Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Bu prosedürün genel amacı, protein absorpsiyon çalışmalarında kullanılmak üzere yapay zarlarda nanogözenekler oluşturmaktır. Bu, bir gövde kullanılarak bir nitrür zarında nanogözeneklerin delinmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra nanopor bir odaya yüklenir ve iyonik bir çözelti ile ıslatılır.

Böylece bu sıvı, nanoporu deneylere hazır hale getirmek için nanoporun bir tarafından diğer tarafına bir köprü oluşturur. Üzerine bir voltaj uygulanır ve içinden bir iyon akımının geçtiği gözlemlenebilir. Son adım, Nanopor odasına protein eklemektir.

Sonuç olarak, nanopor boyunca iyonik akımda uzun süreli blokajları gözlemlemek, proteinlerin Nanopor'un kenarlarına emilimini ortaya çıkarır. Merhaba, ben Dave Wicki. Syracuse Üniversitesi Fizik Bölümü'nde yüksek lisans öğrencisiyim.

Bu yöntem, proteinlerin inorganik yüzeylerde emilmesi hakkında fikir verebilir. Protein, nükleik asit etkileşimleri, spektroskopi için tek molekül ve kapalı alanlarda moleküllerin incelenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Gövdeyi bir hızlanma voltajına getirerek başlayın.

Bir sonraki yük, TEM numune tutucusuna bir SPI silikon nitrür pencere ızgarası. Kalıntıları temizlemek için ızgarayı oksijen plazması ile 30 saniye temizleyin. Numuneyi yüklemeden önce, numune tutucuyu TEM'e yükleyin ve vakumun aşağı pompalanmasına izin verin.

Brightfield TEM modunu kullanarak, ham rogram üzerinde parlak bir kare olan nitrür penceresini bulun. TEM'in doğru şekilde hizalandığından emin olun. Ardından örneği hizalayın ve odaklayın.

Şimdi sistemi STEM moduna getirin ve numuneyi görüntülemek ve hizalamasını kontrol etmek için bir sıcak kapalı dedektörü kullanın. Varsa monokromatörü düşük bir değere ayarlayın, böylece delme için daha yüksek bir elektron akımı elde edilebilir. Elektron probunun çapına bağlı olarak Nanoporu delmek için uygun nokta boyutunu seçin.

Gövde hizalı olarak. Gerekli büyütme oranında nitrür membrana mükemmel bir şekilde odaklanmak için BROGRAM'ı kullanın. Numunede herhangi bir hareket varsa, elektron ışınını boşaltın ve numunenin stabilize olmasını bekleyin.

Bu işlem bir saat kadar sürebilir. Stabilize edildikten sonra, elektron probunu numunenin üzerine yerleştirin ve nano gözeneği delmeye başlayın. TM ile bir nanopor delmek hasta sadakatsizliği gerektirir.

Bu, nitrürün bir elektron ışını probu altında kademeli olarak dağıtıldığı bir süreçtir. Elektron probunu doğrudan delme alanının üzerinde tutmak ve nanoporun tamamen delindiğini doğrulamak önemlidir. Numuneyi TEM'den çıkarmadan önce, sıcak kapalı dedektörü ile tarayarak numuneyi periyodik olarak kontrol edin.

Numune hafifçe sürüklenirse, elektron probunun konumunu nano gözeneğin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. ROI gramı odaktayken, parıldayan nitrür filmi kaybolacaktır. Nanopor, roky gram odak dışındayken oluştuğunda, yıpranmış tırnak saçağı görünür.

Nanoporu sıcak kapalı olarak görüntüleyin ve görüntünün yoğunluk profilini yapın. Nanoporun çapı, profilin en karanlık bölgesi ile tahmin edilebilir. Elektron probu, gerekirse nanoporu büyütmek için kullanılabilir.

İstenilen çapa sahip olduğunda. Monokromatör standart ayardayken TEM moduna geçin. Gözenek boyutunu doğrulamak için parlak alan TEM'i kullanın.

Degas di salin hazırlayarak başlayın. Çözeltiyi vakum altına koyun ve 20 dakika boyunca bir banyo sonikatına Hassas bir şekilde, silikon nitrür içeren kırılgan Nanopore Chip'i 10 mililitrelik bir Pyrex gagasına yerleştirin. Sonra bir davlumbazda, kabı sıcak bir tabağa yerleştirin.

Nanopore çipini piranha çözeltisi ile çok dikkatli bir şekilde temizleyin. İlk olarak, bir cam pipet kullanarak kabın içine üç mililitre sülfürik asit ekleyin. İkinci olarak, sülfürik aside dikkatlice bir mililitre yüksek hidrojen peroksit ekleyin.

Lütfen tüm önlemleri alın. Nanopor çipin 10 dakika ıslanmasına izin verin. Daha sonra bir cam pipet kullanarak pirana çözeltisini beherden çıkarın ve uygun şekilde atın.

Ardından, kabı Degas deiyonize su ile doldurun. Temiz bir cam pipet kullanarak, su kabını boşaltın ve bu yıkamayı en az beş kez tekrarlayın. Temiz cımbızla nanopor çipini çıkarın ve hafif emerek kurulayın.

Kuruduktan sonra, nanopor çipini hemen hazneye kapatın. Çip, O-ringler veya silikon dolgu macunu ile hazneye sabitlenebilir. Hazneyi potasyum klorür çözeltisi ile doldurun.

Gümüş, gümüş klorür elektrotlarını hazneye bağlayın. Elektrotlar, gümüş telin gece boyunca ağartıcıya batırılmasıyla yapılabilir. Elektrotlar boyunca bir transmembran potansiyeli uygulayın ve bir yama kelepçesi amplifikatörü kullanarak akım tepkisini izleyin.

Voltaj kelepçesi modunda, ölçümlerden bir akım voltajı eğrisi oluşturun. Eğri oldukça doğrusal olmalıdır. Bir molar potasyum klorür kullanıldığında, nanoporun iletkenliği çapına karşılık gelmelidir.

Nanopor doğrusal bir IV eğrisi göstermiyorsa, iletkenlik çok düşüktür veya nanoporun açık akımı kararlı değildir. Bu, nanoporun uygun şekilde evlenmediğini ve piha yıkamanın tekrarlanması gerektiğini gösterir. Sıvının nanoporun içinde olduğundan emin olmak çok önemlidir.

Bu adım düzgün bir şekilde yapılmazsa, nanopordan geçen iyon akımı çok büyük gürültü gösterecek ve proteinlerin nanopora bölünmesi büyük ölçüde azalacaktır. Odanın topraklanmış banyosuna ilgilenilen proteinin saflaştırılmış bir örneğini ekleyerek başlayın. Numunenin tamamen dağılmasını bekleyin.

İncelenen proteinin toplam yükünün zıt polaritesi ile bir transmembran potansiyel voltaj yanlılığı uygulayın. 200 milivoltluk uygulanan bir potansiyel, gözlemlemek için yeterince büyük olmalıdır. Çoğu protein analit olayı, taban çizgisinden geçici akım sapmaları olarak görünecektir.

Herhangi bir sinyal gözlenmezse, odadaki protein konsantrasyonunu arttırın. Daha yüksek voltajlar, sinyal-gürültü oranını ve nitrürü iyileştirir. Nanogözenekler birkaç volta dayanabilir.

Protein emilimleri, Nanopor'un temel akımında uzun süreli değişiklikler olarak görünecektir. Katı hal nanogözenekleri için tipik sonuçlar aşağıdaki gibi olacaktır. Açık gözenek akımı oldukça kararlı olmalıdır.

Nanoporun IV özellikleri oldukça doğrusal olmalıdır. Bir molar potasyum klorürde, 10 molar potasyum fosfat pH 7.4'te, IV eğrisine doğrusal bir uyumun eğimi, nano gözeneğin üniter iletkenliğini sağlayacaktır. İletkenliğin nanopor çapı ile doğrudan bir ilişkisi vardır ve denklemle eşleşmelidir.

Bu değer %30 ile eşleşmelidirDeğer çok küçükse, gözenek muhtemelen protein ilavesiyle birleşmemiştir. Hızlı olaylar meydana gelmelidir, protein emilimi uzun ömürlü bir akım düşüşüdür. Bazı proteinler oldukça kararsızdır ve gözenek iç kısmında yapısal dönüşüme uğrar.

Bu durumda, uzun ömürlü voltaj düşüşüne hızlı dalgalanmalar eşlik edecektir. Bu videoyu izledikten sonra, bir taramalı transmisyon elektron mikroskobu kullanarak katı hal nanogözeneklerinin nasıl üretileceğini ve bu hazır SA protein absorpsiyonunu nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Piranha solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve kimyasal önlük ile davlumbazda çalışmak gibi önlemler alınmalıdır.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.