Hücre içi Refolding Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ısı şokundan sonra yeniden katlanan şaperona bağımlı hücre içi proteini ölçmektir. Bir lusiferaz raportörü kullanarak, önce hücreleri, lusiferaz raportör genini ve ilgilenilen şaperonu kaplayan plazmitlerle transfekte edin. Ardından, deneysel tasarımda kurtarma zaman noktaları için transfekte edilmiş hücreleri bölün.

Ertesi gün, proteinin açılmasını sağlamak için hücrelere ısı şoku verir. Hücre içi protein katlanmasını yeniden kazanmak için iyileşmeye izin verin ve ardından lusiferaz raportör aktivitesini ölçün. Sonuçlar, lusiferaz testine dayalı olarak zamana bağlı ve şaperona bağımlı protein yeniden katlanmasını ölçer.

Bu tekniğin, in vitro rekatlama testi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bileşiklerin veya proteinlerin şaperon aktivitesi üzerindeki etkisinin fizyolojik bir okumasına sahip olma olasılığıdır. Bu tekniğin sonuçları, nörodejeneratif hastalıklar veya kanser gibi çok çeşitli hastalıkların tedavisine kadar uzanır, çünkü şaperonlar bu patolojilerin gelişiminde önemli bir rol oynar. İlk olarak, kültür ortamını, PBS'yi ve tripsini bir su banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın.

Beş mililitre PBS ile HEK 2 93 hücrelerinin birleşik bir kültürünü yıkayın. Daha sonra% 0.025 EDTA içeren bir mililitre tripsin uygulayın, tripsinin eşit dağılımı için plakayı hafifçe döndürün ve 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre ayrılmasını doğrulamak için plakayı periyodik olarak sallayın.

Şimdi hücreleri 10 mililitre tam DMEM ortamında askıya alın ve 50 mililitrelik bir şahin tüpüne aktarın. Ardından bir Beckman sayaç plakası kullanarak hücreleri numaralandırın. Yaklaşık% 60 ila 70 oranında hücreler akıcılığa sahiptir ve altı ila sekiz saat boyunca kuluçkaya yatırılır.

Aşırı geni, dokuz reaktifi oda sıcaklığına ve serum serbest ortamın alikotunu 37 santigrat dereceye kadar dengeleyin. Serum içermeyen ortamı iki einor tüpüne pipetleyin. Daha sonra, einor tüp duvarına dokunmadan aşırı gen dokuz reaktifini ekleyin, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Bu arada, birinci tüpte 2D NA transfeksiyon karışımlarını hazırlayın, ikinci tüpte ran vanilya ateşböceği ve boş bir vektör kontrolü ekleyin. Koşan vanilya ateşböceği ve moleküler şaperonu ekleyin. DNA'yı transfeksiyon reaktifine ekleyin, girdap karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Bu karışımı kaplanmış hücrelere eklemeye devam edin ve 24 saat inkübe edin. Altı oyuklu plakada% 60 ila 70 co akıcılığında tripsin tohum hücreleri kullanarak transfekte edilmiş hücreleri hasat edin ve gece boyunca inkübatörde bırakın. Ortamı transfekte edilmiş hücrelerden aspire edin.

Ardından bir mililitre ısı şoku tamponu ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Denovo protein sentezini durdurmak için, kapakları paraform şeritleri ile kapatın ve 45 derece santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Şimdi paraformu çıkarın ve hücreleri belirtilen zaman noktalarında geri kazanım için inkübatöre geri yerleştirin.

Hücreleri hasat edin ve PBS'de bir kez yıkayın Verimli bir hücre lizisi çırpınması için, hücre peletini sıvı nitrojen içinde dondurun, 200 mikrolitre seyreltilmiş pasif lizis tamponu ekleyin. Şimdi üç nüsha halinde alikot. 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 30 mikrolitre hücre lizatı.

Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için, şoklanmamış referans numunelerle başlayın. Çalışan lusiferaz aktivitesini ölçmek için, bir milimolar A TP ve 0.2 mikromolar ezin reaksiyon tamponu içeren gly Gly tampon reaksiyon tamponunda taze 0.2 milimolar Lucifer hazırlayın. 96 kuyulu plakayı luminometreye yerleştirin ve programı başlatın.

Wallach 1420 iş istasyonu. Pompayı, 0.2 mikromolar ezin reaksiyon tamponu içeren Falcon tüpüne sokun. Menüden, dağıtıcı bakımı seçeneğinden seçim yapın ve pompa birini işaretleyin.

Plaka düzenini düzenlemek için doldurma seçeneğini seçin. Menüdeki seçeneği seçin, protokolü ve sonuçları keşfedin. Protokolü seçin.

Şimdi okunacak kuyuları seçin. Wallach yöneticisine geri dönün ve numune emisyonlarını ölçmek için başlat'a tıklayın. 482 nanometrede, dağıtıcı bakımına devam edin ve tüm artık çözeltiyi tüpe geri bırakmak için boş ve pompalı birini seçin.

Şimdi tüpü su içeren bir şahine taşıyın ve işaretleyin, yıkayın. Boş seçerek devam edin. Daha sonra birinci pompadan gelen tüpü reaksiyon tamponuna ve ikinci pompadan gelen tüpü LUCIFERIAN çözeltisine yerleştirin.

Plaka düzenini değiştirin. Birinci pompa ve ikinci pompa için doluyu seçin. Dispenser bakım menüsünden protokolü seçin ve 560 nanometrelik ateşböceği lusiferaz reaksiyon dalga boyunu ölçmeye başlayın.

Tekrarlamanın sonunda, prosedürü tekrarlayın, boş, yıkayın, boş. Birinci pompa ve ikinci pompa için sonuçları Wallach 1420 Explorer'da görüntüleyin. Her deney bir tahlil ile ilişkilendirilir.

Numara, kullanıcı adı, başlangıç ve bitiş tarihi, sonuçları bir Excel dosyası olarak dışa aktarır. Analiz için, proteinin yeniden katlanması doğrudan iyileşme süresi ile ilgilidir. Bu deneyde, hücreler ısı şokundan sonra farklı zaman noktalarında değerlendirilir.

Moleküler şaperonun yokluğunda ve varlığında. Beklendiği gibi, yeniden katlanmış lusiferaz yüzdesi, hem kontrollerde hem de moleküler şaperon ile transfekte edilen hücrelerde uzun süreli iyileşme süresi ile artar. Buna karşılık, geçersiz bir veri kümesi, zaman ve yeniden katlama arasındaki bağıntı için zayıf R kare değerleri görüntüler.

Bu tekniği takiben, şaperonun enzimatik aktivitesinin inhibisyonu gibi ek soruları yanıtlamak için in vitro TPA testi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi proteinin nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. Aksama şokundan sonra takip ediyoruz.