAX erime noktası borosilikat cam kapiller tüplerin (dış çapı 1.0 ± 0.07 mm ve iç çapı 0.7 ± 0.07 mm kullanılarak üretilir. Birincisi, kılcal tüpler mikropipetler PN-30 Narishige 'Manyetik Cam Mikroelektrod Yatay Çektirme kullanarak çekti. (Sutter Aletleri Mikropipet Çektirme başka bir seçenek çektirmesi) İkincisi, Microforge sistemi (dahili evde) istediğiniz boyuta açılış mikropipetler kesmek için kullanılır. Microforge sistemleri Ticari modelleri de mevcuttur. Microsc deney sırasında mikropipetler titreşim önlemek içinyerdir, mikromanipülatörler ile birlikte, bir havalı süspansiyon masaya yerleştirilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 i için yapışma frekans F Koşu özgü (A) ve nonspesifik (B) 1s (kırmızı) bağlayıcı ve 10s (mavi), ICAM-1 (A) veya hIgG ile kaplı eritrositler arasında tekrarlanan yapışma test döngüsü ölçülen temas süresi ( B ) insan nötrofil ifade integrin α L β 2 F = (X 1 + X 2 + ... + X) / i (1 i test döngüsü indeksi ≤ i ≤ n), X i "1" eşittir (yapışma) veya "0" (yapışma) F n (n = 50) yapışma olasılığı için en iyi tahmini olarak kullanılmıştır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 KinetiğiICAM-1 nötrofil integrin α L β 2 bağlama ( <img alt="Kare" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Kare"> .) Ölçülen Yapışma olasılık her temas süresi üç hücre çiftleri için Şekil 3'te gösterildiği gibi ortalama ve temas süresi karşı çizilmiştir. Odanın orta 1mm her Ca 2 + ve Mg 2 + dimerik artı 1μg/ml E-selektin-Ig ile α L β 2 bağlama upregüle HBSS oldu. Eritrositler üzerinde ICAM-1-Ig yakalamak için bir ara adım eritrositlerde streptavidin inkübasyon adımdan sonra 10μg/ml yakalama antikor (biotinlenmiş keçi anti-insan Fc antikoru, eBioscience) ile inkübe eklendi. Nonspesifik bağlayıcı iki farklı koşullar için kontrol etmek için kullanılır: 1) eritrositler ile kaplı değil, anti-insan-Fc yakalama antikoru ile kaplı ve eritrositler için bağlayıcı ICAM-1-Ig (O) ve 2) nötrofil yerine insan IgG ile inkübe (Δ) antikor yakalamak. 10μg/ml insan IgG E bağlayıcı en aza indirmek için orta eklendiRBC yüzeyinde yakalama antikor çözüm-selektin-Ig. Insan IgG kontrol eğrisi olarak kaydedilen Nonspesifik bağlama, belirli bir yapışma olasılığı eğrisi (elde etmek için kullanılan <img alt="Kare" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Kare"> ) Denk. 2. Denklem Montaj özel yapışma olasılığı eğrisi. 1 (düz çizgi) etkili afinitesi c K = 1.4 • 10 -4 μm4 ve k off = 0.3 s -1 döndü. <table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif </th><th> MW (g / mol) </th><th> Konsantrasyon (mM) </th><th> Miktarı (g) </th></tr><tr><td> Adenin </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-glikoz (dekstroz) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat, Dibazik (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> (Tablo 1). EAS-45 tampon hazırlığı (1L ). <table border="1"><tbody><tr><td> DMF 550 ul 25 mg Biotin-XHS </td><td> 0.1M biotin çözümü </td></tr><tr><td> 0.1 biotin w / DMF 01:10 seyreltme </td><td> 0.01m biotin çözümü </td></tr><tr><td> 0.1 biotin w / DMF 1:100 seyreltme </td><td> 0.001M biotin çözümü </td></tr></tbody></table> Tablo 2 biotin çözümün hazırlanması. <table border="1"><tbody><tr><th> biotin final konsantrasyon (mcM) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> Eritrositlerde pelet stoku (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (ul) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0.1M borat tamponu (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.01m biotin çözümü (ul) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0.001M biotin çözümü (ul) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3 eritrositlerde biyotinilasyon.

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li>
<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li>
<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
<li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 Forthcoming.</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li>
<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li>
<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin%3A+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li>
<li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells%2C+particles%2C+and+membrane+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biri, bazı kritik adımları düşünmelisiniz mikropipet yapışma frekans testinin başarılı bir şekilde kullanın. Birincisi, faiz reseptör-ligand sistemi için spesifik etkileşim kayıt emin olun. Nonspesifik kontrol ölçümleri (bkz. Şekil 3, 4) özgüllük sağlar. İdeal olarak, nonspesifik yapışma olasılıkları tüm temas süresi süreler için 0.05 altında olmalı ve her zaman noktası için spesifik ve nonspesifik yapışma olasılıklar arasında anlamlı bir fark var. Çift eritrosit yüzey ligandlar için farklı yöntemler kullanılabilir. Bu ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Kullanmadan önce 1x deiyonize su ile seyreltilir </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Eritrosit izolasyonu </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Eritrosit izolasyonu </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> D-glikoz (dekstroz) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> Sodyum Fosfat, Dibazik (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 hazırlık </td></tr><tr><td> Biotin-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> Eritrositlerde biyotinilasyon </td></tr><tr><td> Dimetilformamid (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> Eritrositlerde biyotinilasyon </td></tr><tr><td> Borat Tampon (0.1M) </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 11455-90 </td><td> Eritrositlerde biyotinilasyon </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Functionalizing Ligand </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Functionalizing Ligand </td></tr><tr><td> Quantibrite PE boncuklar </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Yoğunluk kantifikasyon </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD Immunocytometry Sistemleri </td><td> BD LSR II. </td><td> Yoğunluk quanldirimi </td></tr><tr><td> Kılcal Tüp 0.7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Cam A.Ş. </td><td> 46485-1 </td><td> Mikropipet çekerek </td></tr><tr><td> Madeni Yağ </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Odası montaj </td></tr><tr><td> Mikroskop Kapak Camlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-G </td><td> Odası montaj </td></tr><tr><td> PE α-insan CD11a Klon HI 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Şekil 1 için kimyasalı </td></tr><tr><td> PE anti-insan CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Şekil 1 için kimyasalı </td></tr><tr><td> Fare IgG1 İzotip Kontrol PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Şekil 1 için kimyasalı </td></tr><tr><td> hidrolik mikromanipülatör </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr><tr><td> Mekanik manipülatör </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr><tr><td> piezoelektrik tercümecisi </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Sürüm 8.6 </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr><tr><td> DAQ kurulu </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr><tr><td> Optik tablo </td><td> Kinetik Sistemleri </td><td> 5200 Serisi </td><td> Mikropipet sistemi </td></tr></tbody></table>

yapışma için frekans testi yerinde</emhücre-hücre arayüz Çapraz junctional moleküler etkileşimler> kinetik analizi

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Mikropipet yapışma testinin iki boyutlu (2D) reseptör-ligand bağlayıcı kinetiği 1 ölçmek için 1998 yılında geliştirilmiştir. Tahlil yapışma sensörü ve etkileşen moleküllerin birini sunan hücre gibi bir insan kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanır. RBC, tam kontrol ve bağ oluşumunu sağlamak için diğer etkileşim molekülü ifade başka bir hücre ile temas getirmek için mikromanipülasyon kullanmaktadır. Yapışma olayı birbirinden ayrı iki hücre çekerek üzerine RBC uzama olarak algılanır. RBC yüzeyinde hareketsiz ligandlar yoğunluğu kontrol ederek, yapışma olasılığı 0 ile 1 arasında orta menzilli tutulur. Yapışma olasılığı belirli bir temas süresi için iki hücre arasındaki tekrarlanan temas döngülerinin bir dizi frekans adezyon olaylar tahmin edilmektedir. Zamanla değişen bağlayıcı bir eğri oluşturur. Bağlayıcı reseptör-ligand reaksiyon kinetiği 1 olasılıklı model uydurmaeğrisi 2B yakınlık ve kapatma hızı ile döner. Assay, IgG Fc 1-6, selektinler glycoconjugate ligandlar 6-9 ligandlar 10-13, homotypical kaderin bağlama 14, peptid ana histokompatibilite kompleksleri 15 ile T hücre reseptör ve coreceptor integrinler Fcγ reseptörleri etkileşim ile onaylanmıştır 19. Yöntemi, microtopology 5 membran, membran çapa 2, moleküler oryantasyon ve uzunluğu 6, taşıyıcı sertlik 9, eğrilik 20 ve sıkışma kuvveti 20, yanı sıra biyokimyasal faktörler gibi biyofiziksel faktörler, 2D kinetiği düzenlemeleri ölçmek için kullanılan etkileşen moleküllerin bulunduğu iskeleti ve membran mikroçevresinin ve bu moleküller 15,17,19 yüzey örgütü, modülatörler gibi. Bu yöntem t da kullanılır olmuşturo, değiştirilmiş bir modelini 21 kullanarak çift reseptör-ligand türleri 3,4 aynı anda bağlama, ve 19 trimolecular etkileşimleri çalışma . Yöntemin en büyük avantajı, kendi ana membran ortamda reseptörlerinin çalışma izin vermesidir. Saflaştırılmış reseptörleri 17 kullanılarak elde edilen sonuçlar çok farklı olabilir. Ayrıca reseptör-ligand etkileşimleri de tipik biyokimyasal yöntemlerin ötesinde zamansal çözünürlüğe sahip bir alt-ikinci ölçeğinde çalışma sağlar. Mikropipet yapışma frekans yöntemi göstermek için, α L β 2 etkinleştirmek için çözüm dimerik E-selektin ile nötrofil bağlayıcı eritrositlerde integrin α L β 2 Fonksiyonlu hücrelerarası adezyon molekülü 1 (ICAM-1) kinetik ölçüm göstermektedir.

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Mikropipet adezyon testi, iki boyutlu (2D) reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ölçmek amacıyla 1998 yılında geliştirilmiştir1. Testte insan eritrositleri...

Bu deneyin genel amacı, her iki molekülün de etkileşime giren hücrelerin yüzeylerine sabitlendiği durumlarda reseptör ligand etkileşim kinetiğini ölçmektir. Bu, öncelikle adezyon sensörleri olan eritrositlerin ligandlarla fonksiyonelleştirilmesi ve reseptör taşıyan hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, mikro pipet odası kurulur ve adezyon olaylarını kaydetmek için adezyon testleri uygulanır.Ardından, hücre temas süresine karşı yapışma olasılığı eğrisi çizilir ve model ile uydurulur. Kinetik parametreleri tahmin etmek amacıyla, verilerden kestirilen iki boyutlu efektif bağlanma afinitesi ve ayrılma hızını gösteren sonuçlar elde edilir. Peki, bu analiz fikri nereden çıktı?Araştırmacılar reseptör ligand etkileşimlerini incelemektedir. Çoğunlukla kopma kuvvetleri ölçülmektedir ve biz de benzer bir işlem yapıyoruz; ancak bir gün, sadece yapışma yokluğu için sıfır ve yapışma için bir şeklinde ikili bir sonucu ölçüp ölçemeyeceğimizi ve mikro pipet frekans analizini göstermek için kinetik ölçümlerini bu sıfır bir ölçümlerinden türetip türetemeyeceğimizi düşündük. Laboratuvarımın araştırma bilimcilerinden Dr. Veronica Zana Zina, deneyi size gösterecektir.Adhezyon frekansı testi için tam kandan izole edilen eritrositler biyotinillenir. Bu prosedüre başlamak için, izole edilmiş eritrositleri içeren tüpü santrifüjleyin, eritrosit peletinden 10 µL'lik porsiyonları birkaç farklı tüpe paylaştırın ve çoklu eritrosit biyotinilasyon konsantrasyonları hazırlamak için her tüpe uygun miktarda PBS ekleyin. Ardından, her tüpe 10 µL 0,1 molar borat tamponu ekleyin.Ardından, her tüpe hesaplanmış miktarda biotin çözeltisi ekleyin ve hemen vorteksleyin. Her bir kırmızı kan hücresi tüpünü birkaç saniye boyunca 50 mililitrelik konik bir tüpün içine yerleştirin ve bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin; 30 dakika sonra, her tüpe EAS 45 tamponu ekleyin ve dakikada 2000 rotasyon hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. EAS 45 tamponu ile yıkama işlemini, toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.Son olarak, her tüpe 100 µL EAS 45 tamponu ekleyin ve önceki adımda aktive edilen kırmızı kan hücresi yüzeyindeki ligandları fonksiyonelleştirmek için dört santigrat derecede saklayın; kırmızı kan hücreleri, doymuş konsantrasyondaki strep TTR ile dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edilir ve EAS 45 tamponu ile 2000 devir/dakika hızında iki dakika boyunca üç kez yıkanır. Bundan sonra, kırmızı kan hücrelerini doğrudan biyotinize ligand ile inkübe edin veya kırmızı kan hücrelerini önce ilgili biyotinize yakalama antikoru ile, ardından ligandlarla inkübe edin. Bu videoda gösterilen protokolde biyotinize yakalama antikoru kullanılmıştır.Mikropipetler, yüksek erime noktasına sahip borosilikat cam kılcal tüpler kullanılarak yapılır. Öncelikle, kılcal tüpleri çekmek için bir mikropipet çekici kullanın. Ardından, mikropipetin ucunu istenen açıklık boyutuna getirmek için bir mikro dövme düzeneğine sahip mikro manipülatör kullanın.Gerekli çap, genellikle çalışmada kullanılacak hücrelerin boyutuna bağlı olarak bir ila beş mikron arasında değişir. Hücre odasını hazırlamak için, istenen boyutta kesilmiş iki adet mikroskop lamel parçası kullanın, lameller üzerindeki tozu bir hava püskürtücü ile temizleyin, hücre odası besiyerini ekleyin ve besiyerinin buharlaşmasını önlemek için odanın her iki tarafını mineral yağ kullanarak mühürleyin. Aksi takdirde, deney sırasında osmolarite değişecektir.Bu analizde kullanılan mikro pipet sistemi üç alt sistemden oluşmaktadır: mikro pipetle aspire edilen hücrelerin hareketlerini gözlemlemek, kaydetmek ve analiz etmek için bir görüntüleme alt sistemi, hücre odasından hücre seçimini sağlamak için bir mikro-manipülasyon alt sistemi ve hücreleri mikro pipetlere aspire etmek için bir basınç alt sistemi. Görüntüleme alt sisteminin merkezinde, 100 kat yağ daldırma objektifli bir ters mikroskop yer alır. Objektif görüntüleri, bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tarafından algılanır ve bir video kaset kaydediciye gönderilir.Süreyi takip etmek için sisteme bir video zamanlayıcı bağlanmıştır. Mikro pipet deiyonize su ile doldurulduktan sonra, mikroskoba monte edilmiş mekanik bir sürücü üzerindeki tutucusuna yerleştirin. Mikro pipet, üç eksenli hidrolik bir mikro manipülatör ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir.Mikropipet tutuculardan biri, bilgisayar programlı piezoelektrik bir çeviriciye monte edilmiştir. Bu, pipetin hassas bir şekilde ve bir adezyon testi döngüsü içinde hareket ettirilmesine olanak tanır. Basınç düzenleme alt sistemi ise vakumu kontrol etmek için kullanılır.Deney sırasında, hidrolik bir hat mikro pipet tutucusunu bir sıvı rezervuarına bağlar. Hassas bir mekanik konumlandırıcı, rezervuar yüksekliğinin kesin bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır. Hazne monte edildikten sonra, mikro pipetler ayarlanır, analize başlamak için hücreler hazneye enjekte edilir, etkileşen hücreler ilgili pipetlerle aspire edilir ve kırmızı kan hücresini, kontrollü temas alanı ve süresiyle nötrofil ile temas ettirmek veya teması kesmek için PSO elektrikli translatör kullanılır.Kırmızı kan hücresinin hücre ayrılması sırasında uzaması durumunda bir adezyon olayı gözlemlenmiş sayılır; kırmızı kan hücresinin uzamadığı durumlar ise adezyon gerçekleşmediği anlamına gelir. Gözlemlenen adezyon olaylarını, bir Excel hesap tablosunun sütununa adezyon için bir veya adezyon gerçekleşmediği durumlar için sıfır ekleyerek kaydedin.Her bir temas süresi için en az üç farklı hücre çifti kullanarak yapışma frekansı ile temas süresi eğrisini kaydedin. Kontrol olarak bir ortalama ve SEM elde etmek için, ilgili ligandlarla kaplanmış kırmızı kan hücrelerini kullanarak veya ligandları ya da reseptörleri spesifik fonksiyonel blokajları ile bloke ederek non-spesifik bağlanma eğrisini kaydedin. Monoklonal antikorlar, her bir temas süresi noktasındaki spesifik yapışma frekansı, non-spesifik yapışma frekansının çıkarılmasıyla hesaplanabilir.Spesifik yapışma frekansına karşı temas süresi verileri, tek bir reseptör türü ile tek bir ligand türü arasındaki ikinci dereceden ileri ve birinci dereceden geri tek adımlı etkileşimi tanımlayan olasılıksal bir model ile uydurulmuştur; bu denklemde KA, 2D afinitesini, Kd ise 2D ayrılma hızını temsil eder.MR ve ML sırasıyla reseptör ve ligand yoğunluklarıdır ve AC temas alanıdır. Eğri uydurmasında ac, k, a ve K off parametreleri bulunur; AC ve KA birlikte gruplandırılarak toplu olarak efektif 2D afinitesi olarak adlandırılır ve bunun ayrılma hızı (off rate) ile çarpımı efektif 2D bağlanma hızıdır (on rate) AC K on eşittir AC KA çarpı K off. Burada integrin alfa L beta iki tayinine dair bir örnek gösterilmiştir.Nötrofiller üzerindeki bölge yoğunluğu. Nötrofiller önce mililitre başına bir mikrogram E selektin IG ile inkübe edilmiş, ardından doyurma konsantrasyonlarında PE konjuge anti-insan CD 11, monoklonal bir antikor veya kontrol olarak ilgili fare IgG 1 ile inkübe edilmiştir. 30 dakikalık inkübasyonun ardından örnekler yıkanmış ve standart ayarlarda bir akış sitometresinde okunmuştur.Parlak PE kalibrasyon boncukları. Panel A, kalibrasyon boncuklarının floresan histogramlarını, E selectin IG ile işlem görmüş veya işlem görmemiş hücrelerin histogramlarıyla birlikte göstermektedir. Spesifik CD 11 A monoklonal antikor boyaması düz çizgilerle ve ilgili izotip eşleşmeli kontrol antikor boyaması ise noktalı çizgilerle gösterilmiştir.Panel B, yoğunluk nicelleştirme sürecini göstermektedir. Dört boncuğun her birinin ortalama floresan yoğunluğu için Log 10 hesaplanmıştır. Panel A'dan kalibrasyon pik değeri ve lota özgü boncuk başına PE molekül sayısı kullanılmıştır.İçeri sızmış hücrelerin yeniden seçimi için, boncuk başına log 10 PE molekülü ile log 10 floresans değerleri arasında doğrusal bir regresyon grafiği çizilmiştir. Spesifik monoklonal antikor için log 10 fi değeri mavi dolu daire ile 3,99; kontrol antikoru için ise mavi boş daire ile 2,23 olarak belirtilmiştir. X için doğrusal denklem çözüldüğünde, toplam alfa L beta iki veya nötrofil sayısı 9.587 olarak hesaplanmıştır.Nötrofil çapı 8,4 µm olarak kullanılarak yüzey yoğunluğu mikron kare başına 43 bölge olarak hesaplandı. Bir sonraki grafik, bir saniye ve 10 saniyedeki spesifik bağlanma için anlık adezyon frekansını fi göstermektedir. ICAM-1 kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta iki eksprese eden insan nötrofilleri arasında tekrarlanan adezyon testi döngülerinden ölçülen temas süreleri.Buna karşılık burada, insan IgG kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta iki eksprese eden insan nötrofilleri arasında tekrarlanan adhezyon test döngülerinden ölçülen, bir saniyelik ve on saniyelik temas sürelerindeki spesifik olmayan bağlanma için koşan adhezyon frekansı fi gösterilmiştir. Bu son grafik, I A one'ın nötrofil integrin alfa L beta ikiye bağlanma kinetiğini göstermektedir; her temas süresi için üç hücre çifti için ölçülen adhezyon olasılıklarının ortalaması alınmış ve spesifik olmayan bağlanmayı kontrol etmek için temas süresine karşı grafiğe dökülmüştür. İki farklı koşul kullanılmıştır.Anti-TFC yakalama antikoru ile kaplanmış ve ICAM-1 IG yerine insan IgG ile inkübe edilmiş kırmızı kan hücreleri ve yakalama antikoru ile kaplanmamış kırmızı kan hücrelerine bağlanan nötrofiller. Spesifik bir adezyon olasılığı eğrisi elde etmek için insan IgG kontrol eğrisi olarak kaydedilen spesifik olmayan bağlanma kullanılmıştır. Spesifik olmayan bağlanma düzeltmesi için daha önce gösterilen denklem kullanılmıştır.Düzeltilmiş spesifik adhezyon olasılığı eğrisi, model uyumu ile fit edildi. Spesifik adhezyon olasılığı eğrisi, efektif bağlanma afinitesini verdi. CKA 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴ ve koff 0,3 s⁻¹ değerlerine eşittir.Bu videoyu izledikten sonra, her iki molekülün de etkileşime giren hücrelerin yüzeylerine demirlendiği durumlarda reseptör ligand etkileşim kinetiğinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, ilk çalışmalarda ligand yüzey yoğunluklarının, adezyon frekansının orta seviyelerde kalacağı şekilde ayarlanması gerektiğini unutmamak önemlidir; ayrıca kanla ve spesifik tedavi bölgeleriyle, örneğin sodyum azide ve DMSO gibi maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, reaktiflerin MSDS belgelerinin dikkatlice okunması ve prosedür uygulanırken eldiven takılması gibi önlemler gereklidir.

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Burada, iki çift proteomik teknikleri, yani Elektroforez (2DE) ve kütle spektrometrisi (MS) 2 boyutlu, diferansiyel primer örnekleri, iki veya daha fazla grup arasından / translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinler olarak ifade teşhis edilmesi için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, birbirine işlevsel deneyler ile, prognostik parametreler / terapötik hedeflerin tanımlanması ve karakterizasyonu sağlar.

Protein fonksiyonu için bir 2DE-Jel Spot: Kronik Lenfositik Lösemide HS1 öğrendim Ders

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Keşfedin hücre yüzeylerindeki reseptör-ligand etkileşim kinetiğini ölçmek için yapışma frekans testi yöntemini. Fonksiyonelleştirilmiş alyuvarlar sensör olarak kullanılarak bağlanma afinitesi ve off-rate parametreleri analiz edilir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi

Daha fazla video keşfet