Name: Hücre içi Refolding Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin hücre içi protein refolding ölçümü için ısı şoku sonrası moleküler şaperon aktivitesini değerlendirme yöntemini. Firefly luciferase raportörü kullanarak hücresel stres yanıtlarında protein homeostazını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Danilo Maddalo bir araştırma bursu, Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü Genç Araştırmacı Grubu (YIG) olarak bir alıcı.

1. Hücreleri Seeding <ol><li> Başlamadan önce, 37 az bir su banyosu içinde, kültür ortamı, PBS 1X ve tripsin ısınmak ˚ C </li><li> Kuluçka hücrelerini alın ve orta aspire. </li><li> 5 ml PBS 1X nazikçe yıkayın hücreleri geçerlidir. </li><li> PBS 1X aspire tripsin EDTA% 0,025 içeren 1 ml uygulayın. </li><li> Tripsin eşit bir dağılıma sahip olduğu plaka hafifçe döndürün. </li><li> 37 inkübatör hücrelerin yerleştirin ˚ C (hücre tipine bağlı olarak 5-10 dakika). Zaman zaman kontrol hücreleri plaka sallayarak ayrılmış. </li><li> 10-20 ml orta hücrelerin 50 ml şahin tüp içinde süspanse edin ve onları toplamak. </li><li> Beckman sayacı kullanarak hücre sayımı. Hücrelerin sayısı yaklaşık% 60-70 oranında bir izdiham sağlamak için yeterli olmalıdır. </li><li> Plate hücreleri ve 6-8 saat süreyle tohum onlara izin verir. </li></ol> 2. TransInfeksiyon <ol><li> Transfeksiyon için önce 37 ˚ C'ye bir su banyosu içinde bir kısım serum orta ısınmak </li><li> X-treme Gen 9 oda sıcaklığına getirin. </li><li> 2 Eppendorf tüpler serum serbest orta (1 tüp = 1 transfeksiyon) pipetleyin. </li><li> Pipetleyin ucu, 5 dakika, Eppendorf ve inkübe plastik duvar temas edip etmediğini, serum serbest orta ödeyerek dikkat X-treme Gen 9. Bu arada iki DNA karışımlarını hazırlamak: Bir tüp içinde, başka bir tüp renilla, ateş böceği ve moleküler şaperon renilla, ateş böceği ve boş bir vektör kontrolü için plazmid karıştırın. </li><li> + X-treme Gen 9, vortex ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe içeren serum serbest ortam her Eppendorf DNA karışımını ekleyin. </li><li> 37, 24 saat boyunca her plaka ve inkübe üzerine damla damla her karışımı ° C ve% 5 CO 2 </li></ol> 3. Yarma hücreleri <ol><li> 24 saat sonra transfeksiyon, tryps1.4 'de açıklandığı gibi hücrelere inize - 1.6 ve% 60-70 oranında son bir confluency 6 plaka onları sulandırmak. </li><li> Olmayan şok kontrol için bir tabak hazırlayın ve analiz edilmesi gereken kurtarma zamanı noktaları gibi birçok tabak, Şekil gösterdi. 2. </li></ol> 4. Isı şoku <ol><li> Isı çarpması için, önceden ılık serum içeren bir su banyosunda 37 ° orta ˚ C </li><li> 20 mM nihai konsantrasyonu 20 mg / ml ve MOPS serum içeren orta Siklohekzimidsiz içinde seyreltilmesi hazırlayın 'ısı şok tampon. </li><li> Şimdi inkübatör tabak ve orta aspire. </li><li> 'Isı şok tampon' her iyi 1 ml ekleyin ve 37 az 30 dakika boyunca inkübe ˚ C ve% 5 CO 2 (aynı zamanda bu tedavi referans plaka). Bu, de novo protein sentezi durur. </li><li> Bu arada bir su banyosu anahtarı ve temperature ˚ C 45 </li><li> Inkübasyondan sonra, daha önce şeritler halinde kesilmiş plakalar Parafilm kapak mühür. Referans plaka (refolfed ateşböceği% 100) inkübatör bırakılır. </li><li> 45 ˚ C 'de 30 dakika boyunca plakalar inkübe edin. </li><li> Su banyosu plakaları çıkarın parafilm kaldırmak ve kurtarma izin inkübatör geri tabak koyun. </li><li> Her zaman noktası hasat hücrelerin az ve 4 için 2000Xg ˚ C'de 1 dakika santrifüj PBS 1X yıkayın </li></ol> 5. Hücre parçalama ve lusiferaz tahlil <ol><li> Verimli bir hücre erimesi için, sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak oturtun. </li><li> Bir cam tüp çift distile su 1:05 seyreltilmiş pasif lizis tamponu 200 ul ekleyin. </li><li> 96 plaka 30 ul hücre lizat ekleyin. Her örnek, üç nüsha olarak pipetlenir. </li><li> Sadece olmayan şok 'referans örnek olacakBu adım, eşit transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için kullanılan bu yana, renilla lusiferaz aktivitesini okuyun. </li><li> Test için çözümler hazırlayın. Luciferase çözümü için Gly-Gly tampon son konsantrasyonu 0.2 mM luciferase sulandırmak. Reaksiyon tamponu için Gly-Gly tampon 1mm son konsantrasyonu DTT ve ATP sulandırmak. Coelenterazine reaksiyon tamponu için, nihai konsantrasyonu 0.2 mcM coelenterazine tampon coelenterazine sulandırmak. Luciferase çözüm ve coelenterazine reaksiyon tamponu ışık korumalı tutun. </li><li> Şimdi luminometreye 96-plaka yeri ve programı 'Wallac 1420 İş İstasyonu' başlatmak. </li><li> Coelenterazine çözeltisi içeren şahin tüpe Pump1 tanıtın. Hiç ışık tüpü ile temas böylece kapağını kapatın. </li><li> Seçeneği 'Dispenser bakım menüden seçiniz ve Pump1 işaretleyiniz. </li><li> 'Doldur' seçeneğini seçin. </li><li> Menüde 'plaka düzeni seçeneği düzenlemek için protokol ve sonuç keşfedin. Üzerinde protokol ve çift tıklayarak seçin. Şimdi kuyu okunacak seçin. </li><li> 'Wallac Müdürü' geri dönün ve 'Başlat' düğmesine tıklayın. Renilla lusiferaz ve substrat coelenterazine arasındaki reaksiyon pik, 482 nm dalga boylu ışık yayar. </li><li> Okuduktan sonra, 'Dispenser bakım gidin ve geri kalan tüm çözüm tüp serbest bırakmak için' Boş 've Pump1 seçin. </li><li> Şimdi, su içeren bir şahin tüp tüp taşımak ve 'Flush' işaretleyiniz. </li><li> Kızarma adımdan sonra, 'Boş' seçerek tüp boş. </li><li> Reaksiyon tampon şahin tüp Pump1 ve luciferase şahin tüp Pump2 biri tüp yerleştirin. </li><li> Plaka düzenini değiştirin. </li><li> 'Di Pump1 ve Pump2' Doldur 'seçinSpenser Bakım 'menüsünden. </li><li> Protokolü seçin ve okumaya başlayın. Firefly lusiferaz ve substrat luciferase arasındaki reaksiyon, 560 nm arasında bir zirve dalga boyuna sahip bir ışık yayar. </li><li> Okuma sonunda Pump1 ve Pump2 Flush-Boş Boş işlemi tekrarlayın. </li><li> Sonuçlar 'Wallac 1420 Explorer' artık mevcuttur. </li><li> Her deneyde bir test numarası ile ilişkili, başlangıç ​​ve bitiş tarihi kullanıcı adınızı. </li><li> Sonuçlar artık bir Excel dosyası olarak ihraç edilebilir. </li><li> 1: hesaplamalar için, hücreleri üç gruba ayrılır. olmayan şok referans örnekleri (% 100 ateşböceği lusiferaz refolded set); 2. şok moleküler hastabakıcı ve ısı olmadan hücreler; 3. hücrelerin moleküler şaperon ısı ve şok. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Protein refolding sistem yanlısı çalışıp çalışmadığını test etmek için bu nedenle iyileşme süresi doğrudan ilgili Perly bir tahlil, farklı zaman noktalarında hücrelerin toplanması yapılacak. Doğrudan bir korelasyon zaman / refolding yüzdesi, deney düzgün bir şekilde gerçekleştirilir ve bu nedenle bir sınırlayıcı faktör temsil olduğunu gösterir. Ancak her zaman ısı şokundan sonra refolding doyurarak bir olaydır ve bu nedenle uygun bir zaman ders analizi, herhangi bir deney başlamadan önce yapılmalıdır dikkate alınmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Deney Bakış. In vivo refolding tayininde tamamlanması 3 ila 4 gün gerektirir. Gün 1 hücreleri numaralı seribaşı ve transfekte. Ertesi gün, hücreleri daha küçük bir biçime parçalı ve 3. günde ısı şok. Bu noktada sağ hücreler hasat sonrası lusiferaz tahlil gerçekleştirmek için veya -80 ° C'de hücre pelletini kaydetmek ve bir an tahlil gerçekleştirmek mümkün _content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Hücre bölünmesi. Gününde 2 hücreleri 6 plaka ayrılır. Her transfeksiyon aynı plaka üzerindeki tüm transfeksiyon sahip olmak için iyi bir seyreltilmiş olacaktır. Her plaka belirli bir iyileşme süresi artı olmayan bir şok referans plaka karşılık gelir. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Temsilcisi iyi bir sonuç. Refolding, A. Yüzde doğrudan ateşböceği lusiferaz aktivite ile ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. B. yokluğu (siyah çizgi) ve hastabakıcı varlığı (kırmızı çizgi) ve refolding arasında korelasyon. R kare değerleri arasında iyi bir korelasyon göstermektedir. Fig.3A hücrelerin yokluğunda ısı şok (siyah çubuklar) 15, 30, 45, 60 ve 120 dakika sonra ve moleküler şaperon varlığı (kırmızı bar) toplandı bir temsilci sonuçları gösterilir. Yüzde refolded, uzamış iyileşme süresi ve moleküler şaperon transfeksiyon lusiferaz artar. Refolding ve zaman kontrolü (Şekil 3B, siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (Şekil 3B, kırmızı çizgi) arasındaki ilişki gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Temsilcisi kötü bir sonuç. A. refolding, Yüzde doğrudan luciferase aktivitesi ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. Yokluğunda ve varlığında zaman ve refolding arasında B. Korelasyon (kırmızı lhastabakıcı ine). R kare değerleri kötü bir korelasyon göstermektedir. Şekil 4A düzgün yapılan bir deneyin temsili bir sonuç göstermektedir. Kontrol (siyah çubuklar) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreleri (kırmızı bar) her ikisi de zaman refolding protein bir artış göstermemiştir. Buna ek olarak, moleküler şaperon transfeksiyon refolding bir artışa yol açmamıştır. Bu zayıf bir korelasyon Şekil teyit edilir. Kontrolü (siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (kırmızı çizgi) için sırasıyla 0,6619 ve 0,1882 r kare değeri gösteren 4B.

<ol><li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+and+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li>
<li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+the+heat+shock+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li>
<li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li>
<li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+proteins+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast.+Cancer.+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li>
<li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li>
<li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li>
<li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17-AAG%3A+mechanisms+of+antitumour+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Investig.+Drugs%22%5BJournal%5D)">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li>
<li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP70+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li>
<li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pineal.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li>
<li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaK%2C+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li>
<li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li>
<li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li>
<li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Bu çalışmada, moleküler şaperonlar içi refolding aktivitesini ölçmek için bir protokol sunulmuştur. Şekil bakış gösterildiği gibi tüm testi 3 ila 4 gün içinde yapılabilir. 1. Ateş böceği ve renilla lusiferaz tarafından üretilen ışık sinyali sağlamlık ve doğrusallık, tekrarlanabilirlik protokol için sağlam bir temel temsil eder. Testin kritik adım, moleküler hastabakıcı ve ateşböceği lusiferaz aşırı ekspresyonu sağlamak için etkin...

Bu deneme için bir Luminometre formu Perkin Elmer &#39;1420 Lüminesans Sayaç &#39;Vektör Light&#39; kullanıldı Luminometre Programları: Renilla: Pompa 1, 100 ul enjeksiyon Reaksiyon Tamponu: Pump1, 70 ul enjeksiyon Luciferase: Pump2, 30μl enjeksiyon Tamponlar çift distile su bu stok solüsyonları hazırlamak için: <ul style="list-style:none"><li> 1M MgSO 4: 1 litre 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA: 1 litre 190,18 g EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4: 1 litre 136,09 g KH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 1 litre 3H 2 O </li><li> - 5M NaCl: 1 litre 292,2 g NaCl </li><li> - 0,5 M EDTA: 1 litre 186,12 g EDTA * 2H 2 O &nbsp;</li></ul> Gly-Gly-tampon: <ul style="list-style:none"><li> - 25mm Glycylglycin </li><li> - 15mm MgSO 4 </li><li> - 4mm EGTA </li></ul> Için 1 litre Glycylglycin kullanımı 3,3 g, 1M MgSO4 çözüm ve 0,5 M EGTA çözüm, 8 ml 15ml. Su içinde çözün, 7,8 pH ayarlamak ve toplam hacim 1 litre getirmek. Renilla / Coelenterazine tampon reaksiyon tamponu: <ul style="list-style:none"><li> &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li> KH 2 PO 4 - 86,6 mM </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mm EDTA </li></ul> 1 litre 1M KH 2 PO 4 çözümü kullanmak 13,4 ml, 86,6 ml, 5M NaCl çözeltisi ve 2 ml 0,5 M EDTA çözeltisi 100ml 1M bir K 2 HPO 4 çözüm . <table border="1"><tr><td></td><td> Şirket </td><td> Katalog / Ürün Numarası: </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco&#39;nun Modifiye Eagle Orta 1X) </td><td> Gibco </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Altın </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td></tr><tr><td> X-treme Gen 9 DNA Transfeksiyon Reaktif </td><td> Roche </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco&#39;nun Fosfat Tuzlu 1X Tamponlu </td><td> Gibco </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> MOPS 3 - (N-morfolino) propan sülfonik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> Pasif Lizis Tampon 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 2 O 7H) </td><td> Sigma-Aldrich Roth Roth </td><td> G7278 3054,2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> Roth Roth Roth Roth </td><td> 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 </td></tr><tr><td> Luciferase Firefly </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (dithiothreitol) </td><td> Roth </td><td> 6908,2 </td></tr><tr><td> ATP (adenozin trifosfat) </td><td> Roche </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

hücre içi refolding testi

Intracellular Refolding Assay

Bu protokol, bir hücre tabanlı bir sistem ve inhibitör / uyarıcı aktiviteye sahip bileşikler olası etkileri içinde moleküler şaperonlar enzimatik aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Moleküler şaperonlar 1 katlama protein yönetmelikte yer alan proteinler ve ısı şok 2, besin açlık ve kimyasallar / zehirler 3 maruz kalma gibi stres hakaretler üzerine hücre sağkalım teşvik çok önemli bir rol var. Bu nedenle şaperonlar tümör gelişimi, kanser hücreleri 4 chemioresistance yanı sıra nörodejenerasyon 5 gibi etkinliklere yer bulunur. Bu nedenle, bu enzimlerin aktivitesini inhibe veya teşvik etmek için küçük moleküllerin tasarımı, kanser tedavisi 7 ve nörodejeneratif hastalıkların 9 için en çok çalışılan stratejileri biridir. Burada açıklanan belirli bir moleküler şaperon refolding aktivitesini ölçmek ve comp etkisini araştırmak için tahlil imkanı sunarfaaliyet ounds. Bu yöntemde, incelenen moleküler şaperon gen ateşböceği lusiferaz gen ekspresyon vektörü kodlama ile birlikte transfekte. Zaten denatüre ateşböceği lusiferaz moleküler şaperonlar 10,11 refolded olabileceği tarif edilmiştir. Transfeksiyon kontrolü normalleştirilmesi gibi, renilla lusiferaz gen için bir vektör kodlama transfekte. Bu protokolü açıklanan tüm transfections HEK-293 hücrelerinde X-treme Gen 11 (Roche) ile yapılmaktadır. İlk adımda, protein sentezi, Siklohekzimidsiz hücrelerin tedavi inhibe edilir. Bundan sonra açığa çıkmasını protein 30 dakika boyunca 45 ° C&#39;de ısı şok indüklenir. 37 ° kurtarma üzerine ° C, proteinler yeniden katlanmış ve onların aktif konformasyon ateşböceği lusiferaz faaliyet okuma olarak kullanılır: daha fazla ışık olacak, daha fazla protein orijinal konformasyon yeniden kazanmış olacaktır. Isıl şok hücreleri referans (refolded,% 100 olarak belirlenmiştirlusiferaz).

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ısı şoku sonrası şaperon bağımlı hücre içi protein yeniden katlanmasını ölçmektir. Bir lusiferaz raporlayıcısı kullanarak, öncelikle hücreleri lusiferaz raporlayıcı genini ve ilgili şaperonu içeren plazmidlerle transfekte edin. Ardından, transfekte edilmiş hücreleri deneysel tasarımdaki geri kazanım zaman noktaları için gruplara ayırın.Ertesi gün, protein açılımını indüklemek için hücrelere ısı şoku uygulayın. Hücre içi protein katlanmasının yeniden sağlanması için toparlanma süresi tanıyın ve ardından lusiferaz raporlayıcı aktivitesini ölçün. Sonuçlar, lusiferaz analizi temelinde zamana ve şaperona bağımlı protein yeniden katlanmasını ölçer.Bu tekniğin in vitro refolding deneyi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bileşiklerin veya proteinlerin şaperon aktivitesi üzerindeki etkisine dair fizyolojik bir okuma elde edebilme imkanıdır. Şaperonlar bu patolojilerin gelişiminde önemli bir rol oynadığı için, bu tekniğin doğurguları nörodejeneratif hastalıklar veya kanser gibi geniş bir hastalık yelpazesinin tedavisine kadar uzanmaktadır. İlk olarak, kültür ortamını, PBS'yi ve tripsini bir su banyosunda 37 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun.Konfluen b

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Kaynak: Dahl, J. ve ark. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit ve ısı stresi altında bir substrat proteininde çaperon aktivitesini değerlendirmek için floresans spektrofotometre tabanlı bir testi göstermektedir. Işık saçılması yoluyla substratın açılması ve toplanmasının izlenmesi adımlarını, eşlikçi ile ve olmadan koşulları karşılaştırarak açıklar.

Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu videoda, deterjan fraksiyonlaması ile birlikte sikloheksimid muamelesi kullanılarak yanlış katlanmış proteinler için bir bozunma testi açıklanmaktadır. Bu yöntem, yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemeye ve protein döngüsünün derinlemesine mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olur.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, transfekte edilmiş memeli hücrelerinin çekirdeğinde eksprese edilen floresan etiketli yanlış katlanmış lusiferaz mutant proteinin bozunma kinetiğini incelemek için in vitro floresan bazlı bir mikroplaka testi açıklanmaktadır. Test, yanlış katlanmış proteinin proteazom aracılı bozunmasını değerlendirmek için floresan mutant proteini eksprese eden hücrelerin bir translasyon inhibitörü ve bir proteazom inhibitörü ile işlenmesini içerir.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Burada yüksek kaliteli vitamin A / RBP karmaşık ve STRA6, RBP reseptör tarafından A vitamini ulaşım incelemek için iki gerçek zamanlı izleme teknikleri üretmek için optimize edilmiş bir tekniği tanımlar.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Bu makalede, araştırmak için bir ateş böceği lusiferaz-GFP füzyon proteini tanımının kullanımını tarif...

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Bu rapor, western blot veya floresan bazlı tahlillerle yanlış katlanmış proteinlerin bozunma oranlarını ölçmek için protokolleri açıklar. Yöntemler, diğer yanlış katlanmış proteinlerin analizine ve yüksek verimli taramaya uygulanabilir.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Öğrenin hücre içi protein refolding ölçümü için ısı şoku sonrası moleküler şaperon aktivitesini değerlendirme yöntemini. Firefly luciferase raportörü kullanarak hücresel stres yanıtlarında protein homeostazını inceleyin.

Hücre içi Refolding Testi

Daha fazla video keşfet