Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Aşağıdaki deneyin amacı, sekonder tümörler oluşmadan önce kanserin varlığını tespit etmektir. Bu işlem, öncelikle evre dört melanoma hastalarından kan örnekleri alınması ve ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kan, melanoma hücrelerinin tespitine ve izolasyonuna olanak tanıyan bir fotoakustik akış hücresine aktarılır.

Ardından, yakalanan hücreler, tespit edilen melanomanın varlığını doğrulamak için görüntülenir. Sonuçlar, sistemin fotoakustik dalga formları ve hücre görüntüleme tekniklerine dayanarak melanoma hücrelerini doğru ve hızlı bir şekilde tespit etme ve izole etme yeteneğini göstermektedir. Tekniğimizin; R-T-P-C-R, biyomanyetik hücre ayıklama ve diğer yöntemler gibi dolaşım yapan melanoma hücrelerini tespit eden mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yöntemimizin etiketsiz olması ve dolaşım yapan melanoma hücrelerinin yüzeylerini değiştirmeden veya onları bir substrata sabitlemeden yakalanmasına olanak tanımasıdır.

Metastatik kanser tespiti için bir numune hazırlamak üzere, öncelikle dördüncü evre kanser hastasından yaklaşık 10 mililitre tam kan alınmasıyla başlayın. Kanı iki adet beş mililitrelik vakutayner tüpe aktarın ve tüpleri 10 dakika boyunca santrifüjleyin. 3000 RPM'de kan örneği üç farklı katmana ayrılacaktır. Alt katman eritrositlerden oluşur.

Buffy coat olarak da adlandırılan orta katman lökositleri ve melanoma hücrelerini, üst katman ise plazmayı ve trombositleri içerir. Buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca fazla plazmayı uzaklaştırın. İki mililitrelik Eppendorf tüplerine 250 µL His-opaque 10 77 ekleyin.

Dokuz inçlik bir pastör pipeti kullanarak geri kalan plazmayı, Buffy coat tabakasının tamamını ve eritrositlerin üst katmanını çekin. 500 µL'den daha az toplandığından emin olun. Çözeltiyi önceden hazırlanmış wind Trobe tüplerine aktarın.

Kan yeniden ayrışacaktır, ancak bu kez eritrositler hispa tarafından ayrılacak ve böylece Buffy coat'un kolayca çıkarılması sağlanacaktır. Tüm Buffy coat'u izole etmek için dokuz inçlik bir Pesa pipeti kullanın ve bunu iki mililitrelik bir eend orph tüpüne yerleştirin. Ardından, bunu %2 hacim/hacim 20 ile 1,5 mililitrelik PBS içinde süspande edin.

Bir akış odası oluşturmak için, 20 mm dış çaplı ve 17 mm iç çaplı, sekiz milimetre uzunluğunda bir akrilik silindir ile başlayın. Ardından, silindirin yan tarafına birbirine 90 derecelik açılarla üç adet beş milimetre çapında delik açın. Son olarak üç parça polimer tüp kesin ve bunları açılan deliklere yerleştirin.

Su sızdırmaz bir conta oluşturmak için parafilmi akrilik halkanın altına gererek yayın. Parafilm, akrilik halka ile birlikte sığ bir kap oluşturacak ve akış hücresini meydana getirecek olan akrilamid çözeltisini tutacaktır. Birbirine tam karşı konumlanmış tüp parçalarından 1,6 milimetre çapında bir teli geçirin; telin, halkanın ortasından üçüncü tüp parçasına doğru tek başına görünür olduğundan emin olun.

1,6 milimetre çapında bir tel yerleştirin ve tüpü, askıda duran telden bir milimetre uzağa konumlandırın. Bu teller, akrilamidlerin tüpe girmesini önler. Beş mililitre akrilamid hazırlayın.

Ardından karışımı hızlıca akrilik halkanın içine dökerek üst kısma kadar doldurun. Birkaç saniye sonra çözelti jelleşecektir. Akrilamid jeli bozmamaya dikkat ederek telleri dikkatlice çekip çıkarın; böylece silindirik bir akış yolu ve akış yoluna odaklanmış bir optik fiber yerleştirmek için uygun bir alan oluşturun.

Akış hücresi, ultrason jeli kullanılarak akustik olarak kullanıma hazırdır. Bir poliviniliden florür piezoelektrik akustik transduseri, akış yolunun hemen üzerine gelecek şekilde akış hücresine bağlayın. Bir bayonet konnektör veya BNC kablo kullanarak, transduseri geniş bantlı bir alıcının girişine bağlayın.

Osiloskobu tetiklemek için filtrenin çıkışını osiloskoba bağlayın. Transdüserin yakınına bir fotodiyot yerleştirin ve bunu bir B NNC kablosu kullanarak osiloskoba bağlayın. Küçük bir hava cebi oluşana kadar akış hücresinin küçük tüpünü dışarı çıkarın ve transdüserle birleştirin.

Ardından, ara yüzey sinyallerini azaltmak ve akış yoluna uygulanan lazer ışığı miktarını artırmak için optik fiberi yerleştirin ve cebi suyla doldurun. Optik fiberin sayısal açıklığı ve akış yoluna olan kısa mesafe nedeniyle, lazer her seferinde yalnızca bir numune dilimini ışınlayacak ve böylece lazerin hemen önündeki numunenin, fotoakustik sinyalleri oluşturan numune ile aynı olmasını sağlayacaktır.

Ardından, akış odasının bir koluna bir T konnektörü ve konnektörün diğer dallarına iki şırınga pompası bağlayın. Şırıngalardan biri hava, diğeri ise önceden hazırlanmış hücre süspansiyonu içermelidir. Daha sonra her iki şırınga pompasını da çalıştırın.

İki kabul edilebilir akışkan T-eklemine ulaştığında, homojen sluglara ayrılacaklar ve transdüserin önünden geçecekler. Melanoma hücrelerindele fotoakustik dalgalar oluşturmak için akan numuneyi nanosaniye darbeli bir lazerle ışınlayın. Melanin geniş bantlı bir optik soğurucu olduğundan, herhangi bir görünür lazer dalga boyu kullanılabilir.

Salyangoz transduserin üzerindeyken osiloskopta beliren bir sinyal, salyangozun melanom içerdiğini gösterir. Salyangozu bir toplama tüpüne bırakmadan önce sistem boyunca takip edin. İmmünositokimya örneklerini hazırlamak için cam lamları sitohunilere yerleştirin ve yakalanan hücrelerin cam lamlara yapışmasına yardımcı olmak için onları santrifüjleme amacıyla sitospin cihazına yükleyin.

Her bir huniye 100 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin. Ardından 600 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, CyTOF hunileri için hücre örneklerini ekleyin ve tekrar 600 RPM'de üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Lamları etanol bazlı bir fiksatif ile püskürtme yöntemiyle sabitleyin. Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için lamları PBS ile iki kez 10 dakika boyunca yıkayın. Her lamı, 10 µL keçi serumu ve 90 µL PBS karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası lamları boşaltın ve primer antikor çözeltisini ekleyin. Her lam; PBS içinde %1 rabbit mark, bir adet %1 mouse CD 45 ve %10 goat serum içermeli; oda sıcaklığında, nemlendirilmiş bir bölmede bir saat boyunca inkübe edilmelidir. Ardından, lamları PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ardından slaytları, uygun floresan sekonder antikorlar içinde, oda sıcaklığında bir saat boyunca karanlıkta inkübe edin ve slaytlardaki sıvıyı dökün. Daha sonra, çekirdekleri boyamak için slaytları beş dakika boyunca üç kez PBS ile yıkayın, hücreleri 0,1 µg/mL DPI ile bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından slaytlardaki sıvıyı dökün ve PBS ile yıkayın.

Son olarak, reçine bazlı bir bağlama ortamı kullanarak hücre örneğinin üzerine bir lamel yerleştirin, lameli şeffaf oje ile mühürleyin ve floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Beyaz kan hücrelerinden ve melanoma hücrelerinden kaynaklanan fotoakustik dalga formları burada solda gösterilmiştir. Kendine özgü pigmentasyonu olmayan beyaz kan hücreleri fotoakustik dalga üretmezler ve sağda elektronik gürültünün oluşturduğu düz bir çizgi olarak görülürler.

Buna karşın, pigmente melanoma hücreleri güçlü bir fotoakustik dalga üretir. İmmünosito kimyasal boyamadan sonra, kültürlenmiş melanoma hücreleri mavi renkte benekli sinyaller gösterir; DPI için bindirilmiş görüntülerde işaretlenmiş olanlardan biri yeşil ile vurgulanmış, lökositlerin göstergesi olarak CD 45 ile işaretlenmiş olan ise belirtilmiştir. Bu şekil, gelişimi tamamlandıktan sonra çeşitli beyaz kan hücreleri arasındaki melanoma hücrelerini göstermektedir.

Tekniğimiz, kanser tespit alanındaki araştırmacıların, hem kanser tespitini geliştirmek hem de nihayetinde kanserin ölümcül yayılımını tedavi etmek amacıyla metastaz fenomenini keşfetmelerine yol açacaktır.