Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Bu prosedürün genel amacı, protein absorbsiyon çalışmalarında kullanılmak üzere yapay membranlarda nanoporlar oluşturmaktır. Bu işlem, bir gövde kullanılarak nitrür bir membranda nanoporlar delinmesiyle gerçekleştirilir. Ardından nanopor bir hazneye yerleştirilir ve iyonik bir çözelti ile ıslatılır.

Böylece sıvı, nanoporun bir tarafından diğerine bir köprü oluşturarak nanoporu deneyler için hazır hale getirir. Üzerinden bir voltaj uygulanır ve iyonların geçtiği bir akım gözlemlenebilir. Son adım, Nanopore haznesine protein eklemektir.

Nanogözenek boyunca iyonik akımdaki uzun süreli blokajların gözlemlenmesi, nihayetinde proteinlerin nanogözenek kenarlarına tutunduğunu ortaya çıkarır. Merhaba, ben Dave Wicki. Syracuse Üniversitesi Fizik Bölümü'nde lisansüstü öğrencisiyim.

Bu yöntem, proteinlerin inorganik yüzeylerdeki absorbsiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, protein-nükleik asit etkileşimleri, tek molekül spektroskopisi ve kısıtlı alanlardaki moleküllerin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. İşleme, stem kısmını bir hızlandırma voltajına getirerek başlayın.

Ardından, bir SPI silikon nitrür pencere ızgarasını TEM numune tutucuya yerleştirin. Kalıntıları temizlemek için ızgarayı 30 saniye boyunca oksijen plazması ile temizleyin. Numuneyi yerleştirmeden önce, numune tutucuyu TEM'e yerleştirin ve vakumun boşalmasını bekleyin.

Brightfield TEM modunu kullanarak, ham programdaki parlak bir kare olan nitrür penceresini bulun. TEM'in düzgün şekilde hizalandığından emin olun. Ardından numuneyi hizalayın ve odaklayın.

Şimdi sistemi STEM moduna getirin ve numuneyi görüntülemek ve hizalamasını kontrol etmek için sıcak bir dedektör (hot off detector) kullanın. Eğer mevcutsa, delme işlemi için daha yüksek bir elektron akımı sağlamak amacıyla monokromatörü düşük bir değere ayarlayın. Elektron probunun çapına bağlı olarak, nanoporu delmek için uygun nokta boyutunu seçin.

Sap hizalandığında, gereken büyütmede nitrür membrana mükemmel şekilde odaklanmak için BROGRAM'ı kullanın. Numunede herhangi bir hareket varsa, elektron demetini kapatın ve numunenin stabilize olmasını bekleyin.

Bu işlem bir saate kadar sürebilir. Stabilizasyon sağlandıktan sonra, elektron probunu numunenin üzerine yerleştirin ve nanoporu delmeye başlayın. Bir TM ile nanopor delmek, sabırlı bir titizlik gerektirir.

Bu, nitrürün bir elektron demeti probu altında kademeli olarak yok edildiği bir işlemdir. Elektron probunun doğrudan delme bölgesinin üzerinde tutulması ve nanogözeneklemin tamamen gerçekleştiğinin onaylanması önemlidir. Numuneyi TEM'den çıkarmadan önce, sıcaklık kapalı dedektörü ile tarama yaparak numuneyi periyodik olarak kontrol edin.

Numune hafifçe kayarsa, elektron probunun konumunu nanoporun üzerine gelecek şekilde ayarlayın. ROI gram odağa geldiğinde, titreyen nitrür film kaybolacaktır. Roky gram odak dışında olduğunda nanopor oluşurken, aşınmış tırnak kenarı görünür olur.

Isıtıcı kapalıyken nanoporun görüntüsünü alın ve görüntünün yoğunluk profilini oluşturun. Nanoporun çapı, profilin en karanlık bölgesinden tahmin edilebilir. Gerektiğinde, nanoporu genişletmek için elektron probu kullanılabilir.

Gerekli çap elde edildiğinde, monokromatör standart ayardayken TEM moduna geçiniz. Gözenek boyutunu onaylamak için brightfield TEM kullanınız.

İşe gazı alınmış salin hazırlayarak başlayın. Solüsyonu vakum altına alın ve 20 dakika boyunca sonikatör banyosuna yerleştirin. Silikon nitrür çip içeren hassas Nanopore'u dikkatlice 10 mililitrelik bir Pyrex behere yerleştirin. Ardından, çeker ocak içerisinde beheri bir ısıtıcı plaka üzerine koyun.

Nanopore çipini piranha çözeltisi ile çok dikkatli bir şekilde temizleyin. İlk olarak, bir cam pipet kullanarak kaba üç mililitre sülfürik asit ekleyin. İkinci olarak, sülfürik aside dikkatlice bir mililitre yüksek konsantrasyonlu hidrojen peroksit ekleyin.

Lütfen tüm önlemleri alın. Nanogözenekli çipin 10 dakika boyunca bekletilmesine izin verin. Ardından, cam bir pipet kullanarak piranha solüsyonunu beherden çıkarın ve uygun şekilde bertaraf edin.

Ardından, beherin içerisini gazı alınmış deiyonize su ile doldurun. Temiz bir cam pipet kullanarak beherdeki suyu boşaltın ve bu yıkama işlemini en az beş kez tekrarlayın. Temiz bir cımbızla nanopore çipini çıkarın ve hafif vakumlama ile kurulayın.

Kuruduktan sonra, nanopore çipini derhal hazneye yerleştirip sızdırmaz hale getirin. Çip, hazneye O-ringler veya silikon sızdırmazlık malzemesi ile sabitlenebilir. Hazneyi potasyum klorür çözeltisi ile doldurun.

Gümüş, gümüş klorür elektrotları hazneye bağlayın. Elektrotlar, gümüş telin gece boyunca çamaşır suyunda bekletilmesiyle hazırlanabilir. Elektrotlar üzerinden bir transmembran potansiyel uygulayın ve akım tepkisini bir patch clamp amplifikatörü kullanarak izleyin.

Voltaj kenetleme modunda, ölçümlerden bir akım-voltaj eğrisi oluşturun. Eğri yüksek derecede lineer olmalıdır. Bir molar potasyum klorür kullanıldığında, nanoporun iletkenliği çapı ile uyumlu olmalıdır.

Nanogözenek doğrusal bir IV eğrisi göstermiyorsa, iletkenlik çok düşük veya nanogözenek açık akımı stabil değildir. Bu durum, nanogözeneğin düzgün şekilde yerleşmediğini gösterir ve piha yıkama işlemi tekrarlanmalıdır. Nanogözeneğin içinde sıvı olduğundan emin olmak esastır.

Bu adım düzgün bir şekilde gerçekleştirilmezse, nanopor üzerinden geçen iyon akımında çok yüksek gürültü görülecek ve proteinlerin nanopora girişi önemli ölçüde azalacaktır. İlk olarak, ilgilenilen proteinin saflaştırılmış bir örneğini haznenin topraklanmış banyosuna ekleyin. Örneği iyice yayılana kadar bekleyin.

İncelenen proteinin toplam yükünün tersi polaritede bir transmembran potansiyel voltaj biyası uygulayın. Uygulanan 200 milivoltluk bir potansiyel, gözlem yapmak için yeterince büyük olacaktır. Çoğu protein analit olayı, baz çizgisine göre geçici akım sapmaları şeklinde görünecektir.

Sinyal gözlenmezse, bölmedeki protein konsantrasyonunu artırın. Daha yüksek voltajlar, sinyal-gürültü oranını ve nitriti iyileştirir. Nanogözenekler birkaç volta dayanabilir.

Protein adsorpsiyonları, Nanopore'un bazal akımında uzun süreli değişimler olarak görülecektir. Katı hal nanoporlar için tipik sonuçlar şu şekilde olacaktır. Açık por akımı oldukça stabil olmalıdır.

Nanogözeneklerin IV karakteristikleri yüksek derecede doğrusal olmalıdır. 1 molar potasyum klorür, 10 molar potasyum fosfat pH 7.4 içerisinde, IV eğrisine yapılan doğrusal uyumun eğimi, nanogözeneğin birim iletkenliğini verecektir. İletkenlik, nanogözenek çapı ile doğrudan ilişkilidir ve denklemle örtüşmelidir.

Bu değer %30 tolerans dahilinde eşleşmelidir. Değer çok küçükse, gözenek muhtemelen protein eklemesiyle birleşmemiştir. Protein emilimi uzun süreli bir akım düşüşü olduğundan, ardından hızlı olaylar gerçekleşmelidir. Bazı proteinler oldukça labildir ve gözenek içinde yapısal dönüşüme uğrar.

Bu durumda, uzun süreli voltaj düşüşüne hızlı dalgalanmalar eşlik edecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bir taramalı geçirimli elektron mikroskobu kullanarak katı hal nanoporların nasıl üretileceği ve bunların SA protein absorbsiyonu için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Piranha çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak içerisinde eldiven, laboratuvar önlüğü ve kimyasal önlük gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.