Yapışma için Frekans Testi Yerinde Kinetik Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, her iki molekül de etkileşen hücrelerin yüzeylerine sabitlendiğinde reseptör ligand etkileşim kinetiğini ölçmektir. Bu, ilk olarak, ligandlarla yapışma sensörleri olan kırmızı kan hücrelerinin işlevselleştirilmesi ve reseptör taşıyan hücrelerin hazırlanması ile sağlanır. İkinci adım olarak, mikro pipet haznesi monte edilir ve yapışma olaylarını kaydetmek için yapışma testleri yapılır.

Daha sonra, hücrelerin temas süresi eğrisine karşı yapışma olasılığı çizilir ve modele uydurulur. Kinetik parametrelerin tahminini yapabilmek için verilerden tahmin edilen iki boyutlu etkin bağlanma afinitesi ve off rate gösteren sonuçlar elde edilmektedir. Peki bu tahlil fikrini nereden alacağız?

İnsanlar reseptör bacak etkileşimini inceler. Çoğunlukla kopma kuvvetlerini ölçüyoruz ve biz de aynı şeyi yapıyoruz, ancak bir gün sadece yapışma olmaması için sıfır ve yapışma için bir ikili sonucu ölçebilir miyiz diye düşündük ve mikro boru frekans tahlilini göstermek için bu sıfır bir ölçümlerinden kinetik ölçümü türetebilir miyiz? Laboratuvarımın bir araştırma bilimcisi olan Dr.Veronica Zana Zina, deneyi size gösterecek.

Tam kandan izole edilen kırmızı kan hücreleri, yapışma sıklığı tayini için biyotinile edilir. Bu prosedüre başlamak için, izole edilmiş kırmızı kan hücreleri içeren tüpü santrifüjleyin, birkaç şişenin her birine 10 mikrolitre kırmızı kan hücresi peleti alın ve birden fazla kırmızı kan hücresi biyotin elasyon konsantrasyonu hazırlamak için her şişeye karşılık gelen miktarda PBS ekleyin. Daha sonra, her şişeye 10 mikrolitre 0.1 molar delikli sekiz tampon ekleyin.

Daha sonra her bir şişeye hesaplanan miktarda biyotin çözeltisi ekleyin ve hemen girdap yapın. Birkaç saniye boyunca, her bir kırmızı kan hücresi şişesini 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve 30 dakika sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin, her şişeye EAS 45 tamponu ekleyin ve dakikada 2000 dönüşte iki dakika santrifüjleyin. Toplam üç yıkama için EAS 45 tamponu ile yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Son olarak, her şişeye 100 mikrolitre EAS 45 tamponu ekleyin ve kırmızı kan hücresi yüzeyindeki ligandları işlevsel hale getirmek için dört santigrat derecede saklayın, önceki adımda inasyona tabi tutulduğunda, kırmızı kan hücreleri doymuş bir strep TTR konsantrasyonu ile dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edilir ve dakikada 2000 dönüşte iki dakika boyunca EAS 45 tamponu ile üç kez yıkanır. Bundan sonra, kırmızı kan hücrelerini doğrudan biyotinile ligand ile inkübe edin veya kırmızı kan hücrelerini karşılık gelen biyotinile yakalama antikoru ile inkübe edin ve ardından ligandlarla inkübe edin. Bu videoda gösterilen protokol, biyotinile yakalama antikorunu kullanır.

Mikropipetler, balta erime noktası bo silikat cam kılcal tüpler kullanılarak yapılır. Önce kılcal boruları çekmek için bir mikro pipet çektirmesi kullanın. Ardından, mikro pipetin ucunu istenen boyuttaki açıklığa kesmek için mikro dövmeli bir mikro manipülatör kullanın.

Gerekli çap, çalışmada kullanılacak hücrelerin boyutuna bağlı olarak genellikle bir ila beş mikron arasında değişir. Hücre odasını hazırlamak için, istenen boyutta kesilmiş iki parça mikroskop kapak camı kullanın, kapak kızaklarındaki tozu bir hava silgi ile temizleyin, hücre odası ortamını ekleyin ve ortamın buharlaşmasını önlemek için her iki taraftan mineral yağ kullanarak odayı kapatın. Bu, deney sırasında ozmolariteyi değiştirecektir.

Bu tahlilde kullanılan mikro pipet sistemi, mikro pipet aspire edilmiş hücrenin hareketlerini gözlemlemek, kaydetmek ve analiz etmek için bir görüntüleme alt sistemi, hücre odasından hücre seçimini sağlamak için bir mikro manipülasyon alt sistemi ve hücreleri mikro pipetlere aspire etmek için bir basınç alt sistemi olmak üzere üç alt sistemden oluşur. Görüntüleme alt sisteminin merkezi parçası, 100 kat yağa daldırılan ters çevrilmiş bir mikroskoptur. Objektif görüntüler, bir şarj çifti cihaz kamerası tarafından algılanır ve bir video kaset kaydediciye gönderilir.

Zamanı takip etmek için sisteme bir video zamanlayıcı bağlanmıştır. Mikro pipeti deiyonize su ile doldurduktan sonra, mikroskop üzerine monte edilmiş mekanik bir sürücü üzerindeki tutucusuna yerleştirin. Mikro pipet, üç eksenli bir hidrolik mikrom manipülatörü ile hassas bir şekilde konumlandırılabilir.

Mikro pipet tutuculardan biri, bilgisayar programlı bir piezoelektrik çeviriciye monte edilmiştir. Bu, pipetin hassas bir şekilde ve bir yapışma testi döngüsünde hareket ettirilmesini sağlar. Basınç düzenleme alt sistemi, emmeyi kontrol etmek için kullanılır.

Deney sırasında, bir hidrolik hat, mikropipet tutucuyu bir sıvı haznesine bağlar. İnce bir mekanik konumlandırıcı, rezervuarın yüksekliğinin hassas bir şekilde manipüle edilmesini sağlar. Hazne monte edildikten sonra, bir mikro pipet ayarlanır, tahlili başlatmak için hücreleri hazneye enjekte edin, etkileşime giren hücreleri ilgili pipetlerle aspire edin ve kırmızı kan hücresini nötrofil ile kontrollü temas alanı ve süresi ile temas halinde sürmek için PSO elektrikli tercümanı kullanın.

Kırmızı kan hücresi hücre ayrılması üzerine uzadığında bir adian olayı gözlenir, yapışma olmaması olayı kırmızı kan hücresi uzamasına karşılık gelmez. Gözlenen yapışma olaylarını, yapışma için bir tane veya yapışma olmaması için sıfır ekleyerek kaydedin. Excel elektronik tablosunun bir sütununda.

Her temas süresi için en az üç farklı hücre çifti kullanarak yapışma frekansına karşı temas süresi eğrisine karşı kaydedin. Kontrol olarak bir ortalama ve SEM elde etmek için, ilgili bir ligandla kaplanmış kırmızı kan hücrelerini kullanarak ve/veya spesifik fonksiyonel blokajlarını kullanarak ligandları veya reseptörleri bloke ederek spesifik olmayan bağlanma eğrisini kaydedin. Monoklonal antikorlar, her bir temas zaman noktasındaki spesifik adezyon frekansı, spesifik olmayan adezyon frekansının uzaklaştırılmasıyla hesaplanabilir.

Spesifik yapışma frekansına karşı temas süresi verileri, ikinci dereceden ileri ve birinci dereceden tanımlayan olasılıksal bir model tarafından uydurulur. Bu denklemde tek bir reseptör türü ile tek bir ligand türü arasındaki ters tek adımlı etkileşim, KA 2B afinitesidir. KA, 2D kapalı oranıdır.

MR ve ML ilgili reseptör ve ligand yoğunluklarıdır ve AC temas alanıdır. Eğri uyumunun iki parametresi vardır, ac ve k, a ve K kapalı, çünkü AC ve KA bir araya toplanır ve topluca etkili 2D afinitesi olarak adlandırılır, kapalı oranlı ürünü, AC K üzerindeki oranın etkili 2D'sidir, AC KA çarpı K kapalıdır. Burada gösterilen, integrin alfa L beta iki'nin belirlenmesine bir örnektir.

Nötrofiller üzerindeki bölge yoğunluğu. Nötrofiller ilk olarak, mililitre başına bir mikrogram E selektin IG inkübe edildi ve daha sonra kontrol olarak PE konjuge anti-insan CD 11, bir monoklonal antikor veya ilgili bir fare IgG konsantrasyonlarını doyurdu. 30 dakika sonra inkübasyon örnekleri yıkandı ve standart miktarda bir akış sitometresinde okundu.

Parlak PE kalibrasyon boncukları. Panel A, E selektin IG ile muamele edilmiş veya muamele edilmemiş hücrelerin histogramları ile birlikte kalibrasyon boncuklarının floresan histogramlarını gösterir. Spesifik CD 11 Bir monoklonal antikor boyaması katı eğrilerde gösterilir ve ilgili izotip eşleşme kontrol antikor boyaması noktalı eğrilerde gösterilir.

Panel B, yoğunluk ölçümü sürecini gösterir. Log 10, dört boncuğun her birinin ortalama floresan yoğunluğu için hesaplandı. Panel A'dan ve boncuk başına partiye özgü PE molekülleri için kalibrasyon tepe değeri.

Boncuk başına log 10 PE molekülünün log 10 floresansına karşı doğrusal bir regresyonu, izinsiz giren hücrelerin yeniden seçilmesi için çizildi. Log 10 fi, spesifik monoklonal antikor ve kontrol antikoru için sırasıyla mavi katı daire ile gösterilen 3.99'a ve mavi açık daire ile gösterilen 2.23'e eşittir. X için doğrusal denklem çözüldüğünde, alfa L beta iki veya nötrofillerin toplam sayısı 9.587 olarak hesaplandı.

Yüzey yoğunluğu, nötrofil çapı olarak 8.4 mikron kullanılarak mikron kare başına 43 bölge olarak hesaplandı. Bir sonraki grafik, bir saniye ve 10 saniyede belirli bir bağlama için çalışan yapışma frekansı fi'yi gösterir. ICAM bir kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta iki eksprese eden insan nötrofilleri arasındaki tekrarlanan yapışma testi döngülerinden ölçülen temas süreleri.

Buna karşılık, burada gösterilen, insan IgG kaplı kırmızı kan hücreleri ile integrin alfa L beta ikisini eksprese eden insan nötrofilleri arasındaki tekrarlanan adion test döngülerinden ölçülen bir saniye ve on saniyelik temas sürelerinde spesifik olmayan bağlanma için çalışan yapışma frekansı fi'dir. Bu son grafik, I A'nın kinetiğini göstermektedir: nötrofil integrin alfa L'ye bir bağlanma, beta, her temas zamanında üç hücre çifti için ölçülen iki yapışma olasılığının ortalaması alındı ve spesifik olmayan bağlanmayı kontrol etmek için temas süresine karşı çizildi. İki farklı koşul kullanıldı.

Anti TFC yakalama antikoru ile kaplanmış ve ICAM yerine insan IgG ile inkübe edilmiş bir kırmızı kan hücresi, yakalama antikoru ile kaplanmamış kırmızı kan hücrelerine bağlanan bir IG ve iki nötrofil. Spesifik bir adezyon olasılık eğrisi elde etmek için insan IgG kontrol eğrisi olarak kaydedilen spesifik olmayan bağlanma kullanıldı. Spesifik olmayan bağlama düzeltmesi için daha önce gösterilen denklemi kullanma.

Düzeltilmiş özgül yapışma olasılığı eğrisi, model bağlantısı ile donatıldı. Spesifik adezyon olasılık eğrisi efektif bağlanma afinitesi verdi. Bir CKA 1.4 çarpı 10 üzeri eksi dört mikron üzeri dördüncü kuvvete eşittir ve koff 0.3 s eksi bire eşittir.

Bu videoyu izledikten sonra, her iki molekül de I etkileşim hücrelerinin yüzeylerine sabitlendiğinde reseptör ligand etkileşim kinetiğinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, ilk egzersizleri, ligand yan yoğunlukları aralığını hatırlamak önemlidir, böylece frekansın yapışması orta aralıkta olur ve kanla ve belirli tedavi için bazı bölgelerle çalışmanın, örneğin, sodyum ve DM'nin son derece tehlikeli olabileceğini hatırlamak önemlidir. Bu nedenle, MSDS reaktiflerinin dikkatli bir şekilde okunması ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giyilmesi gibi önlemler gereklidir.