Name: Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Öğrenin farelerde germ hücre nakli ve testis dokusu xenografting tekniklerini. Spermatogonyal kök hücrelerin tanımlanması ve türler arası testis gelişiminin incelenmesi için bu yöntemleri keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar laboratuvar İş USDA-/ CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) tarafından desteklenen; NIH / NCRR (2 R01 RR17359-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) ve Alberta yenilikler yaratır - Sağlık Çözümleri.

BÖLÜM farelerde A. Germ hücre nakli 1. , Alıcının fareler of Hazırlanışı <ol><li> Alıcılar donör testis hücreleri (donörlerden ya da bağışıklık eksikliği ya da genetik olarak uyumlu) bağışıksal hoşgörülü olmalıdır. </li><li> Alıcılar ya doğal olarak spermatogenez yoksun (örneğin W / W v fareler) veya endojen germ hücrelerinin tüketilmiş olması gerekir. Germ hücre tükenmesi,, ışınlama ya da bu tür Myleran Film Tablet'ın gibi kemoterapötik uyuşturucular kullanıcısı tarafından başarılabilir uygulanmaz edebilirsiniz. , Bu protokol In, biz,,, Myleran Film Tablet'ın ile birlikte alıcının fareler hazırlarken of yöntemini açıklamak. </li><li> 4-6 hafta boyunca yaş ip busulfandan enjeksiyonu alıcılara davranın. Busulfandan optimal doz suşu bağlıdır. , Olarak, yaygın olarak olarak kullanılan alıcının suşlar In, 40-50 mg / kg 'dan' of, bir doz,,,,, endojen germ hücreleri (örn.: 44, nude fareler için mg / kg ', 50 mg /, B6/129 F1 alıcıların için kg'). Deplete etmek yeterli bir konumundadır </li><li> DMSO Busulfan Tozun erimesi ve daha sonra steril distile su t eşit hacimde ekleyinyapmak Kullanıcısına, 4 mg / ml '' of, bir nihai bir bir konsantrasyon kaçınılır. 35-40 ° C daha önce yağış busulfandan önlemek için kullanabileceğiniz çözüm sıcak tutun. Yağış görülür çözüm atın. </li><li> Olarak, Myleran Film Tablet'ın tedavi sonra,,, en azından at birini ayın alıcıların kullanmadan önce, izin vermek. Recipients,, 1 ayın, ve 3 ay önce yazılan mesaja-Myleran Film Tablet'ın tedavi. Tarihleri ​​arasında kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. </li></ol> 2. Mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması <ol><li> 1,0 mm dış çapı, 0,75 mm iç çap ve 3 inç uzunluğu ile borosilikat cam pipetler (kılcal tüpler) seçin. </li><li> Cam pipetler Sigmacote Siliconize, metanol ile pipetler çalkalayın ve kuru bir darbe. </li><li> Pipetler bir pipetle Fuari'ndaki kullanarak çekin. , Farklı pipettir çektirmenin makinelerde,, farklı ayarlarını, bu nedenle, bir birkaç ayarlarını,, sınamak, var. Genellikle olarak,,,,, enükleasyon operasyonu uygulandı pipetlerimiz yaptıktan için kullanılan olduğunu etmek 'e benzer, bir ayarı, çalışmak olabilir. </li><li> ,,, Yaklaşık olarak 50 mikron of, bir çapı başarmak etmek kullanmak etmek, öncesinde,, dissekan mikroskop altında pipettir bir ip uçları Breakucunda. </li></ol> 3. Nakli için donör hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Donör suşu Choise çalışılan deneysel soru üzerine bağlıdır. Spermatogenez ölçümü son nokta olarak kullanılması durumunda, Lac-Z gibi kolayca tanımlanabilen genetik işaretleyici ile donörlerin (örneğin B6.129S7 Gt (ROSA) Jackson Laboratory 26Sor / J) veya GFP (örneğin C57BL/6-Tg ( Jackson Laboratory CAG-EGFP in) 1Osb / J). </li><li> 7 mg / ml '' at,, DMEM in, DNase of, mg / ml ', Şu (4), tripsin-EDTA ile of ml' (% 0.25 'lik, tripsin plus 1mM valdecoxib ile yapılan EDTA ile), ve 2 adet ml' 1 - at, (7), DMEM in collagenase of ml 'hazırlayın. Bu miktar 2 donör fare testis sindirerek içindir. </li><li> Aseptik testis toplayın ve tunika albuginea kaldırmak. Yayılma seminifer enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için ince forseps ile yavaşça tübüller. </li><li> 5-10 dakika, ve sık sık ajitasyon için 37 ° C'de inkübe kollajenaz içine transfer tübüller. </li><li> Temizlik tübüllerin, iplik eğirme (3 min için: 200-300 g) ve, #, PBS w / o Ca 2 bölgesindeki re-süspansiyona alma kullanıcısı tarafından iki kat daha yıkayın.. + + </li><li> Tripsin-EDTA tübüller yeniden askıya alma ve yapışkan ve bulanık hale gelene kadar salla. Tübüllerin 1-2 dakika içinde meydana gelen 37 ° C gibi sindirim izleyin. </li><li> DNaz ekleyin ve iyice çalkalanır. 1-2 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> ,,, Enzimler of eylem durdurmak etmek 3 ml 'of FBS ekle. </li><li> Hücre / doku parçalarını kaldırmak için, 40-70 mikron gözenek büyüklüğüne sahip bir naylon mesh kullanarak Filtre hücre süspansiyonu. </li><li> ,, 5 min Şu aramanız için 600 g için at hücreleri Collect. Ve bu konuda kurulacak güçlü,, DMEM (&lt;100 ul'lik) of, bir küçük bir bir miktarını in re-askıya alma hücreleri. </li><li> Hücreleri saymak ve istenen nihai konsantrasyonu (genellikle 100 x 10 6) ses seviyesini ayarlamak. Kullanmadan önce buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> Her, busulfan-tedavi edilen fare testisi hücre süspansiyonu sadece 10-15 ul dolacaktır. Potansiyel atık ve sızıntı nedeniyle, testis başına 30-50 ul hedefliyoruz. </li></ol> 4. Nakli işlem (Şekil 1) <ol><li> Onaylı protokolleri takip alıcıları uyuşturan. </li><li> Dorsal içinde Yeripozisyonda ve cerrahi karın bölgesi hazırlamak. Karın duvarı açığa çıkarmak için bir ~ 1cm orta hat karın kesisi olun. Yanlışlıkla karın içi organların zarar vermekten kaçınmak ve periton boşluğuna maruz karın duvarı orta hattan ~ 0.5 cm kesi yapmaya devam beyaz çizgi noktada küçük forseps kullanarak karın duvarı kaldırın. </li><li> Karın duvarı tutmak için bir iris forseps kullanın ve yağ pedleri, periton boşluğuna epididim ve testis bağlı aramak için iris forsepsinin başka bir çifti kullanmak. Testis yavaşça dışarıya alınır kadar yağ yastığı, testiküler arter ve epididim çekin ve net bir şekilde görülebiliyor. Bir anda bir testis üzerine çalışın. </li><li> Daha iyi bir görsel kimlik (isteğe bağlı) yağ yastığı / testis altında otoklavlanmış indeks kartları ile yapılan ince bir steril örtüyü yerleştirin. Drape Ayrıca sıvı absorbe etmek için çalışır. </li><li> ,,,, Hücre süspansiyon içine internetin Tripan Blue dye ile of, bir drop ekle ve dikkatli bir şekilde,, Polietilen içine hücre süspansiyon da yüklenemedi.lene hortumunu,, bir 1 ml 'şırınga etmek bağlandığında. Tüp içine çekti pipet pipet içine hücre süspansiyonu enjektöre basınç uygulayarak takın ve hafifçe zorlamak. </li><li> Efferent kanalları (testisin epididim bağlayan) belirlenmesi ve yavaşça kanalları çevresinde yağ doku kaldırmak. Çevrelerindeki kanalları ve membran saydam dikkatli bir şekilde çalışın. </li><li> Efferent kanalların paket içinde dikkatlice bir kanal içine pipet eklemek, yavaşça, testis doğru birkaç mm geçiriniz. </li><li> , Enjeksiyon pipet hareket kaçınarak ulaşmak için şırınga, yavaşça doldurmaya başlar askıya rete testis ve seminifer tübül içine akar sağlamak için şırınga pistonu bastırın. </li><li> Hücre süspansiyonu enjeksiyon hızı ve akış parmak basıncı ile düzenlenir. Basıncındaki ani artış kaçının; tübüllerinde süspansiyon hareketini izlemek. </li><li> Testis bec başlamadan önce hemen hemen tüm yüzey tübüller doldurulmuş enjeksiyon Durduriskemik Ome. </li><li> Testis karın boşluğuna getirin. Kontralateral testis üzerine işlemi tekrarlayın. 6-0 ipek sütür ile karın duvarı dikerek ve deri metal yara klipler ile kapatın. Tam iyileşme kadar bir ısınma pad üzerinde fareler izleyin. </li></ol> 5. Alıcı testislerin analizi <ol><li> Analizden önce transplantasyon sonrası 2-4 ay izin verin. </li><li> Hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine göre, alıcı fare Euthanize, PBS içine testis ve epididim toplamak. , It,, endojen bir beta-galactosidase aktivitesi sahiptir gibi,, bir Lac-Z arasından transgenic donör strain, kullanılan&gt; edilmiştir&gt; gelmiştir Ne zaman, epididimis,,, bir pozitif bir bir boyanma kontrolü gibi kullanılmalıdır edebilirsiniz. </li><li> Lac-Z boyama ile donör hücrelerinin varlığı tespiti için 1-2 saat, 4 testis düzeltmek ° C PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA). ,, LacZ şehrindeki In-room sıcaklık at 3 x 30, min durulayın buffer durulama. </li><li> ,, LacZ boyanma bir çözüm in, (37) ° C at bir gecede inkübe edin. Testis,,, bir, bütünün gibi ya da dispersleme sonra, boyand uygulanmaz edebilirsiniztübüller. </li><li> Saptamak ve% 10 nötr tamponlu formalin depolamak. Bölümleri gerekiyorsa karşı leke olarak nötr hızlı kırmızı kullanın. </li></ol> KISIM B. Ektopik farelerde xenografting (Dobrinski ve rathi 15, 2008 da, ve Rodriguez-Sosa ve ark. Ark, Yorumdan ... 2011 16 kişi). 1. Donör doku toplanması <ol><li> Hadım testis dokusu elde etmek ya da bir bağış erkek biyopsi yapıldı. </li><li> PBS veya biyopsi kültür ortamında steril şartlarda muhafaza Yer testis. </li><li> Buz ve laboratuvar taşıma toplanan doku tutun. </li></ol> 2. , Donör doku of Hazırlanışı <ol><li> Sterilite korumak için doku kültürü kaputu gerçekleştirin. </li><li> 2-3 kez PBS ile bir kültür kabına aktarmadan önce buz gibi soğuk PBS içeren antibiyotikler her testisteki yıkayın. Biyopsi durumda, buz kültürü medi testis parçaları ile 2-3 kez yıkamakum,, 2 min at 150 g for iplik eğirme ve,, taze - buz-soğuk algınlığı bir kültürü medium in resuspending kullanıcısı tarafından antibiyotikler ihtiva eden ve eğitimi. </li><li> Sağlam testis için, yüzeyi boyunca bir kesi yaparak tunika vaginalis testis kaldırmak ve a'ya. Testis tüm ek yapılar (spermatik kordon, epididim, bağ dokusu) çıkar. PBS ile bir kültür kabına soğuk PBS ve transfer testisler bir kez yıkayın. </li><li> Testisin tunika albuginea, bir neşter bıçak ve bir makas kullanarak dikkatlice çıkarın. Testis çok küçükse, tunika diğer ucunda küçük forseps bir çift ile tunika tutarken, bir ucunda yapılan küçük bir kesi yoluyla tunika testis dokusu sıkma kaldırılabilir. </li><li> , Testisin büyüklüğüne bağlı olarak ya da tüm testis dokusu yaklaşık 1 küçük parçalar halinde kesilir. Kavisli bir forseps ve bir neşter bıçağı, ya da testis dokusu büyük parçalar kullanarak boyutu 2 mm 3 ilk testisten kaldırılır ve olabilir küçük içine kesinparçalar. All, bu,,, ice-soğuk algınlığı bir kültürü medium in ve,,, bir küçük bir bir kültürü çanağı (60 X15 mm), in steril bir koşullar altında yapılabilir uygulanmaz gerektiğini. </li><li> Aşılama kadar buz üzerinde küçük kültür-yemekleri buz gibi kültür ortamına hazırlanan doku parçaları aktarın. </li></ol> 3. Kastrasyon ve alıcı fare <ol><li> Yukarıdaki gibi fare uyuşturan ve% 70 Etanol ve Betadine solüsyonu ile silinerek, saç (çıplak farelerin gerekli değildir) takarak, steril cerrahi saha hazırlamak. </li><li> Karın duvarı açığa çıkarmak için 0.5 -1 cm ventral orta hat cilt insizyonu olun. </li><li> Dikkatle, Parta, 4,2-4,3 açıklanan olarak testis, testis arter ve epididim maruz kalmaktadır. </li><li> Künt diseksiyon ile, gubernakulum Epididimisin kuyruğu ayırın. </li><li> Testiküler arter Ligate ve ipek ile kan damarları ile birlikte vas deferens ve testis ve ligatür arasındaki kesim tarafından bağlanan yapılar bölümü. </li><li> Seco için aynı işlemi tekrarlayın.nd testis. </li><li> Karın duvarı, bir ya da iki cerrahi dikiş ile dikin. </li><li> Bir ya da iki Michel klipler ile cilt kesisi kapatın. </li></ol> 4. Xenografting Ektopik <ol><li> Fare ventral pozisyonda yerleştirin ve yukarıdaki gibi sırtında bir steril cerrahi alan hazırlamak. </li><li> Ekleneceği (genellikle 4-8/mouse) kaç greft bağlı olarak, geri fare orta çizginin her iki tarafında ~ 0.5 cm uzunluğunda cilt insizyonu olun. </li><li> Cilt kesisi bir sınır tutmak için forseps kullanın ve makas kullanırken bağ dokusu dışında alay subkutan boşluğu yapmak. </li><li> Başka bir iris forseps ile cilt kesisi sınır tutarak, bir iris forseps yerde derin subkutan boşluğuna testis dokusu bir parça kullanma. </li><li> Bir Michel klibi ile cilt kesisi kapatın ve anestezi kurtarmak başlayıncaya kadar ısıtma pedi fare tutmak. </li><li> Ek izolasyon ve işbirliği ile bir kafes fare aktarınver ve monitör fareler kadar tamamen iyileşti. </li></ol> 5. , Testis analizi ve sperm toplama xenogreftler Koleksiyonu <ol><li> Hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine göre ana fare Euthanize ve kuyruk ve boyun açık cilt için çalışan arka cilt üzerinde orta hat cilt kesi yapmak. Bu,, subkutan doku on, ya da olarak şuradadır ya da,, cilt etmek iliştirilmiş edilebilir greftler açýklar. </li><li> Bir çift forseps ve bir makas kullanarak greft dikkatlice çıkarın. </li><li> Greft kurtarıldı, bireysel greftlerin büyüklüğü ve ağırlığı da rekor sayıda. </li><li> Farenin karın seminal veziküllerin Al ve aşılı doku testosteron üretiminin bir göstergesi olarak kendi ağırlığı kaydetmek. </li><li> Histolojik analiz için <ol class="lalpha"><li> Hacminde Bouin çözümü (ya da diğer fiksatif) içeren örnek şişesine xenogreftler askıya almasını xenograftlarının, 10x ~~ ve Flakon uygun etiket. </li><li> Üretmek% 70 etanol içinde tercihen 24 saat aralıklarla en az 3 kez yıkama ardından buzdolabında bir gece. </li><li> Işleme ve parafine gömülmesi için devam edin. </li></ol></li><li> Sperm toplama için <ol class="lalpha"><li> 300g az 1 dakika için onları aşağı eğirme ve kültür ortamı içeren antibiyotikler onları resuspending xenogreftler yıkayın. </li><li> Küçük parçalar halinde greftler 3 içeren bir doku kültürü çanak forseps ile dikkatlice kesin ve kıyma - 5 ml kültür ortamı. </li><li> 40 mikron hücre süzgecinden Filtre kıyılmış doku. </li></ol></li></ol> BÖLÜM C. Temsilcisi Sonuçlar 1. Germ hücreli Transplantation X-gal boyama gibi, alıcı testiste donör DGM'lerden kolonizasyon lacZ transgen gibi genetik bir marker taşıyan spermatogonial kök hücreleri nakledilen donör hücre süspansiyonu varsa sem ayırt edici mavi bölümleri ile görülebilmesiiniferous 2-3 ay sonra transplantasyon sonrası 3 (Şekil 2A) tübüller. , Eşleştirilmiş tek veya küçük gruplar mavi hücreleri bir ağ, iyi kurulmuş bir koloni biter hem de iki veya daha fazla, daha merkeze yakın mavi hücre katmanları ve lekeli bölgelerde göreceli olarak daha zayıf kesimlerinin tamamen dolu uzun bir koyu mavi streç olmalıdır. , 3 (Şekil 2B) görünürdeki konumundadır. Koyu mavi seminifer tübül bölgenin köklü bir kesit ortaya çıkarmak ve çeşitli farklılaşma aşamaları (Şekil 2C) mavi germ hücreleri ile iyi organize spermatogenez. 2. Xenografting testis dokusu Transplantasyonu sonrası testis dokusu canlılığını donör gelişimsel aşaması ile ters orantılıdır; yetişkin doku 17-21 dejenere ve ölmek için yüksek bir eğilim gösterirken, en iyi sonucu, yeni doğan erkek doku kullanıldığı zaman elde edilir. Genellikle, xenograft başarısı azalır donör doku bana uğrar gibispermatogenez ilk dalga iosis. Olgunlaşmamış donör doku ve tam spermatogenez tam gelişmesini Zaman türe özgü olup, in situ testis ile karşılaştırıldığında genellikle biraz daha kısa. Seminifer tübüller tam spermatogenez sayısı türlere göre değişkendir. Koyun iken, keçi ve domuz sayısı sığır ve kedilerde% 50 daha büyük olduğunu,% 15 den az 14 (Şekil 3). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Germ hücre nakli prosedürü Yer anestezi sonrası dorsal pozisyonda alıcılar ve bir ~ 0.4-inç orta hat karın kesisi (A) yapmak. Testis, epididim ve testis bağlı yağ yastığı çekildiğini ortaya çıkarmak ve daha iyi bir görsel kimlik (B) yağ yastığı / testis altında ince bir steril örtüyü yerleştirin. Testis ve epididim, yağ yastığı gömülü efferent kanalları (C, D, E) görülebilir böylece yerleştirin. Kimlikvarlık efferent kanalları ve yavaşça kanalları çevresinde yağ doku kaldırmak. Renkli kağıt veya plastik bir parça daha iyi görselleştirme (G) kanalları altına yerleştirilebilir. ,,,, Içine the pipettir (H) kanallarında ve load cell süspansiyon of boyutu etmek göre,,, pipettir bahşiş Break ya da öğütmek. Efferent kanalların paket içinde dikkatlice bir kanal içine pipet eklemek testis (H ok pipet enjeksiyon ve iş parçacığı yönünü gösterir) doğru, yavaşça birkaç mm geçiriniz. Seminifer tübüller içine başarılı bir enjeksiyon ile testis (I) gösterilir. Ts: Testis; Ep: epididimden. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Germ hücre transplantasyonu A) X-gal ile boyanmış bir enjekte testis Temsilcisi sonuç bulundu. ,, Seminifer tubüllerin mavi segmentleri, transgenik donör DGM'lerden (lacZ transgeni) kurulan koloniler temsil eder. 3 ay transplantasyon sonrası bir SSC koloni B) Yüksek büyütme. The merkezi koyu mavi bölge ucunda tam spermatogenez ve soluk mavi bölgeleri temsil büyüyen uzantısı koloninin temsil eder. C), koyu mavi seminifer tübül histolojik bölüm (3 ay transplantasyon sonrası) iyi organize spermatogenez gösterir. B ve C Ölçek bar 200 mikron ve 30 mikron. (Şekil, Annu Rev Hücre Dev Biol adapte 2008;. 24:263-86 ve Biol REPROD 1999 Haz. 60 (6) :1429-36). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3,. Ektopik bağışık yetmezliği olan farelere içine büyük hayvanlardan elde edilen olgunlaşmamış testis dokusu xenografting, bağışık yetmezliği olan farelere dorsal cilt altında (A) nakledilen olgunlaşmamış donör testis Fragments (~ 1 mm 3) hayatta ve fare Gonadotropinlerle cevap mümkün. Bir sonucu As, testis dokusundaki değişikliklerin,,,,,, fertilizasyon, yetkili sperm (Yatak-), of formasyonu de dahil olmak üzere, komple kalkınma undergoes. , Testis xenogreftler topladıktan sonra (C)onlar,,,, analizi için ya da,,,, ICSI (E) ve embriyo üretim (F) için sperm (-Ge) edinme etmek. kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. Barlar eşit 50 mikron (B, E ve F) veya 10 mikron (D). (Modifiye Rodriguez-Sosa ve Dobrinksi 14, 2009).

<ol><li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).</li>
<li>Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+and+kinetics+of+mouse+donor+spermatogonial+stem+cell+colonization+in+recipient+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes.</a> Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).</li>
<li>Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+produced+by+retroviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+rats+through+the+male+germline+using+lentiviral+transduction+and+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).</li>
<li>Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+regulation+of+the+spermatogonial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche.</a> Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).</li>
<li>Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cells+dictate+spermatogonial+stem+cell+niches+in+the+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).</li>
<li>Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+efficiency+and+proliferation+kinetics+of+male+germ+line+stem+cells+following+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice.</a> Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).</li>
<li>Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+essential+for+self-renewal+and+expansion+of+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).</li>
<li>Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+genes+important+for+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).</li>
<li>Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+transplantation+and+testis+tissue+xenografting+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals.</a> Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).</li>
<li>Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+germ+cells+from+rabbits+and+dogs+into+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes.</a> Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).</li>
<li>Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+from+neonatal+mammalian+testes+grafted+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice.</a> Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+testis+tissue+xenografting%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recent developments in testis tissue xenografting.</a> Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).</li>
<li>Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDobrinski%2C+I+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRodriguez-Sosa%2C+JR+%22Fertility+Preservation%3A+Emerging+Technologies+and+Clinical+Applications%22">Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications</a>. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+fate+and+seminiferous+tubule+development+in+bovine+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts.</a> Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).</li>
<li>Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+equine+testis+tissue+xenografted+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice.</a> Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).</li>
<li>Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+donor+age+on+success+of+spermatogenesis+in+feline+testis+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).</li>
<li>Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenografting+of+adult+mammalian+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Xenografting of adult mammalian testis tissue.</a> Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).</li>
<li>Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+survival+of+adult+human+testicular+tissue+as+ectopic+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft.</a> Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).</li>
<li>Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta1-+and+alpha6-integrin+are+surface+markers+on+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD9+is+a+surface+marker+on+mouse+and+rat+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).</li>
<li>Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+niche+microenvironment+on+spermatogonial+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal.</a> Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).</li>
<li>Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+Plzf+in+maintenance+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells.</a> Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).</li>
<li>Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETV5+is+required+for+continuous+spermatogenesis+in+adult+mice+and+may+mediate+blood+testes+barrier+function+and+testicular+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).</li>
<li>Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+transplantation+of+porcine+testis+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Preservation and transplantation of porcine testis tissue.</a> Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).</li>
<li>Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cold+storage+and+cryopreservation+of+immature+non-human+primate+testicular+tissue+on+spermatogonial+stem+cell+potential+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts.</a> Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).</li>
<li>Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+testicular+tissue+from+infant+monkeys+after+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice.</a> Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).</li>
<li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

1. Germ hücreli Transplantation Germ hücre transplantasyonu (DGM) bir hücre popülasyonu spermatogonial kök hücrelerin varlığı kesin onay için sadece fonksiyonel ölçüm sağlar. Sadece DGM&#39;lerden ve ev bazal membran SSC niş kolonize ve donör kaynaklı spermatogenez başlatmak. Germ hücre transplantasyonu, DGM&#39;lerden benzeri görülmemiş bir şekilde çalışmak ve işlemek için mümkün kıldı. Teknik, DGM&#39;lerden 4, genetik manipülasyon yoluyla transgenik hayvanlar üretmek için kullanı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Kollajenaz (tip IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Tripan mavisi KORUYUCU </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Naylon örgü hücre süzgecinden </td><td> BD biyoloji </td><td> 352.340 (40μm) 352.350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> İnce Wall Cam kılcal </td><td> Dünya Hassas Çalgı </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD intramedic plyethylene boru (PE100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 İpek Sütür </td><td> Ethicon </td><td> 706g </td></tr><tr><td> Yara klipler </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Ferrocyanide Potasyum </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Potasyum ferrisiyanürle </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> magnezyum klorür </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> sodyum deoksikolat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> , N, N-Dimethylformamide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ hücre nakli ve testis dokusu farelerde xenografting

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ hücre transplantasyonu 1994 1,2 Pennsylvania Üniversitesi&#39;nden Dr., Ralph Brinster ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. Bu çığır açan çalışmalar alıcının hayvan 2 donör kaynaklı spermatogenez ve sperm üretimi, infertil alıcı fareler sonuçları seminifer tübüller içine bereketli donör farelerin germ hücreleri bu mikroenjeksiyon gösterdi. Kullanımı alıcı hayvanların 1 yavrular, donör haplotypein donör kaynaklı spermatogenez ve iletim bakteriyel β-galaktosidaz gen izin kimlik taşıyan donör erkek. Şaşırtıcı, seminifer tübül lümenine naklinden sonra, nakledilen germ hücreleri, spermatogonium 3 yer vardır bazal membran luminal bölmesini taşımak için başardık. Genellikle sadece DGM&#39;lerden alıcı testis ve spermatogenez yeniden kurmak niş kolonize olduğu kabul edilir. Bu nedenle, germ hücrelitransplantasyonu,, testisinde kök hücre niş okumak için ve olası spermatogonial kök hücre karakterize fonksiyonel bir yaklaşım sağlar. Bugüne kadar, germ hücre transplantasyonu, temel kök hücre biyolojisi aydınlatmak için önce germ hücrelerinin genetik manipülasyon yoluyla nakli 4,5 transgenik hayvanlar üretmek için, Sertoli cell-germ hücreli etkileşimi 6,7, SSC homing ve kolonizasyon 3 çalışmak için kullanılır. 8, yanı sıra gibi SSC kendi kendine-yenilenmesini değişiklik yapmış ve diferansiyasyon 9,10. Germ hücre nakli 11 iri türlere de mümkündür. Bu, ana uygulamalar doğurganlığın korunması, hayvan popülasyonlarının elit genetik yayılması ve bu teknik ile, spermatogenez ve SSC biyoloji çalışma lojistik, kemirgenlerde göre daha zor ve pahalı olduğu gibi, transgenik hayvan üretimi vardır. Farelerde colonizat sonuçları seminifer tübüller içine iri türlere germ hücrelerinin naklidonör hücrelerinin iyon ve spermatogonial genişleme değil, muhtemelen, filogenetik olarak uzak türler 12 germ hücreleri ile alıcı somatik hücre bölmesi uyumsuzluk nedeniyle tam farklılaşma. Alternatif bir yaklaşım çevreleyen somatik bölmesi ile birlikte büyük türlerinin germ hücre naklidir. Biz ilk dorsal deri altında bağışık yetmezliği olan farelere nakledilen olgunlaşmamış erkek testis dokusu küçük parçaları 13 döllenme yetkili sperm üretimi ile tam gelişmesi ancak hayatta geçmesi mümkün olduğunu, 2002 yılında bildirilmiştir. O zamandan beri birçok türün başarılı olmak için xenografting testis dokusunda gösterilmiştir ve farelerin 14 büyük hayvanların testis gelişimi ve spermatogenez incelemek için değerli bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır.

Germ hücre nakli ve testis dokusu xenografting için Protokoller açıklanmıştır. Germ hücre nakli alıcı testiste donör kaynaklı spermatogenez ve spermatogonial kök hücreler (DGM) belirlenmesi için fonksiyonel bir sulandırma tahlil sonuçları temsil eder. Xenografting Testis dokusu alıcı farelerde testis gelişimini ve spermatogenezi çeşitli donör türleri üretir.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Germ hücrei transplantasyonu, 1994 yılında Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. Ralph Brinster ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir1,2. Bu çığır açan çalışmalar...

Bu videoda, birbirleriyle ilişkili iki teknik gösterilmektedir. Bunlardan ilki spermatogonia kök hücre nakli veya SSC nakli, ikincisi ise bu dokuların ksenogreftidir. SSC nakli, bir donörün SSC'lerinden alıcı testislerde spermatogenez oluşturmak için kullanılır.Bu işlem, GFP veya LAC Z gibi tanımlanabilir bir transgenik belirteç içeren bir donörden alınan testislerden veya kültürlenmiş hücrelerden bir hücre süspansiyonu hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, alıcı erkeğin testisleri dışarı çıkarılır. Alıcı, testisleri germ hücrelerinden arındırılacak şekilde tedavi edilmiştir. Daha sonra alıcı erkeğin EENT kanalları izole edilir ve taan ile karıştırılmış donör hücreleri enjekte edilir.Mavi boya. Nihayetinde, alıcının seminifer epitelyumunun kolonizasyonu. Donör kaynaklı germ hücreleri tarafından seminifer tübüllerin kolonize olduğu, transplantasyondan iki ila üç ay sonra belirgin hale gelir; bu örnekte, LacZ eksprese eden donör hücrelerin kolonizasyonunu gösteren alıcı testislerinin xal boyaması ile gözlemlenmiştir.Bu videoda gösterilecek ikinci teknik, testis dokusu xenograft işlemini içermektedir. Testis dokusu rafting yöntemi, olgunlaşmamış donörlerden alınan testis fragmanlarının, testis yetersizliği olan fare konakçılara nakledilmesi yoluyla, donör türden testis gelişiminin ve spermatogenezin aktarılması için kullanılır. Bu işlem, öncelikle burada gösterilen örnekteki gibi domuz gibi büyük bir donör türün testislerinden transplantasyon için uygun doku fragmanları hazırlanarak gerçekleştirilir.Bir sonraki adım, immünodefisyent yetişkin bir alıcı fareyi kısırlaştırmak ve ardından donör testis fragmanlarını alıcı farenin dorsal derisinin altına nakletmektir. Alıcı fareler, donör türüne bağlı olarak altı ila yedi ay içinde testis ksenogreftlerinin tam gelişimine olanak tanıyan in vivo inkübatörler olarak işlev görür. Spermatogonial kök hücre transplantasyonu ilk olarak Pennsylvania Üniversitesi'nde Ralph Brister ve meslektaşları tarafından geliştirilmiş ve ilk kez 1994 yılında rapor edilmiştir.O zamandan beri yaygın bir uygulama alanı bulmuş olan bu yöntem, şu an germ hücreleri kök hücre biyolojisi alanında, kök hücrelerin kendini yenilemesini yöneten sinyal yolaklarının aydınlatılması gibi temel soruların cevaplanmasına yardımcı olan altın standart biyolojik analiz yöntemi konumundadır. Ksenotransplantasyon fikri ilk olarak, kemirgen olmayan donörlerden (örneğin domuzlar, primatlar veya insanlar) izole edilen spermatogoni kök hücrelerinin fare testislerine transplantasyonunun, donör kaynaklı tam bir spermatogenez ile sonuçlanmadığını fark ettiğimizde ortaya çıktı. İzole germ hücreleri yerine küçük testis dokusu fragmanlarının transplantasyonu yoluyla testis mikroçevresinin korunmasının, bu kısıtlamayı aşabileceğini ve fare konakçıda, filogenetik olarak uzak bir türden donör kaynaklı tam bir spermatogeneze yol açabileceğini saptadık.Bu durum ilk olarak 2002 yılında tarafımızca bildirilmiştir. Germ hücreleri transplantasyon protokolü, enjekte edilecek hücre süspansiyonunun hazırlanmasını gerektirir. Hazırlama detayları için yazılı makaleye başvurun.Alıcı fareyi anestezi ederek ve ağrı refleksinin olmadığını kontrol ederek yeterli anestezi derinliğinden emin olun ve nakil işlemine başlayın. Ardından hayvanı sırt üstü pozisyona getirin ve karın bölgesini cerrahi olarak hazırlayın. Karın duvarını açığa çıkarmak için yaklaşık bir santimetre uzunluğunda bir orta hat insizyonu yapın.Karın organlarına yanlışlıkla zarar vermemek için beyaz çizgi noktasından forseps yardımıyla duvarı kaldırın. Ardından, ince bir forseps yardımıyla periton boşluğunu açığa çıkarmak için yarım santimetre boyutunda bir insizyon yapın. Testise ve epididime bitişik olan yağ pedini çekerek testisi dışarı çıkarın ve bu yapıları steril bir indeks kartı üzerine yerleştirin.Şimdi hücre süspansiyonuna tripan mavisi boyası ekleyin. Ardından hücre süspansiyonunu, bir mililitrelik bir şırıngaya bağlı polietilen tüpe yükleyin ve çekilmiş pipeti tüpe takın. Şırıngaya basınç uygulayarak hücre süspansiyonunu nazikçe pipete itin.Şimdi SCC transplantasyonunun en kritik adımı olan ENT kanallarının tanımlanması ve kanülasyonuna geçeceğiz. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, testisler ve EPI'ler arasındaki efferent kanalları tanımlayın ve kanalların etrafındaki yağ dokusunu nazikçe temizleyin. Kanallar ve etraflarındaki membran yarı saydam olduğundan dikkatle çalışın.Kanalları steril, üçgen şeklinde bir plastik parçasıyla destekleyerek sabitleyin. Ardından, enjeksiyon pipetini ferrin kanalları demetindeki bir kanala dikkatlice yerleştirin. Pipeti testis yönünde birkaç milimetre boyunca nazikçe ilerletin.Enjeksiyon pipetini sabit tutarak, ret testis ve ferous tübülleri dolmaya başladıkça hücreleri yavaşça enjekte edin; yüzeyde görünen tübüllerin neredeyse tamamı dolana kadar sabit bir akışı sürdürün. Aşırı doldurmayın, aksi takdirde testis iskemik hale gelecektir. Şimdi testisi karın boşluğuna geri yerleştirin ve prosedürü karşı taraftaki testiste tekrarlayın.İşlem tamamlandığında, karın duvarını 6-0 ipek sütürle kapatın ve cildi metal yara klipsleriyle kapatın. Amariyat sonrası, fareyi ev kafesine dönebilecek kadar anesteziden kurtarana kadar bir ısıtma pedi üzerinde izleyin. Gösterilecek ikinci prosedür olan testis dokusu xenotransplantasyonu, donörlerden alınan testis biyopsilerinin veya sağlam testislerin kullanımını içerir.Biyopsiler söz konusu olduğunda, testis fragmanlarını antibiyotik içeren buz soğukluğundaki kültür ortamında iki veya üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra süspansiyonu santrifüjle çöktürün ve pelletini alın. Yıkanmış dokuyu temiz bir kaba transfer edin ve transplantasyon için biyopsileri daha küçük fragmanlara bölün.Kavisli penset ve bistüri lamı kullanılarak, sağlam testislerin daha fazla hazırlık gerektirdiği görülür. İşleme, her bir testisi antibiyotik içeren buz gibi soğuk PBS ile iki veya üç kez yıkayarak başlayın. Ardından, temizlenen testisleri PBS içeren temiz bir kaba aktarın.Ardından, yüzey boyunca bir insizyon yaparak tunica vaginalis'i çıkarın ve testisleri dışarı çıkarın. Matris, korda spermatika, epididimis ve bağ dokusu gibi tüm aneks yapıları temizleyin. Çıkarılan testisleri soğuk PBS ile bir kez yıkayın ve PBS içeren bir kültür kabına aktarın.Ardından, bir bisturi ucu veya makas kullanarak tunica albuginea'yı dikkatlice çıkarın. Testisler çok küçükse, tunica, buzla doldurulmuş küçük bir kültür kabı içinde küçük bir insizyon aracılığıyla testisin dokusunu dışarı sıkarak çıkarılabilir. Soğuk besiyeri içinde, testisi önceden açıklandığı şekilde dikkatlice küçük parçalar halinde doğrayın.Son olarak, ksenogreft olarak kullanılacak doku fragmanlarını seçin ve ihtiyaç duyulana kadar buz soğukluğundaki kültür ortamı içeren kültür kaplarında izole edin. Bir fareyi daha önce açıklandığı gibi anestezi altına alın. Ardından fareyi bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin.Karın ve sırt bölgesindeki tüyleri kısaltarak steril cerrahi alanı hazırlayın. Karnı %70 ethanol ve Betadine solüsyonu ile silin. Kastrasyonu gerçekleştirmek için, abdominal duvarı açığa çıkaracak şekilde ventral orta hatta yarım ile bir santimetre uzunluğunda bir cilt insizyonu yapın.Ardından, abdominal boşluğu ortaya çıkarmak için abdominal duvarı kesin. Testisi, testiküler arteri ve epididimisi daha önce açıklandığı şekilde dikkatle açığa çıkarın. Daha sonra, kör diseksiyon yoluyla EPI'nin kuyruk kısmını gubernaculumdan ayırın.Ardından, testiküler arteri VA deferensi ile birlikte ipek sütürler kullanarak bağlayın. Daha sonra, testisler ile ligatür arasından keserek bağlanan yapıları ayırın. Aynı prosedür ikinci testis için tekrarlandıktan sonra, ekto pik xenograftları implante etmek için karın duvarını bir veya iki cerrahi dikişle dikin ve cilt insizyonunu bir veya iki mikroklips ile kapatın.Kastre edilmiş ve anestezi uygulanmış bir fareyi ventral rekumbent pozisyona getirin ve sırt bölgesinde steril bir cerrahi alan hazırlayın. Yerleştirilecek her bir greft için, deri insizyonunun kenarını tutmak amacıyla pens kullanarak orta hattın her iki yanına yarım santimetre uzunluğunda deri insizyonu yapın. Beş ila 10 milimetre derinliğinde bir subkütan boşluk oluşturmak için makas kullanın.Kapatma klipsine takılmayacak kadar derin bir greft alanı oluşturmak için bağ dokusunu ayırın. İnce bir pens kullanarak, iris pensi ile cilt insizyonunun kenarını tutarken, bir parça testis dokusunu deri altı boşluğunun derinliğine yerleştirin.Her bir cilt insizyonunu bir adet mik klips ile kapatın. Ardından farenin bir ısıtma pedinde anesteziden ayılmasına izin verin. Fare ayıldıktan sonra, onu kendi kafesine aktarın ve tamamen iyileşene kadar izlemeye devam edin.lae transgenini eksprese eden nakledilmiş donör spermatogonia kök hücrelerinin, nakilden iki ila üç ay sonra alıcının testisinde kolonize olduğu saptanmıştır iCal. Boyama, alıcının seminifer tübüllerinde belirgin mavi segmentleri ortaya çıkarmıştır. İyi yerleşmiş bir koloni, koloninin her iki ucunda merkeze daha yakın iki veya daha fazla mavi hücre tabakası içeren, tamamen dolu segmentlerden oluşan uzun, koyu mavi bir bölmeye sahiptir.Tekli çiftlerden veya küçük hücre gruplarından oluşan bir ağ da belirgindir. Koyu mavi seminifer tübül bölgesinin bir kesiti, farklı diferansiyasyon aşamalarında bulunan mavi germ hücreleri ile birlikte, iyi gelişmiş ve iyi organize olmuş Perato agenezisini ortaya koymuştur. Testis dokuları durumunda, immün yetersiz farelerin dorsal derisi altına nakledilen immatür donör testis kseno-greft fragmanları hayatta kalabilmiş ve fare gonadotropinlerine yanıt verebilmiştir.Sonuç olarak, fertilizasyon yeteneğine sahip sperm oluşumu da dahil olmak üzere, testis dokusu tam gelişim gösterdi. Testis xenograftları toplandıktan sonra, exy ve embriyo üretimi için sperm elde etmek amacıyla kullanıldılar. Sperm moron kök hücre transplantasyonu, testislerdeki kök hücre nişi etkileşimlerinin incelenmesi ve testis dokusu xenograft gelişiminin ardından sperm medicon kök hücrelerinin in vitro ortamda genişletilmesi için kültür koşullarının geliştirilmesi yoluyla kök hücre biyolojisi alanını ilerletmektedir.Bu teknik, erkek üreme biyolojisi alanındaki araştırmacıların, farelerden insanlara kadar çeşitli donör türlerinde spermatogenez, üreme toksikolojisi ve olgunlaşmamış erkeklerden genetik materyalin korunması gibi konuları incelemelerinin önünü açmıştır.

germ-cell-transplantation-and-testis-tissue-xenografting-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo</emAday Terapötik Ajanlar> Test

Erişkin farelerin spermatogoniumların ve progenitör hücre hatları türetmek ve korumak için basit bir yöntem sunulmuştur. Yöntemi yetişkin fare testis somatik hücre bölmesi kaynaklanan besleyici hücreler kullanır. Bu teknik transgenik, knock-out dahil, ortak fare suşları, uygulanabilir ve knock-fareler.

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Immünyetmezligi farelerde insan tümör ksenogratflardır kanser biyolojisi okumak için değerli araçlardır. Insan hepatoselüler karsinoma hücreleri ya da tümör fragmanlarından deri altı ve intrahepatik ksenograftları oluşturmak için özel protokolleri açıklanmıştır. Alıcı farede hepatektomiden tarafından uyarılan karaciğer rejenerasyon intrahepatik naklini kolaylaştırmak için bir strateji olarak sunulmuştur.

Bağışıklık yetersizliği olan farelere subkutan olarak ve intrahepatik insan hepatoselüler karsinoma ksenograftlarının Üretimi

Birincil invaziv kadavradan mesane kanseri zenograftlarını aşılamak için kurulan teknik laparotomi ve mesane seferberlik gerektirir. Bu prosedür, fareler üzerinde önemli morbidite uğratan teknik açıdan zor ve zaman alıcıdır. Bu nedenle perkütan yaklaşım ultrason rehberlik kullanarak, yüksek hassasiyet geliştirdi.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Karmaşık insan hastalıkları geleneksel laboratuvar modeli sistemlerinde modellemek zor olabilir. Burada, insan iskelet kası biyopsilerinin immünyonfik farelere nakli yoluyla insan kas hastalığını modellemek için cerrahi bir yaklaşım tanımlıyoruz.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Mevcut protokol, insan derisinin obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) farelere nasıl aşılanacağını açıklamaktadır. Nakil için insan derisinin hazırlanması, nakil için farelerin hazırlanması, bölünmüş kalınlıkta insan derisinin nakli ve nakil sonrası iyileşme prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması raporda yer almaktadır.

İnsan Bağışıklık Tepkilerini In Vivo'da Manipüle Etmek için Ksenograft Cilt Modeli

Burada, farelerde yuvarlak spermatid enjeksiyonu (ROSI) gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz, umut verici klinik uygulamaları olan ve embriyonik gelişimin altında yatan mekanizmaları araştırmak için faydalı bir teknik.

Fare Yuvarlak Spermatid Enjeksiyonu

Öğrenin farelerde germ hücre nakli ve testis dokusu xenografting tekniklerini. Spermatogonyal kök hücrelerin tanımlanması ve türler arası testis gelişiminin incelenmesi için bu yöntemleri keşfedin.

Germ Hücre Nakli ve Testis Dokusu Farelerde Xenografting

Daha fazla video keşfet