Name: Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Keşfedin, fotoakustik akış sitometresi kullanarak dolaşımdaki melanom hücrelerini etiketsiz tespit ve izole etme yöntemini. Erken metastaz teşhisi için hızlı, hassas ve hücre yüzeyini değiştirmeyen bu teknik, onkoloji araştırmalarında devrim yaratıyor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Biyoloji Mühendisliği ve University of Missouri Christopher S. Bond Life Sciences Merkezi Bölümü desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız. Biz Missouri Yaşam Bilimleri Araştırma Kurulu&#39;nun 09-1034 ve NIH R21CA139186-0 hibe desteği kabul etmiş sayılırsınız. Ayrıca, mali destek için, Missouri, Missouri Moleküler Sitoloji Core Üniversitesi ve University of Missouri College of Engineering Üniversitesi Yaşam Bilimleri Araştırma Fırsat Lisans Programı teşekkür ederiz.

1. Kan numune hazırlama <ol><li> Evre IV Kanser hastanın tam kan yaklaşık 10 ml, 5 ml iki vacutainers içine çizin. </li><li> On dakika boyunca dakikada 3.000 devrimler (rpm) tüpleri santrifüjleyin. </li><li> Kan numunesi üç farklı katmanları ayırmak, buffy coat denilen eritrosit, orta tabaka, alt tabaka oluşur, lökositler ve melanoma hücreleri içeren ve üst tabaka, plazma ve trombosit içerir. Buffy coat rahatsız etmeden, mümkün olduğu kadar plazma gibi çıkarın. </li><li> Yeri 250, iki adet 1 ml Wintrobe tüpleri Histopaque 1077 mcL. </li><li> 9 &quot;Pasteur Pipet kullanarak, &lt;500 mcL toplamak için emin olun, kalan plazma, tüm buffy coat, ve hatta en üst tabakası eritrositlerin ayıklayın. </li><li> Çözüm Histopaque katmanı tepesine yerleştirin ve 15 ml konik tüpler 3000 rpm&#39;de 10 dakika süreyle Wintrobe tüpler santrifüj. </li><li> Kan yenidenayrı, ama bu sefer eritrositler buffy coat kolay çıkarılması için izin Histopaque ayrılmış olacak. 9 &quot;Pasteur Pipet tüm buffy coat almak ve 2 ml Eppendorf tüp yerleştirmek için kullanın. </li><li> % 2 v / v Tween 20 ile 1.5 mL PBS buffy coat askıya alınması. </li></ol> 2. Akış Odası İnşaat <ol><li> Akrilik bir silindir, 20 mm dış çap, 17 mm iç çapı, 8 mm ve uzun boylu alın. Birbirlerine 90 derecelik açıyla yan silindir ile üç adet 5 mm çapında delikler delin. Polimer boru üç adet (1.6 mm iç çapı 5 mm dış çapı) Kes ve delinmiş deliklerin içine koyun. </li><li> Su geçirmez bir mühür yapmak için akrilik halkasının alt kısmında Parafilm gerin. Parafilm akrilik halka ile sığ bir kase formları ve bir akış odası oluşturacak olan akrilamid çözüm yapacak. </li><li> Karşısında boru parçaları ile 1.6 mm çaplı tel askıyasadece tel ring ortasında görünür olduğundan emin birbirlerine. Üçüncü parça, 1.6 mm çapında tel ve konumu tüp asma tel 1 mm ile boru doldurun. Bu teller tüp girmesini önlemek akrilamid. Akrilamid katılaşır sonra, teller, silindirik bir akış yolu ve bir yere bırakarak, bir fiber optik konumuna çıkartılacaktır akış yolu üzerine odaklanır. </li><li> [20 g akrilamid (Sigma Aldrich), 0.7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml distile su] küçük bir beher 5 ml hazırlanan akrilamid ekle. 0.02 g amonyum persülfat (Sigma) ölçün ve beher ekleyin. 3 dakika boyunca bir karıştırıcı ile karıştırın. Beher 20 mcL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) ekleyin. Hızla üst dolgu, akrilik halka içine karışımı dökün. Birkaç saniye sonra, çözüm, jel, bir akış odasında kalıp yapım olacak. Dikkatlice akrilamid jel rahatsız değil emin olun, teller çekin. Akış chamber artık kullanıma hazırdır. </li></ol> 3. Foto akustik flowmetre set-up <ol><li> Akustik çift ultrason jel kullanılarak doğrudan akış yolu üzerinde bir akış odasına polivinil florür piezoelektrik akustik transdüser (Panametrics). </li><li> Süngü Neill-Concelman (BNC) kablo kullanarak, bir RITEC Geniş Bant Alıcı-640A girişi (çıkışı, yüksek geçiren filtresi: 1 MHz Giriş Empedansı: 50 Ohm, amplifikasyon: 35 dB alçak geçiren filtre) transdüser bağlayın. Filtre çıkışı osiloskop (Tektronix TDS 2024B) bağlayın. Osiloskop tetiklemek için bir fotodiyot (Thorlabs) transdüser yakın kurmak ve bir BNC kablosu kullanarak osiloskop takılı. </li><li> Bir t-konnektör (Küçük Parça) akış odasının bir kola takılır. İki şırınga pompaları (Braintree Bilimsel) konektör diğer dallara bağlanır. Diğer bölüm 1 hazırlanan hücre süspansiyonu içeren bir şırınga, hava içerir. Akış oranları ayarlayın.100 mcL / dakika. </li><li> Akış odasının küçük tüp hava formlarının küçük bir cep kadar ayıklayın ve bu yuvaya 0.37 sayısal diyafram ile 1 mm çap çekirdekli fiber optik yerleştirin. Arabirim sinyallerini azaltmak ve akış yolu uygulanan lazer ışığı miktarı artırmak için su ile cebe doldurun. Lazer, fiber optik ve akış yolu kısa mesafe sayısal diyafram nedeniyle, doğrudan lazer önünde örnek foto akustik sinyalleri oluşturarak aynı örnek olmasını sağlamak, herhangi bir zamanda örnek bir sümüklü böcek ışın tedavisi olacaktır. Lazer enerjisi, bir spot büyüklüğü ile 7 mm 2 yaklaşık 28 mJ / cm 2 olmalıdır . </li><li> Iki şırınga pompaları açın. Iki karışmayan sıvılar t-kavşak yerine varınca homojen salyangozlar ve transdüser geçmiş akışı içine bölümlenmiş olacaktır. </li><li> Nanosaniyelik melanom hücrelerinde foto akustik dalgaları oluşturmak için lazer darbeli akan örnek ışın tedavisi. Melanin bir broadb olduğu gibive optik emici, görünür bir lazer dalga boyu kullanılabilir. </li><li> Bir sümüklü böcek transdüser tepesine bir sinyal osiloskop belirirse, sümüklü böcek melanom içeren ve bir koleksiyon şişenin içine bırakarak kadar sistem üzerinden takip edilmelidir. </li></ol> 4. İmmünositokimya <ol><li> Cam slaytlar bunları düzeltmek amacıyla yakalanan salyangozlar sitospin 4 Santrifüj (Thermo Scientific) ele alalım. Place cam Cytofunnels slaytlar (Kahverengi Filtre Kart Thermo Scientific Shandon EZ Tek Cytofunnel) ve sitospin 4 Santrifüj içine yerleştirin. Her huni içine PBS içinde% 1 (Sigma) Bovine Serum Albumin 100 mcL koyun ve daha sonra yakalanan hücrelerin cam slaytlar sopa yardımcı olmak için 3 dakika boyunca 600 rpm&#39;de santrifüj. </li><li> Santrifüj sonra, hücre örnekleri Cytofunnels ekleyin ve daha sonra 3 dakika boyunca 600 rpm&#39;de santrifüj. Sonra bir etanol bazlı fiksatif slaytlar spreyi. </li><li> PBS içinde slaytları iki kez 10 dakika boyunca yıkayın. </li><li&gt;, nonspesifik bağlanma blok Keçi Serumu 10 mcL (Sigma) ve oda sıcaklığında 1 saat 90 mcL PBS karışımı ile her slayt kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Inkübasyondan sonra, birincil antikor çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe slaytlar ve süzün. Her slayt% 1 tavşan büyüdü SMART-1 antikor fare gündeme CD-45 antikor,% 1,% 10 Keçi serumu ve% 89 PBS içermelidir. </li><li> Inkübasyondan sonra, slaytları PBS içinde 10 dakika üç kez yıkayın. </li><li> Daha sonra slaytlar fluorofor antikorlara bağlı ikincil bir antikor çözüm, inkübe edilir. Karışımı anti-tavşan antikoru% 0.05 keçi,% 0.05 &#39;i keçi anti-fare antikor,% 0.1&#39; keçi serumu ve% 99 PBS içerir. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Inkübasyondan sonra, slaytlar, 5 dakikada üç kez PBS içinde yıkayın süzün. </li><li> Bir çekirdek için leke DAPI 0.1 mikrogram / mL (Invitrogen) hücreleri inkübasyon1 dakika. Sonra süzün ve slaytları PBS içinde yıkayın. </li><li> 20 mcL kullanarak slayt başına bir reçine bazlı montaj medya hücre örneği üzerinde lamel monte edin. Slayt korumak için şeffaf tırnak cilası ile lamel Seal. Şimdi slaytlar floresan mikroskop ile görüntülü olmaya hazırız. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 beyaz kan hücreleri ve melanom hücrelerinin foto akustik dalga şekilleri burada gösterilmiştir. Doğasında herhangi bir pigmentasyon olan beyaz kan hücreleri, elektronik gürültü düz bir çizgi (sol) olarak, hiçbir foto akustik dalgaları ve tezahür üretmek. Pigmentli melanom hücrelerinin sağlam bir foto akustik dalga (sağda) üretir. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. immünositokimyasal boyama sonra, kültürlü melanom hücrelerinin bl DAPI sinyalleri gösteriyorue ise MART1 yeşil vurgulanır. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. CD45 lökositlerin bir göstergesi olarak, Şekil 2&#39;de, DAPI ve MART1 görüntüleri kaplanacağı, bu rakam, bazı beyaz kan hücreleri arasında melanom hücreleri gösterir .

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator Viator Technologies Inc, insan sağlığının iyileştirilmesi için foto akustik teknolojileri ticarileştirmek için kurulmuş bir şirket kurucusu ve başkanı.

Nedenle kapalı zaman eğrileri algılama nadir tümör hücreleri izole zor bir problem nedeniyle çok az sayıda klinik uygulamaları ile hala yoğun bir araştırma alanı. CTC algılama, RT-PCR, mikroakışkan hücre yakalama, immunomagnetic yakalama ve diğer yöntemlerle 8-12 dahil pek çok diğer teknikler değerlendirilmektedir . Ücretsiz etiket ve küçük, ışık emici parçacıkları yakalamak için hızlı ve doğru bir yol sağlar Ancak, CMCs gösterir foto akustik algılama söz veriyorum. Protokol, beyaz kan hücreleri izole etmek için açıklanan son derece verimli, ama kırmızı kan hücrelerinin az sayıda örnek var. Bu rouge kirlenmesine neden olan hücreleri de lazer ışığı emer, ancak büyük ölçüde azalmış bir düzeyde. Kırmızı kan hücreleri, bizim melanom algılama sistemi ile karışmaz sağlamak için, sistem üzerinden beş sağlıklı hasta numunelerinin getirilmiştir ve hiçbiri, kırmızı kan hücrelerinin yeterince düşük konsantrasyonlarda mevcut olduğunu gösteren bir sinyal verdidikkate alınmayacaktır. Konsantrasyon çalışmaları bir dizi kültür melanoma hücreleri kullanarak ve foto akustik akış sistemi hassas aşağı 1 hücre / mcL (yayınlanmamış veri) olduğu kanıtlanmıştır yapılmıştır. Bu çalışmalar, devam eden ve yakında kanser hasta numuneleri kullanılarak çalışmalarda yer alacak. Bu foto akustik tekniği de eksojen kromoforlar ekleyerek meme ve prostat kanseri gibi olmayan pigmentli nedenle kapalı zaman eğrileri, kullanmak için değerlendirilmektedir. Biz kanser cells13 altın nanopartiküller kullanarak ön çalışma gerçekleştirdik. Bu testler nanopartiküller foto akustik dalgaları üretmek için gerekli optik soğurma sağlayabileceğini göstermiştir. Kalan teknik zorluk gibi parçacıklar kanser hücrelerini seçici eklemek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

sirkülasyon melanom hücreler foto akustik flowmetre kullanarak algılama ve İzolasyonu

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Dolaşımdaki tümör hücreleri (nedenle kapalı zaman eğrileri), makroskopik tümör ayrılmış ve kan ve lenf sistemleri tohum ikincil tümörler 1,2,3 yoluyla yayılan bu hücrelerdir . Nedenle kapalı zaman eğrileri metastatik hastalığı ve kan örnekleri algılama göstergeleri kanser teşhis ve hastanın tedaviye yanıtı izlemek için kullanılıyor olabilir. Nedenle kapalı zaman eğrileri nadir olduğundan, bir tümör ileri evre kanser hastalarında, normal kan hücreleri milyarlarca arasında hücre, bunların tespiti ve sayımı ile ilgili oluşan zor bir iştir. Foto akustik oluşturmak için en melanom hücrelerinde pigment varlığı istismar veya lazer, ultrasonik dalgalar dolaşan melanom hücrelerinin (CMCs) 4,5 tespiti için özel bir akış sitometresi indüklenen . Bu süreç, santrifüj kullanılarak ve beyaz kan hücre tabakasından elde tam kan örneği ayıran gerektirir. Varsa tam kan, CMCs beyaz kan hücreleri ile benzer yoğunluğu nedeniyle ayrı olacaktır. Bu hücreler yeniden süspansefosfat tamponlu salin (PBS) ve debimetre içine tanıtıldı. Kan hücre süspansiyonu sürekli bir akış yerine, daha fazla çalışma için bu hücreleri yakalamak için iki faz akış kaynaklı. İki fazlı akış, bir mikroakışkan sistemde iki karışmayan sıvılar sıvı 6,7 salyangozlar bir alternatif kavşak ve form buluşuyor. PBS, sırayla, lazer ışığı ile ışınlanmış beyaz kan hücreleri ve hava form mikrolitrelik salyangozlar askıya aldı. Sıvı faz bir yüzey yanı sıra düzgün sümüklü böcek oluşumunu sağlar ve kullanıcı iki faz akış oranları değiştirerek farklı büyüklükteki salyangozlar oluşturabilirsiniz. Beyaz kan hücreleri ile hava ve PBS salyangozlar salyangozlar ışık emiciler içeren ve dolayısıyla, foto akustik dalgaları üretmek değil. Ancak, salyangozlar, hatta tek bir CMCs içeren beyaz kan hücrelerinin lazer ışığı emer ve yüksek frekanslı akustik dalgalar üretir. Foto akustik dalgaları oluşturan bu salyangozlar verific birikir ve Sitokimyasal boyama için toplananCMCs, ation.

Biz lazer kaynaklı ultrason kullanılarak dolaşımdaki melanom hücrelerinin metastatik hastalığın erken bir göstergesi olarak algılamak için bir akış sitometresinin geliştirdik.

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Dolaşan tümör hücreleri (DTH'ler), makroskobik bir tümörden ayrılan ve tohumlama yapmak amacıyla kan ve lenf sistemleri aracılığıyla yayılan hücrelerdir...

Aşağıdaki deneyin amacı, sekonder tümörlerin oluşumundan önce kanserin varlığını tespit etmektir. Bu, öncelikle evre dört melanom hastalarından kan örnekleri alınması ve ayrıştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım olarak kan, melanom hücrelerinin tespitine ve izolasyonuna olanak tanıyan bir fotoakustik akış odasına aktarılır.Ardından, yakalanan hücrelerin görüntülemesi yapılarak tespit edilen melanomanın varlığı doğrulanır. Sonuçlar, sistemin fotoakustik dalga formları ve hücre görüntüleme tekniklerine dayanarak melanoma hücrelerini doğru ve hızlı bir şekilde tespit etme ve izole etme yeteneğini göstermektedir. Tekniğimizin, R-T-P-C-R, biyomanyetik hücre ayırma ve diğer yöntemler gibi dolaşım yapan melanoma hücrelerini tespit eden mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yöntemimizin etiketsiz olması ve dolaşım yapan melanoma hücrelerinin yüzeylerini değiştirmeden veya onları bir substrata sabitlemeden yakalanmasına olanak tanımasıdır.Metastatik kanser tespiti için bir örnek hazırlamak üzere, dördüncü evre kanser hastasından yaklaşık 10 mililitre tam kan alarak başlayın. İki adet beş mililitrelik vacutainer santrifüj tüpünü 10 dakika boyunca 3000 RPM'de santrifüjleyin. Kan örneği üç farklı katmana ayrılacaktır. Alt katman eritrositlerden oluşur.Buffy coat olarak da adlandırılan orta katman lökositleri ve melanoma hücrelerini, üst katman ise plazma ve trombositleri içerir. Buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca fazla plazmayı uzaklaştırın. İki mililitrelik Eppendorf tüplerine 250 µL opak His 10 77 ekleyin.Dokuz inçlik bir pastör pipeti kullanarak kalan plazmayı, Buffy coat tabakasının tamamını ve eritrositlerin üst katmanını çekin. 500 µL'den daha az topladığınızdan emin olun. Çözeltiyi daha önce hazırlanmış wind Trobe tüplerine aktarın.Kan yeniden ayrışacaktır, ancak bu kez eritrositler hispa ile ayrılacak ve böylece Buffy coat'un kolayca çıkarılmasına izin verecektir. Tüm Buffy coat'u izole etmek için dokuz inçlik bir Pesa pipeti kullanın ve bunu iki mililitrelik bir eend orph tüpüne yerleştirin. Ardından bunu, %2 hacimce hacim oranında 20 ile PBS içeren 1,5 mililitre içerisinde süspande edin.Bir akış odası oluşturmak için, 20 mm dış çapta ve 17 mm iç çapta, sekiz milimetre uzunluğunda bir akrilik silindir ile başlayın. Ardından, silindirin yan yüzeyine birbirine 90 derecelik açılarla konumlandırılmış üç adet beş milimetre çapında delik açın. Son olarak üç parça polimer tüp kesin ve bunları açılan deliklere yerleştirin.Sızdırmaz bir conta oluşturmak için akrilik halkanın altına para film gerin. Para film, akrilik halka ile birlikte sığ bir kap oluşturacak ve akış hücresini meydana getirecek olan akrilamid çözeltisini tutacaktır. Birbirine tam karşı konumlanmış tüp parçalarından geçecek şekilde 1,6 milimetre çapında bir teli asın ve halkanın ortasından bakıldığında üçüncü tüp parçasına doğru sadece telin göründüğünden emin olun.1,6 milimetre çapında bir tel yerleştirin ve tüpü, asılı telden bir milimetre uzağa konumlandırın. Bu teller, akrilamidin tüpün içine girmesini engeller. Beş mililitre akrilamid hazırlayın.Ardından karışımı hızlıca akrilik halkaya dökerek üst kısmına kadar doldurun. Birkaç saniye sonra solüsyon jelleşecektir. Akış odası kalıbı oluştururken, akrilamid jeli bozmamaya dikkat ederek telleri dikkatlice çekin; böylece silindirik bir akış yolu ve akış yoluna odaklanmış bir optik fiber yerleştirmek için bir alan bırakmış olursunuz.Akış odası, akustik olarak ultrason jeli kullanılarak kullanıma hazır hale getirilmiştir. Bir poliviniliden florür piezoelektrik akustik transduseri, akış yolunun hemen üzerine gelecek şekilde akış odasına bağlayın. Bayonet konnektör veya BNC kablo kullanarak, transduseri bir geniş bant alıcının girişine bağlayın.Osiloskopu tetiklemek için filtrenin çıkışını osiloskoba bağlayın. Transdüserin yakınına bir fotodiyot yerleştirin ve onu bir B NNC kablosuyla osiloskoba bağlayın. Küçük bir hava cebi oluşana kadar akış odasının küçük tüpünü dışarı çekin ve transdüser ile birleştirin.Ardından optik fiberi yerleştirin ve arayüz sinyallerini azaltmak ve akış yoluna uygulanan lazer ışığı miktarını artırmak için cebi suyla doldurun. Optik fiberin sayısal açıklığı ve akış yoluna olan kısa mesafe nedeniyle, lazer herhangi bir zamanda yalnızca tek bir numune dilimini ışınlayacak ve böylece lazerin hemen önündeki numunenin, fotoakustik sinyalleri oluşturan numuneyle aynı olmasını sağlayacaktır.Ardından, akış hücresinin bir koluna bir T konnektörü ve konnektörün diğer kollarına iki şırınga pompası bağlayın. Şırıngalardan biri hava, diğeri ise daha önce hazırlanmış hücre süspansiyonu içermelidir. Daha sonra her iki şırınga pompasını çalıştırın.İki kabul edilebilir akışkan T eklemine ulaştığında, homojen sluglara ayrılacaklar ve transduserin yanından akacaklardır. Melanoma hücrelerinde fotoakustik dalgalar oluşturmak için akan numuneyi nanosaniye darbeli bir lazerle ışınlayın. Melanin geniş bantlı bir optik soğurucu olduğundan, herhangi bir görünür lazer dalga boyu kullanılabilir.Bir sülük transduserin üzerindeyken osiloskopta beliren bir sinyal, sülüğün melanoma içerdiğini gösterir. Sülüğü toplama tüpüne bırakmadan önce sistem boyunca takip edin. İmmünositokimya için numuneleri hazırlamak amacıyla, cam lamları sitohunilere yerleştirin ve yakalanan hücrelerin cam lamlara yapışmasına yardımcı olmak için sitosporun içine yükleyip santrifüjleyin.Her bir huniye 100 µL %1 BSA içeren PBS ekleyin. Ardından üç dakika boyunca 600 RPM'de santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, CyTOF hunileri için hücre örneklerini ekleyin ve ardından üç dakika boyunca 600 RPM'de santrifüj edin.Lamlar üzerine etanol bazlı bir fissküratif püskürtün. Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için lamları iki kez 10 dakika boyunca PBS ile yıkayın. Her bir lamı, 10 µL keçi serumu ve 90 µL PBS karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından lamları boşaltın ve primer antikor solüsyonunu ekleyin. Her lam; PBS içerisinde %1 rabbit mark, bir adet %1 mouse CD 45 ve %10 goat serum içermeli; oda sıcaklığında, nemlendirilmiş bir bölmede bir saat boyunca inkübe edilmelidir. Ardından, lamları PBS ile üç kez 10 dakika boyunca yıkayın.Ardından, lamları uygun floresan sekonder antikorlar ile karanlıkta, oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve lamlardaki sıvıyı dökün. Daha sonra, çekirdekleri boyamak için lamları PBS içinde beşer dakikalık üç yıkama işleminden geçirin, hücreleri 0,1 µg/mL DPI ile bir dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında lamlardaki sıvıyı dökün ve PBS ile yıkayın.Son olarak, reçine bazlı bir montaj ortamı kullanarak hücre örneğinin üzerine bir lamella yerleştirin, lamellayı şeffaf oje ile mühürleyin ve floresan mikroskop ile görüntüleyin. Beyaz kan hücrelerinden ve melanoma hücrelerinden gelenle fotoakustik dalga formları burada solda gösterilmiştir. Kendine özgü pigmentasyonu olmayan beyaz kan hücreleri fotoakustik dalga üretmezler ve sağda elektronik gürültüden oluşan düz bir çizgi şeklinde görünürler.Bununla birlikte, pigmente melanoma hücreleri güçlü bir fotoakustik dalga üretirler. İmmünositokimya ve kimyasal boyama sonrası, kültürlenmiş melanoma hücreleri mavi renkte benekli sinyaller verir; DPI için üst üste bindirilmiş görüntülerde işaretli olanlardan biri yeşil ile vurgulanmış, lökositlerin bir göstergesi olarak CD 45 ile işaretli olan ise belirtilmiştir. Bu şekil, gelişiminin ardından birkaç beyaz kan hücresi arasındaki melanoma hücrelerini göstermektedir.Tekniğimiz, kanser tespiti alanındaki araştırmacıların, hem kanser tespitini geliştirmek hem de nihayetinde ölümcül yayılımını tedavi etmek amacıyla metastaz fenomenini keşfetmelerinin önünü açacaktır.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanılarak bir primer melanom hücre hattından CD133 negatif ve pozitif melanom kök hücrelerinin izole edilmesi tekniği açıklanmaktadır. CD133 pozitif melanom CSC'leri, melanom tümörigenezisinin mekanizmalarını anlamak için daha fazla incelenmiştir.

Melanom Kök Hücre İzolasyonu: Manyetik Aktivasyonlu Hücre Sıralaması Kullanılarak CD133 Pozitif ve Negatif Melanom Hücreleri Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, dolaşımdaki bir in vitro akış odasında nanopartiküller taşıyan yumurtalık kanseri hücrelerinin fotoakustik akış sitometrik tespitini sunuyoruz. Bu non-invaziv teknik, bir kontrast madde kullanarak bir akış sisteminde dolaşan tümör hücrelerini başarıyla tanımlar.

İn Vitro Fotoakustik Akış Sitometrisi: Nanopartikül Taşıyan Dolaşımdaki Yumurtalık Kanseri Hücrelerini Tespit Etmek İçin İnvaziv Olmayan Bir Akış Fotoakustik Tekniği

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif...

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

3D sferoidlerin iç G1 tutuklanan ve dış proliferatif bölgelerindeki hücreleri tanımlamak ve izole etmek için floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (FUCCI) ve görüntü analizi veya akış sitometrisi kullanarak iki tamamlayıcı yöntemi açıklıyoruz.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Burada malzemeyi tahmin ve toplam iç yansıma ile birlikte foto akustik efekti kullanarak optik özellikleri yüzey bir protokol mevcut. Bu teknik, kaybolan alan bazlı photoacoustics optik özellikleri malzemelerin kalınlık, kütle ve ince film kırılma indislerine tahmin etmek için bir foto akustik metroloji sistemi oluşturmak ve keşfetmek için kullanılabilir.

Evanescent Alan Bazlı photoacoustics: Optik Mülkiyet Değerlendirme Yüzeylerde

Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Özel yapım fotoakustik akış sistemi ve hedeflenen folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri kullanarak dolaşan yumurtalık tümör hücrelerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Bu protokol, murin FFPE melanom dokularının DNA barkod tabanlı görüntülenmesi için bir multipleks immünofloresan antikor paneli tasarlamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Ayrıca, murin melanom tümörü bağışıklık mikro ortamına ilişkin uzamsal proteomik içgörüler oluşturmak için açık kaynaklı araçlar kullanan bir görüntü analizi boru hattını da açıklıyoruz.

Genetik Olarak Yeniden Programlanmış Murin Melanomundan FFPE Örneklerini Analiz Etmek için DNA Barkod Tabanlı Multipleks İmmünofloresan Görüntüleme

Keşfedin, fotoakustik akış sitometresi kullanarak dolaşımdaki melanom hücrelerini etiketsiz tespit ve izole etme yöntemini. Erken metastaz teşhisi için hızlı, hassas ve hücre yüzeyini değiştirmeyen bu teknik, onkoloji araştırmalarında devrim yaratıyor.

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Daha fazla video keşfet