Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi

Bu deneyin genel amacı, her iki molekülün de etkileşime giren hücrelerin yüzeylerine sabitlendiği durumlarda reseptör ligand etkileşim kinetiğini ölçmektir. Bu, öncelikle adezyon sensörleri olan eritrositlerin ligandlarla fonksiyonelleştirilmesi ve reseptör taşıyan hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, mikro pipet odası kurulur ve adezyon olaylarını kaydetmek için adezyon testleri uygulanır.

Ardından, hücre temas süresine karşı yapışma olasılığı eğrisi çizilir ve model ile uydurulur. Kinetik parametreleri tahmin etmek amacıyla, verilerden kestirilen iki boyutlu efektif bağlanma afinitesi ve ayrılma hızını gösteren sonuçlar elde edilir. Peki, bu analiz fikri nereden çıktı?

Araştırmacılar reseptör ligand etkileşimlerini incelemektedir. Çoğunlukla kopma kuvvetleri ölçülmektedir ve biz de benzer bir işlem yapıyoruz; ancak bir gün, sadece yapışma yokluğu için sıfır ve yapışma için bir şeklinde ikili bir sonucu ölçüp ölçemeyeceğimizi ve mikro pipet frekans analizini göstermek için kinetik ölçümlerini bu sıfır bir ölçümlerinden türetip türetemeyeceğimizi düşündük. Laboratuvarımın araştırma bilimcilerinden Dr. Veronica Zana Zina, deneyi size gösterecektir.

Adhezyon frekansı testi için tam kandan izole edilen eritrositler biyotinillenir. Bu prosedüre başlamak için, izole edilmiş eritrositleri içeren tüpü santrifüjleyin, eritrosit peletinden 10 µL'lik porsiyonları birkaç farklı tüpe paylaştırın ve çoklu eritrosit biyotinilasyon konsantrasyonları hazırlamak için her tüpe uygun miktarda PBS ekleyin. Ardından, her tüpe 10 µL 0,1 molar borat tamponu ekleyin.

Ardından, her tüpe hesaplanmış miktarda biotin çözeltisi ekleyin ve hemen vorteksleyin. Her bir kırmızı kan hücresi tüpünü birkaç saniye boyunca 50 mililitrelik konik bir tüpün içine yerleştirin ve bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin; 30 dakika sonra, her tüpe EAS 45 tamponu ekleyin ve dakikada 2000 rotasyon hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. EAS 45 tamponu ile yıkama işlemini, toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.

Son olarak, her tüpe 100 µL EAS 45 tamponu ekleyin ve önceki adımda aktive edilen kırmızı kan hücresi yüzeyindeki ligandları fonksiyonelleştirmek için dört santigrat derecede saklayın; kırmızı kan hücreleri, doymuş konsantrasyondaki strep TTR ile dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edilir ve EAS 45 tamponu ile 2000 devir/dakika hızında iki dakika boyunca üç kez yıkanır. Bundan sonra, kırmızı kan hücrelerini doğrudan biyotinize ligand ile inkübe edin veya kırmızı kan hücrelerini önce ilgili biyotinize yakalama antikoru ile, ardından ligandlarla inkübe edin. Bu videoda gösterilen protokolde biyotinize yakalama antikoru kullanılmıştır.

Mikropipetler, yüksek erime noktasına sahip borosilikat cam kılcal tüpler kullanılarak yapılır. Öncelikle, kılcal tüpleri çekmek için bir mikropipet çekici kullanın. Ardından, mikropipetin ucunu istenen açıklık boyutuna getirmek için bir mikro dövme düzeneğine sahip mikro manipülatör kullanın.

Gerekli çap, genellikle çalışmada kullanılacak hücrelerin boyutuna bağlı olarak bir ila beş mikron arasında değişir. Hücre odasını hazırlamak için, istenen boyutta kesilmiş iki adet mikroskop lamel parçası kullanın, lameller üzerindeki tozu bir hava püskürtücü ile temizleyin, hücre odası besiyerini ekleyin ve besiyerinin buharlaşmasını önlemek için odanın her iki tarafını mineral yağ kullanarak mühürleyin. Aksi takdirde, deney sırasında osmolarite değişecektir.

Bu analizde kullanılan mikro pipet sistemi üç alt sistemden oluşmaktadır: mikro pipetle aspire edilen hücrelerin hareketlerini gözlemlemek, kaydetmek ve analiz etmek için bir görüntüleme alt sistemi, hücre odasından hücre seçimini sağlamak için bir mikro-manipülasyon alt sistemi ve hücreleri mikro pipetlere aspire etmek için bir basınç alt sistemi. Görüntüleme alt sisteminin merkezinde, 100 kat yağ daldırma objektifli bir ters mikroskop yer alır. Objektif görüntüleri, bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera tarafından algılanır ve bir video kaset kaydediciye gönderilir.

Süreyi takip etmek için sisteme bir video zamanlayıcı bağlanmıştır. Mikro pipet deiyonize su ile doldurulduktan sonra, mikroskoba monte edilmiş mekanik bir sürücü üzerindeki tutucusuna yerleştirin. Mikro pipet, üç eksenli hidrolik bir mikro manipülatör ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir.

Mikropipet tutuculardan biri, bilgisayar programlı piezoelektrik bir çeviriciye monte edilmiştir. Bu, pipetin hassas bir şekilde ve bir adezyon testi döngüsü içinde hareket ettirilmesine olanak tanır. Basınç düzenleme alt sistemi ise vakumu kontrol etmek için kullanılır.

Deney sırasında, hidrolik bir hat mikro pipet tutucusunu bir sıvı rezervuarına bağlar. Hassas bir mekanik konumlandırıcı, rezervuar yüksekliğinin kesin bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır. Hazne monte edildikten sonra, mikro pipetler ayarlanır, analize başlamak için hücreler hazneye enjekte edilir, etkileşen hücreler ilgili pipetlerle aspire edilir ve kırmızı kan hücresini, kontrollü temas alanı ve süresiyle nötrofil ile temas ettirmek veya teması kesmek için PSO elektrikli translatör kullanılır.

Kırmızı kan hücresinin hücre ayrılması sırasında uzaması durumunda bir adezyon olayı gözlemlenmiş sayılır; kırmızı kan hücresinin uzamadığı durumlar ise adezyon gerçekleşmediği anlamına gelir. Gözlemlenen adezyon olaylarını, bir Excel hesap tablosunun sütununa adezyon için bir veya adezyon gerçekleşmediği durumlar için sıfır ekleyerek kaydedin.

Her bir temas süresi için en az üç farklı hücre çifti kullanarak yapışma frekansı ile temas süresi eğrisini kaydedin. Kontrol olarak bir ortalama ve SEM elde etmek için, ilgili ligandlarla kaplanmış kırmızı kan hücrelerini kullanarak veya ligandları ya da reseptörleri spesifik fonksiyonel blokajları ile bloke ederek non-spesifik bağlanma eğrisini kaydedin. Monoklonal antikorlar, her bir temas süresi noktasındaki spesifik yapışma frekansı, non-spesifik yapışma frekansının çıkarılmasıyla hesaplanabilir.

Spesifik yapışma frekansına karşı temas süresi verileri, tek bir reseptör türü ile tek bir ligand türü arasındaki ikinci dereceden ileri ve birinci dereceden geri tek adımlı etkileşimi tanımlayan olasılıksal bir model ile uydurulmuştur; bu denklemde KA, 2D afinitesini, Kd ise 2D ayrılma hızını temsil eder.

MR ve ML sırasıyla reseptör ve ligand yoğunluklarıdır ve AC temas alanıdır. Eğri uydurmasında ac, k, a ve K off parametreleri bulunur; AC ve KA birlikte gruplandırılarak toplu olarak efektif 2D afinitesi olarak adlandırılır ve bunun ayrılma hızı (off rate) ile çarpımı efektif 2D bağlanma hızıdır (on rate) AC K on eşittir AC KA çarpı K off. Burada integrin alfa L beta iki tayinine dair bir örnek gösterilmiştir.

Nötrofiller üzerindeki bölge yoğunluğu. Nötrofiller önce mililitre başına bir mikrogram E selektin IG ile inkübe edilmiş, ardından doyurma konsantrasyonlarında PE konjuge anti-insan CD 11, monoklonal bir antikor veya kontrol olarak ilgili fare IgG 1 ile inkübe edilmiştir. 30 dakikalık inkübasyonun ardından örnekler yıkanmış ve standart ayarlarda bir akış sitometresinde okunmuştur.

Parlak PE kalibrasyon boncukları. Panel A, kalibrasyon boncuklarının floresan histogramlarını, E selectin IG ile işlem görmüş veya işlem görmemiş hücrelerin histogramlarıyla birlikte göstermektedir. Spesifik CD 11 A monoklonal antikor boyaması düz çizgilerle ve ilgili izotip eşleşmeli kontrol antikor boyaması ise noktalı çizgilerle gösterilmiştir.

Panel B, yoğunluk nicelleştirme sürecini göstermektedir. Dört boncuğun her birinin ortalama floresan yoğunluğu için Log 10 hesaplanmıştır. Panel A'dan kalibrasyon pik değeri ve lota özgü boncuk başına PE molekül sayısı kullanılmıştır.

İçeri sızmış hücrelerin yeniden seçimi için, boncuk başına log 10 PE molekülü ile log 10 floresans değerleri arasında doğrusal bir regresyon grafiği çizilmiştir. Spesifik monoklonal antikor için log 10 fi değeri mavi dolu daire ile 3,99; kontrol antikoru için ise mavi boş daire ile 2,23 olarak belirtilmiştir. X için doğrusal denklem çözüldüğünde, toplam alfa L beta iki veya nötrofil sayısı 9.587 olarak hesaplanmıştır.

Nötrofil çapı 8,4 µm olarak kullanılarak yüzey yoğunluğu mikron kare başına 43 bölge olarak hesaplandı. Bir sonraki grafik, bir saniye ve 10 saniyedeki spesifik bağlanma için anlık adezyon frekansını fi göstermektedir. ICAM-1 kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta iki eksprese eden insan nötrofilleri arasında tekrarlanan adezyon testi döngülerinden ölçülen temas süreleri.

Buna karşılık burada, insan IgG kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta iki eksprese eden insan nötrofilleri arasında tekrarlanan adhezyon test döngülerinden ölçülen, bir saniyelik ve on saniyelik temas sürelerindeki spesifik olmayan bağlanma için koşan adhezyon frekansı fi gösterilmiştir. Bu son grafik, I A one'ın nötrofil integrin alfa L beta ikiye bağlanma kinetiğini göstermektedir; her temas süresi için üç hücre çifti için ölçülen adhezyon olasılıklarının ortalaması alınmış ve spesifik olmayan bağlanmayı kontrol etmek için temas süresine karşı grafiğe dökülmüştür. İki farklı koşul kullanılmıştır.

Anti-TFC yakalama antikoru ile kaplanmış ve ICAM-1 IG yerine insan IgG ile inkübe edilmiş kırmızı kan hücreleri ve yakalama antikoru ile kaplanmamış kırmızı kan hücrelerine bağlanan nötrofiller. Spesifik bir adezyon olasılığı eğrisi elde etmek için insan IgG kontrol eğrisi olarak kaydedilen spesifik olmayan bağlanma kullanılmıştır. Spesifik olmayan bağlanma düzeltmesi için daha önce gösterilen denklem kullanılmıştır.

Düzeltilmiş spesifik adhezyon olasılığı eğrisi, model uyumu ile fit edildi. Spesifik adhezyon olasılığı eğrisi, efektif bağlanma afinitesini verdi. CKA 1,4 × 10⁻⁴ µm⁴ ve koff 0,3 s⁻¹ değerlerine eşittir.

Bu videoyu izledikten sonra, her iki molekülün de etkileşime giren hücrelerin yüzeylerine demirlendiği durumlarda reseptör ligand etkileşim kinetiğinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, ilk çalışmalarda ligand yüzey yoğunluklarının, adezyon frekansının orta seviyelerde kalacağı şekilde ayarlanması gerektiğini unutmamak önemlidir; ayrıca kanla ve spesifik tedavi bölgeleriyle, örneğin sodyum azide ve DMSO gibi maddelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, reaktiflerin MSDS belgelerinin dikkatlice okunması ve prosedür uygulanırken eldiven takılması gibi önlemler gereklidir.