Name: Kemirgenler için Tüm Hayvan Perfüzyon Fiksasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Keşfedin, sıçan beyni dokusunu immünohistokimya için fizyolojik basınçlar kullanarak düzgün bir şekilde koruyan düşük maliyetli ve hızlı bir perfüzyon fiksasyon tekniği. Bu yöntem, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sinir İletişim Teknolojileri Merkezi (CNCT), Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Ulusal Enstitüsü (NIBIB, P41 EB002030) tarafından finanse edilen ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından desteklenen bir P41 Kaynak Merkezi tarafından finanse edildi.

1. Sabitleme hazırlayın (Tablo Sabitleme ve Tamponlar bakınız.) 2. Perfüzyon Tamponlar hazırlayın (Tablo Sabitleme ve Tamponlar bakınız.) 3. Aparat ve Anestezi hazırlayın <ol><li> 37 su banyosu, sıcak perfüzyon tampon kullanarak ° C Tamponu ile dolu bir bardak koyun çıkış vanası. Tamponu ile 50 ml&#39;lik şırınga doldurun ve sabitleştirici tüp takmak. Kovma ve tampon çekerek tekrar tekrar tüp yıkayın. </li><li> Boru tüm hava kabarcıkları ortadan kadar tamponu ile hat temizleyin. Bu satırların her biri hava kabarcıkları olmaması için perfüzyon başarısı için çok önemlidir. </li><li> Şırınga çıkarın ve% 4 paraformaldehit sabitleştirici (oda sıcaklığında) konteyner bağlayın. Kabı içine yerleştirilmesi sırasında boru tüp ucunda hava kabarcıkları önlemek için, boru sıkıp böylece uç t tampon çıkıntı yapan bir damlakap içinde sıvı yüzeyi ile temas ediniz. </li><li> Çıkış deliği (iğne ucu) kapatın. Sabitleştirici vana (beyaz) ile aynı konuma tampon vana (mavi) çevirin. Bu tampon hat sadece akış sağlayacaktır. </li><li> Çıkış deliği açın ve tampon dolum hattı için A3 A1 ile adımı tekrarlayın. Tüm hava kabarcıkları yakın çıkış kapısı yok edilir sonra, şırınga kaldırmak ve tampon konteyner bağlamak, tüp içine hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. </li><li> Lastik manometre Blub pompalayarak basıncı tutma olanağı için test sistemi. Sistem içinde hava sıkıştırma nedeniyle bazı direnç normal vardır. </li><li> Erişimi kolay için sırayla cerrahi aletler Kur. Hava kabarcıklarının olasılığını ortadan kaldırmak için tamponu ile perfüzyon iğne doldurun. </li><li> Ameliyat öncesinde, bir xylazine / ketamin karışımı (80 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı xylazine) intraperitoneal (27 gauge iğne ve 1 cc şırınga) ile yönetilir. Anestezik ek yönetim anestezi cerrahi bir uçağı korumak için her operasyon sırasında gerektiğinde yapılacaktır. </li></ol> 4. Perfüzyon Cerrahi <ol><li> Hayvan anestezi cerrahi bir düzlem ulaştığında, ezilmiş buz dolu sığ tepsiye yerleştirin. (Anestezi derinliği belirlemek için tutam-yanıt yöntemi parmak kullanın. Hayvan devam etmeden önce tepkisiz olmalıdır). </li><li> Sadece göğüs kafesinin altındaki kabuk ve karın duvarı üzerinden 5-6 cm lateral insizyon olun. Diyaframdan karaciğer dikkatle ayırın. </li><li> Eğri, künt makas kullanırken diyafram küçük bir kesi olun. Parmağınızın konumu ve basınç diyaframın kesmek için yeteneği yardımcı olabilir. </li><li> Plevra boşluğu göstermek için göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyafram kesi devam edin. </li><li> Dikkatli akciğerler yerinden, kaburga kemiklerinden birinin kenarı boyunca eğri, künt makas koyun ve bir cu yapmakkadar köprücük kemiği ile göğüs kafesini t. Karşı tarafta benzer bir kesim olun. </li><li> Uzaklıkta sternum Kaldırma, kalp bağlayarak herhangi bir doku dikkatlice düzeltin. Hemostat ile sternum ucu Kelepçe ve başının üzerine hemostat yerleştirin. Düzgün yapılmazsa zaman, timus büyük damarların net bir görünüm sağlayan, sternum ile birlikte kalp uzak kaldırır. </li><li> Iris makası kullanarak sol ventrikül posterior sonuna küçük bir kesi yapmak. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <ol start="8"><li> Aorta içine kesme ventrikül yoluyla 15-gauge künt veya zeytin uçlu perfüzyon iğne geçirin. Ucu aort duvarı ile görünür olmalı ve brakial ve karotis arterler farklılaşmaya arkus ulaşması gerekir. </li><li> Kalp bağlamak için bir hemostat kullanın, bu iğne tutan ve dışarıya sızmasını önler. Eğer istenirse, modifiye hemostat (bu hemostat Diseksiyon başlayana kadar yerinde kalması, fakat berraklığı için gelecek resimlerden atlanmıştır) iğne ucu etrafında aorta sıkıştırılması için kullanılabilir. </li><li> Son olarak, inen aorta zarar vermeden mümkün olduğunca büyük bir çıkış oluşturmak için iris makası kullanarak hayvanın sağ atriuma bir kesi yapmak. Bu noktada, hayvan perfüze üzere hazırdır. </li></ol> 5.. Perfüzyon <ol><li> Açın ve herhangi bir hava kabarcığı tanıtmak için özen iğne tabanına çıkış noktası ekleyin. </li><li> Hızlı ve eşit olarak 80 mm Hg basınç manometresi ampul kesecektir. Tampon infüzyon süresince bu basıncı koruyun. Zamanlayıcı başlatın. </li><li> İğne açısını ayarlayın. Iğnenin açısı maksimum debisi (açı ayarlı akış değişim dikkat edin) ulaşılmasında kritik önem taşımaktadır. </li><li> Buff geçişer vana (mavi) tampon neredeyse tamamlandıktan sonra (200 ml). Sıvı berraktı çalıştırıyor olmalıdır. Karaciğerin temizlenmesi iyi bir perfüzyon bir göstergesidir. Karaciğer bu noktada açık olmalıdır. Kayıtlarınız için zamanını gösterir. </li><li> Fiksasyon titreme saniye içinde dikkat edilmelidir, bu tespitin doğru zamanı düşünülmelidir. Kayıtlarınız için zamanını gösterir. </li><li> Basıncı yavaş yavaş sabit bir akış hızı korumak için 130 mm Hg maksimum 2 kadar artış olabilir. </li><li> Sabitleştirici neredeyse tamamlandıktan sonra çıkış vanasını kapatın. Kayıtlarınız için zaman bitiş belirtiniz. </li><li> Rat bu aşamada sert olmalıdır. </li><li> Kullanılan paraformaldehit kurumunuzun mevzuata uygun olarak atmak için toplanan ve saklanan gerekir. </li></ol> 6. Diseksiyon 4,11 <ol><li> Bir makas kullanarak kafasını çıkarın. </li><li> Boyun burun kabuklarıyla birlikte orta hat kesi yapmak ve maruzkafatası. </li><li> Kafatası tabanında maruz böylece kalan boyun kası kesip atın; makas veya rongeurs kullanarak herhangi bir kalıntı kas kaldırın. </li><li> Dikkatli kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kayar, bir tarafta foramen magnum içine iris bir makas keskin ucunu yerleştirin. </li><li> Daha sonra, bir kesik posterior kafatası yüzeyinin distal kenarından uzanan edin. Karşı tarafta aynı bir kesim olun. Beyincik çevresindeki kafatası temizlemek için rongeurs kullanın. </li><li> Ucu beyin hasarı önlemek için kesme gibi bıçak üzerinde yukarı kaldırarak, dorsal distal arka köşesine gelen kafatası distal ön kenarına gider gibi dikkatlice kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kaydırın. Karşı taraf için tekrarlayın. </li><li> Beyinden uzak kafatası dorsal soyma rongeurs kullanma. Rongeurs yanı kullanarak kafatasının iki uzak kesin. </li><li> Spatula kullanarak, koku ampuller ve sinir bağlantılarının severBeynin ventral yüzeyi birlikte birtakım. </li><li> Yavaşça hala iris makası kullanarak kafatası beyin bağlanan herhangi bir dura kırparak, uzak başından beyin kızdırmak. </li><li> Beyin çıkarın ve fiksatif içeren sıvı, beyin kendisi hacmi en az 10x bir şişe yerleştirin. Flakon bazen girdap. </li></ol> 7. Post-fiksasyon ve Depolama <ol><li> Ara sıra girdapladıktan, 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca sabitleştirici beyin tutmak. </li><li> 24 saat sonra, fosfat ile beyin yıkama medya 3 kez alış verişi ve her seferinde dönen tarafından tamponlu tuz. </li><li> Beyinleri sonra fosfat saklanabilir sodyum azid ile tamponlanmış tuzlu su ya da HBHS ve 4 ° C de muhafaza </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Perfüzyon Başarının ilk göstergesi gibi burun gibi uzuvlar, kulaklar ve pençeleri ve bu timus bezi ve karaciğer (İHK Dünya) gibi iç organların temizlenmesi olduğunu.Beyin Brüt muayene kan (soluk sarı bir görünüm için beyaz) kan damarı void ortaya koymaktadır. Bu ve immunohistokimyasal boyama için kaderinde doku bölümleri içinde de geçerli olacak. Perfüzyon sonucu nihai göstergesi dokusunda ince bir durumdur. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Sabitleme hazırlayın: </td></tr><tr><td> % 8 Paraformaldehyde stok hazırlayın </td></tr><tr><td><ol><li> 500 ml dH 2 O 40 gr Paraformaldehyde ekle 60 çözüm ısıtın - 65 ° C (65 aşmayın ° C, böylece olumsuz immünohistokimyasal prosedürün başarısını etkileyebilir) karıştırarak. </li><li> Çözüm temizlemek için, ısı azaltmak ve bir damlalık ile 1.0 M NaOH 2-3 ml ekleyin. </li><li> Filtre ve 1 aya kadar 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.4 hazırlamak </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Sodyum fosfat monobazik hisse senedi için, 1 L dH 2 O için 27.8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O ekleyin </li><li> Sodyum fosfat dibazik hisse senedi için, 1 L dH 2 O için 28.4 g Na 2 HPO 4 ekleyin </li><li> Dibazik stokunun 190 ml monobazik stokunun 810 ml ekleyin. </li></ol></td></tr><tr><td> % 4 Paraformaldehyde Sabitleme hazırlayın </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> 0,2 M Sodyum Fosfat Tamponu eşit parça% 8 paraformaldehit stok ekle </li><li> Not: Bu düzeltme en fazla daha 72 saat önceden, taze hazırlanır. </li></ol></td></tr><tr><td> Perfüzyon ve Depolama Tamponlar hazırlayın: </td></tr><tr><td> Fosfat hazırlamak Salin, pH 7.4 Tamponlu </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;alt&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> PH kontrol </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES Sodyum Azide pH 7.4 ile Hanks Çözüm (HBHS) Tamponlanmış </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml dH 2 O </li><li> 7.5 g NaCl, </li><li> 0.3 g KCl </li><li> 0.06 g KH 2 PO 4 </li><li> 0.13 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Dekstroz / Glukoz </li><li> 2.4 g 10 mM HEPES </li><li> 0.1 g MgCl2 6 parça dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 parça dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl2 2 parça dH 2 O </li><li> 90 mg NaH3 </li><li> PH kontrol </li></ol></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Sabitleme ve Tamponlar hazırlanması. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Şekil 1.. </strong&gt; etiketli bileşenleri ile Perfüzyon Aparatı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Şekil 2. Perfüzyon Aparatı I. hazırlanması sabitleştirici hattı ile başlayın. Hava kabarcıklarının boru yıkayın ve hızla kovma ve enjektöre ve hat üzerinden tampon çekerek tamponu ile doldurun. Iğnenin ucunda vanasını kapatın. Hava kabarcıkları tanıtımı olmadan sabitleştirici şişeye sabitleştirici yerleştirelim. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Şekil 3. Perfüzyon Apparatus II hazırlanması. 1. Iğnenin ucunda valfini açın. 2. Akışı için konumlandırmak için tampon vana (mavi) çevirin. 3. Hava kabarcıklarının boru yıkayın ve hızla kovma ve şırınga ile tampon çekerek tamponu ile doldurun. 4. Iğnenin ucunda vanayı kapatın. Tampon şişeye tüp yerleştirin. Sistem, doğru kapatılmış olduğundan emin olmak için test basıncımanometre ampul kadar pompalama ve mastar izleyerek ly. Aparat perfüzyon prosedürü için hazırdır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Şekil 4. Tampon teslim pozisyonda Perfüzyon Aparatı. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Şekil 5. Perfüzyon Cerrahi I. a) kabuklarıyla ve karın duvarı üzerinden bir lateral insizyon olun. b) diyafram bir kesi yapın ve kalp açığa diyafram olandı. Kadar köprücük kemiği ile kaburgalar iki tarafında paralel kesimler olun. c) hemostat ile sternum ucu kelepçe ve başının üzerine hemostat yerleştirin. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Şekil 6. Perfüzyon Cerrahisi II. a) aorta içine kesme ventrikül yoluyla perfüzyon iğne geçirin. b) sabitleyinKalp bağlamak için hemostat perfüzyon iğne kullanımı bir takım. Değiştirilmiş bir hemostat bir ikinci küme de sızıntı önler için iğne ucu etrafında aorta sıkıştırılması için kullanılabilir. Iris makası kullanarak sol ventrikül posterior sonuna küçük bir kesi yapmak. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Şekil 7. Tampon Pompa hattında basınç oluşturmak için manometre ampul ile Perfüzyon. Valfi (1) açın ve iğne göbek iliştirin. Bu hava kabarcıkları tanıtıldı emin olmak önemlidir. 80 mm Hg basınç manometresi ampul pompalamak ve tampon infüzyon süresi boyunca bu baskıyı sürdürmek. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Şekil 8. Tamponu ile bir kez Sabitleme perfüzyon neredeyse (200 ml) akmasına izin vermek için sabitleştirici tampon valfi (1) geçiş bitirilir. Basıncı yavaş yavaş kadar artırılabilir130 mm Hg maksimum. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Şekil 9. Diseksiyon I. a) makas bir çift kullanarak kafasını çıkarın. b) boyun burun orta hat boyunca deride bir kesi yapmak ve kafatası maruz bırakmaktadır. kafatası tabanında maruz böylece c) Kalan boyun kası keserek. Kafatası yüzeyinde geniş açıklığı (foramen magnum) erişilebilir şekilde kafa tutun. Dikkatle foramen magnum içine iris bir makas keskin ucunu ve bir kesim yapmak. Karşı taraf için aynı manevra tekrarlayın. Beyincik çevresindeki kafatası temizlemek için rongeurs kullanın. <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> 10 Şekil. Diseksiyon II. a) dikkatle kafatasının iç yüzeyi boyunca makas kaydırın. Eğer beyin hasarı önlemek için kesim gibi ucu yukarı kaldırın. Aynı için tekrarlayınkarşı tarafta. Beyinden uzak kafatası soyma rongeurs kullanın. b) kafatası ile resimde kaldırıldı ve beyin maruz. c) beyninin en ön yerde koku ampuller ve sinir bağlantılarını koparmak için bir spatula kullanın. Dikkatle kaldır kolaylığı için bağlantıları koparmak için beynin alt tarafı boyunca spatula ucu rehberlik. Beyin çıkarın ve sabitleştirici bir şişe yerleştirin.

<ol><li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li>
<li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li>
<li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li>
<li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li>
<li>Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li>
<li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li>
<li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+WF+%22Vertebrate+dissection%22">Vertebrate dissection</a>. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).</li>
<li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Monitoring+in+the+Rat%3A+Comparison+of+Monitoring+in+the+Ventricle%2C+Brain+Parenchyma%2C+and+Cisterna+Magna%22%5BJournal%5D)">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı bir ameliyat için ek notlar: <ol><li> Diyafram ihlal edildiğinde, hipoksi ve hiperkapni sonraki analiz yanıltabilecek geri dönüşümsüz fizyolojik değişiklikler başlatacaktır hızla koyun. </li><li> İğne eklenmiş ve yerinde kelepçelenir zaman, kalan basınç iğne (flashback) tabanına kan iter. Gerçekte, daha büyük hayvanlar kuvvetli bir şekilde dışarı atılması kan olabilir. Kan, en az perfüzyon tamamlamak için bir engel teşkil edecektir hava kabarcıkları tanıtma önlemek için iğne tabanına ulaşmak önemlidir. Kan iğne üssünde görülürse, perfüzyon teçhizat çıkış portuna takarak tamponu ile iğne ve dolum çıkarın. Tampon ucu aracılığıyla çalıştırmak sonra, iğnenin kalbin içine yerleştirilemeyen olabilir. </li><li> Aort içindeki iğnenin doğru yerleştirilmesi önemlidir, o kadar arkus olarak ulaşması gerekir. </li><li> Birden perfüzyonsintigrafisiyle yer alıyorsanız bu t gerekli değildirBaşlangıçta her zaman o ayar. Kullanıcı her bir şişe (200ml artış hayvan / solüsyonu) tampon ve sabitleştirici her ikisi için uygun hacimde olması gerekir. Gerektiğinde ayrıca şişe doldurulmuş olabilir. Dikkate almak en önemli yönü hayvana kurulum (çıkış vanası) uzanan perfüzyon hattı dışarı kızarma edilir. Bir perfüzyon tamamlanmasından sonra, bu hattı içinde% 4 paraformaldehit sahip olacaktır. Tampon şişeden tüp çıkarın ve sabitleştirici temizlemek için su dolu bir 50 ml şırınga kullanın. Çıkış vanası paraformaldehit uygun şekilde bertaraf edilmesi için bir atık toplama kabı yerleştirilir emin olun. Bu üç kez tekrarlayın. 2,3 gösterilen aynı yöntem kullanılarak tamponu ile dolum. </li><li> Fiksasyon için bu yöntemi deneyin ihtiyaçlarına göre tampon ve sabitleştirici diğer fiksatif (örneğin, EM için kullanılanlar gibi) hem de değiştirme yeteneği ile son derece uyumludur. </li><li> Sistem aynı zamanda sık canlı dokuda çıkarılması için kullanılır. Bununsüreci bir sadece tampon teslim kullanır sadece (yine tüm sisteme takılıyken tampon şişe bir buz kovası yerleştirildi ve sabitleştirici şişe boş ama mühürlü olarak kurgusunda edilir). Bu, uygun basınçta soğuk bir tampon perfüzyon temin eder. Buradan sistemi ya (miktarı bir sorun değilse) tampon doğrudan boya ekleyerek veya tampon / tampon arasında boya çözümün minimal miktarda bir şırınga kullanın tarafından tamir edilebilir boyaların infüzyon adapte edilebilir - sabitleştirici adım. </li><li> Vasküler döküm durumda, basınç kontrol tampon aşama a 50ml şırınga ya (tüp, kapak ve tutma cihazı doğrudan ya da bir teslimat atılabilir ikincil bağlanma için kullanılması gerekir ki viskozite ve döküm çözeltisi doğası katılaştırıcı nedeniyle çok önemlidir Mevcut sistem arayüzü için yapılan konteyner) kullanılmalıdır. Laboratuvarlarımız &#39;vasküler döküm perfüzyon cihazları tasarım ve üretim öncesinde. Bu nedenle biz st olamazbasıncı ölçümleri teslim yerinde doğru bir ölçüm olacağını yedik. Numaraları viskoz akışkanların başarılı teslim elde ayarlanması gerekiyor olabilir. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestezik: </td></tr><tr><td> Ketamin / xylazine karışımı (Anestezik laboratuar / kuruma göre değişebilir) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 ml Flakon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Cerrahi: </td></tr><tr><td> İğne ucu, 27 GA x 1.25 &quot; </td><td> Malzeme Hizmetleri </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Büyük Künt / künt eğimli makaslar (~ 14,5 cm) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Düz iris makası </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standart cımbız </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Ince (Graefe) cımbız </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 büyük hemostat forseps - eğri veya düz (~ 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 standart hemostat forseps - düz dişli (14 cm) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 modifiye hemostat (ucu ile açılan 15 gauge delikli) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-gauge künt veya zeytin uçlu iğne (perfüzyon iğne) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfüzyon: </td></tr><tr><td> HyPerfusion sistemi veya eşdeğeri &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat salin, pH 7.4 tampon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1 M Fosfat Tamponu, pH 7.4 &#39;de% 4 Paraformaldehyde </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sığ cam veya plastik tepsi, yaklaşık 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kırılmış buz </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml şırınga </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Diseksiyon: </td></tr><tr><td> PaStandart keskin / künt düz makas ir (~ 12 cm) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Orta kavisli veya düz rongeurs (14-16 cm) veya kafatası kemik kaldırma pense </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Düz iris makası (~ 9 cm) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro-spatula (çift 2 &quot;düz uçlu bir yuvarlak, sivri biri 1/8&quot;) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Post-Fiksasyon ve Depolama: </td></tr><tr><td> 50 ml bir cam şişeye </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum azid ile 40 ml HEPES-Tamponlu Hanks Çözüm (HBHS) (90mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

kemirgenler için tüm hayvan perfüzyon fiksasyon

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

Fiksasyon amacı hızlı ve düzgün bir hayat gibi devlet doku korumaktır. Sabitleştirici aynı oranda az 5,7 dokusunun tüm bölgelerde ulaşma değil küçük doku parçaları, bozulmamış beyin immersiyon fiksasyon için bir sorun teşkil gibi büyük örnekler için iyi fiksatif eserlerinde doğrudan doku yerleştirerek iken. Doku 12 korunabilir önce sık sık, hipoksiye cevap olarak değişiklikler başlar. Doğrudan dolaşım sistemine sabitleştirici perfüze avantajı kimyasal hızla doğal vasküler ağını kullanarak organizmanın her köşesine ulaşabilir olmasıdır. En etkin dolaşım sistemi kullanmak için, bakım fizyolojik baskılar 3 maç alınmalıdır. Bu fizyolojik baskılar kullanılan türlere bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Perfüzyon fiksasyon teknikleri tespit edilecek doku bağlı olarak değişir ve nasıl doku fiksasyonu sonrasında işleme alınacaktır. Bu videodaSıçan kalbine immünhistokimya için beynin mümkün olan en iyi koruma elde etmek için: biz vasküler sistem aracılığı ile perfüze% 4 paraformaldehit kullanarak düşük maliyetli, hızlı, kontrollü ve düzgün fiksasyon prosedürü açıklar. Bu tekniğin ana avantajı (vs yerçekimi beslemeli sistemler) dolaşım sistemi en etkin şekilde kullanılmaktadır olmasıdır.

Sıçan kalp ile beyin mümkün olan en iyi koruma elde etmek için: Burada damar sistemi ile perfüze% 4 paraformaldehit kullanarak düşük maliyetli, hızlı, kontrollü ve düzgün fiksasyon prosedürü açıklar.

Kemirgenler için Tüm Hayvan Perfüzyon Fiksasyon

Fiksasyonun amacı, dokuyu canlıya yakın bir durumda hızlı ve homojen bir şekilde korumaktır. Dokunun doğrudan fiksatif içerisine yerleştirilmesi küçük ... için iyi sonuç verse de...

Bu prosedürün genel amacı, immünohistokimya işlemleri için sıçan beyin dokusunun uygun şekilde korunmasını sağlamak amacıyla fizyolojik basınçların kullanımına odaklanan perfüzyon fiksasyon tekniğimizi göstermektir. İlk olarak, perfüzyon aparatının kullanımı ve kurulumu gösterilmektedir. Ardından, hem perfüzyon cerrahisini hem de beyin çıkarma işlemini gerçekleştirmek için gereken araçlar hazırlanır ve derin anestezi altındaki hayvan, kırılmış buzla doldurulmuş sığ tepsiye yerleştirilir.Kaburga kafesinin hemen altına, deri ve karın duvarı boyunca beş ila altı santimetrelik lateral bir insizyon yapılır. Kalp açığa çıkarılır ve hayvan perfüze edilir. Son adım, beynin çıkarılması ve beynin kendi hacminin en az 10 katı kadar sıvı içeren bir fiksatif şişesine yerleştirilmesidir.Bu prosedürün genel amacı, immünohistokimya için sıçan beyin dokusunu uygun şekilde korumak amacıyla fizyolojik basınçların kullanımını vurgulayan perfüzyon fiksasyon tekniğimizi göstermektir. İlk olarak perfüzyon düzeneğini hazırlayarak başlayacağız. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürecektir. 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak, tüm hava kabarcıkları giderilene kadar fiksatif hattını tampon çözelti ile defalarca yıkayın ve temizleyin.Bir perfüzyonun başarısı için hatların hiçbirinde hava kabarcığı bulunmaması kritik önem taşır. Bu, çıkış valfinin tampon çözelti ile dolu bir behere yerleştirilmesiyle sağlanır. Şimdi, çıkış valfini kapatın.Ardından, tüpün ucundan bir damla tampon sarkacak şekilde sıkarak tüpü şırıngadan çıkarın. Dolu tüpü, fiksatif giriş kısmı hayvan başına 200 milliliters paraldehit fiksatif içeren bir şişeye yerleştirin. Bu işlemi yaparken hava kabarcığı girmemesine dikkat edin.Sızdırmazlığın düzgünce oturduğundan emin olarak kapağı sıkın. Eğer düzgünce oturmamışsa, kapalı sistem içindeki basınç korunmayacaktır. Şişeyi perfüzyon düzeneğine yerleştirin.Çıkış portunu kapatıp tampon valfini fiksatif valfiyle aynı konuma getirerek akışı yalnızca tampon hattından sağlayın. Çıkış portunu açın ve fiksatif hattı için daha önce yapıldığı gibi tampon hattını temizleyin. Hat temizlendikten sonra tüpü tampon şişesine yerleştirin.Ardından, sistemin basıncı tutma kapasitesini test edin. Kauçuk manometre pompasının sıkılmasıyla bir direnç oluşacaktır. Son bir hazırlık olarak.Havanın girmesini önlemek için perfüzyon iğnesini tampon çözelti ile doldurun. Sistem artık perfüzyon için hazırdır. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle cerrahi anestezi düzlemi kontrol edilerek ketamin ksilazin karışımı uygulandıktan sonra, tamamen anestezi altındaki sıçanı kırılmış buzla doldurulmuş sığ bir tepsiye yerleştirin.Hayvan tamamen anestezi altına alınmadan işleme devam etmeyin. Cerrahi işleme, göğüs kafesinin hemen altındaki deri ve karın duvarı boyunca beş ila altı santimetrelik lateral bir insizyon yaparak başlayın. Karaciğeri diyaframdan dikkatlice ayırın.Kavisli küt uçlu makas kullanarak diyaframda küçük bir insizyon yapın. Parmağınızın konumu ve uyguladığınız basınç, diyaframı kesme işlemini kolaylaştırabilir. Plevral boşluğu açığa çıkarmak için diyafram insizyonunu tüm göğüs kafesi uzunluğu boyunca sürdürün.Kavisli küt uçlu makası kaburgaların bir kenarı boyunca yerleştirin, akciğerleri dikkatlice kenara çekin ve göğüs kafesi boyunca köprücük kemiğine kadar bir kesi yapın. Ardından karşı tarafta da benzer bir kesi yapın. Şimdi sternumu yukarı kaldırın ve kalbe bağlanan tüm dokuları dikkatlice temizleyin.Sternumun ucunu hemostatla kenetleyin ve hemostatı başın üzerine yerleştirin. Thorax, ana damarların net bir şekilde görülmesini sağlayacak şekilde yukarı kalkacaktır. İris makası kullanarak sol ventrikülün posterior ucuna küçük bir insizyon yapın.15 gauge küt uçlu veya zeytin uçlu bir perfüzyon iğnesini, kesilen ventrikülden geçirerek asendan aortaya yerleştirin. İğne ucu aort duvarından görünür olmalı ve brakiyal ile karotis arterlerin ayrıldığı aort kemerine ulaşmamalıdır. İğneyi sabitlemek ve sızıntıyı önlemek için kalbi bir hemostat ile klempe edin.Son olarak, sağ atriumda geniş bir çıkış noktası oluşturmak için iris makasını kullanın. İnen aortaya zarar vermemeye dikkat edin. Bu noktada hayvan perfüzyona hazır hale gelmiştir.Hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek sağ atriumdaki perfüzyon iğnesini çıkış portuna bağlayın ve çıkış portunu açın. Ardından, manometre ampulini hızlı ve eşit bir şekilde 80 mmHg basınca kadar şişirin. Tampon infüzyon süresi boyunca bu basıncı koruyun.Şimdi bir zamanlayıcıyı başlatın. Akışın en güçlü olduğu noktaya göre iğne açısını ayarlayın ve tampon çözelti bitmeye yakın olduğunda tampon valfini değiştirin. Karaciğer perfüze edildiğinde sıvı berrak akmaya başlayacaktır.Bu durum, iyi bir perfüzyonun göstergesidir ve karaciğerin temizlenme zamanı çok hızlı bir şekilde kaydedilmelidir. Bu olaydan sonra fiksasyon tremorları gözlemlenecektir. Bunu gerçek fiksasyon zamanı olarak belirtin. Sabit bir akış hızını korumak için basınç, kademeli olarak maksimum 130 millimeters of mercury değerine kadar artırılabilir.Fiksatif neredeyse bittiğinde, çıkış valfini kapatın ve saati not edin. Sıçanın şu an sertleşmiş olması gerekir. Sıçanın organları artık hasat edilebilir. Beyni çıkarmak için, sabitlenmiş sıçanın diseksiyonuna başı bir giyotin kullanarak ayırarak başlayın.Ardından, boyundan buruna kadar deri boyunca bir orta hat insizyonu yapın ve kafatasını makasla açığa çıkarın. Kafatasının tabanının açığa çıkması için geri kalan boyun kaslarını kesin. Bir iris makasının sivri ucunu bir taraftaki foramen magnum'a yerleştirin ve makası kafatasının iç yüzeyi boyunca dikkatlice kaydırın.Ardından, posterior kafatası yüzeyinin distal kenarına kadar uzanan bir kesi yapın. Kontralateral tarafta da aynı kesiyi gerçekleştirin. Daha sonra, serebellum çevresindeki kafatasını temizlemek için theros kullanın.Makasın ucunu, kafatasının iç yüzeyi boyunca dorsal distal posterior köşeden distal frontal çıkıntıya doğru dikkatlice kaydırın. Bıçağın ucunu yukarı kaldırarak beyne zarar vermekten kaçının. Bu işlem sırasında, aynı kesme işlemini karşı tarafta da tekrarlayın.Ardından pensler kullanarak, kafatasının dorsal yüzeyini beyinden ayırın. Yine pensler kullanarak kafatasının yan kısımlarını kesin. Şimdi bir spatula yardımıyla, beynin ventral yüzeyi boyunca olfaktör bulbları ve sinirsel bağlantıları kesin ve beyni nazikçe kafadan ayırın.İris makası kullanarak, beyni kafatasına bağlayan tüm dura kısımlarını kesin. Beyin çıkarıldıktan sonra, beynin kendi hacminin en az 10 katı hacme sahip bir fissatif şişesine yerleştirin. Şişeyi 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın.24 saat sonra, beyni hafifçe çalkalayarak 3 kez PBS ile yıkayın. Beyin daha sonra PBS veya Hanks dengeli tuz çözeltisinde saklanabilir. Sodyum azid ile dört °C'de, beyinler üç ay boyunca saklanabilir.Kesitlenmemiş. Uzmanlaşıldığında, tüm perfüzyon beş ila sekiz dakika arasında tamamlanabilirdi.

whole-animal-perfusion-fixation-for-rodents

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, karaciğer hücrelerini izole etmeden önce kollajenaz çözeltisi kullanılarak portal ven yoluyla fare karaciğeri perfüzyonu için bir prosedür açıklanmaktadır.

İn Vivo Murin Karaciğer Perfüzyonu: Kemirgen Karaciğerini Portal Ven Yoluyla Çözelti ile İnfüzyon Etmek İçin Bir Yöntem

Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Burada bir fare beyin damar geçirgenliği tahlil mayi enjeksiyon kan - beyin bariyerini disfonksiyon hayvan modelleri için geçerlidir perfüzyon ardından floresan tarayıcıları kullanarak mevcut. Bir hemi-beyin geçirgenliği kantitatif değerlendirilmesi ve diğer izleme görselleştirme/immunostaining için kullanılır. Yordamı 5-6 h 10 fareler için alır.

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.

Lezyonlar karakterize ve küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulmak için bir mikro-CT-esaslı Yöntem

Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.

Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması

Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.

Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Fare merkezi sinir sisteminin histolojik analizi için uygun bir yerçekimi beslemeli perfüzyon yöntemi sunulmaktadır. Fosforile α-sinükleinin immünofloresan tespiti, Parkinson hastalığının bir fare modelinde gösterilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda transkardiyal perfüzyon, diseksiyon, doku dondurma/gömme ve dondurulmuş kesit adımlarını kapsamlı bir şekilde tanımlamaktadır.

Fare Merkezi Sinir Sisteminin Histolojik Analizi için Yerçekimi Beslemeli Transkardiyal Perfüzyon Yöntemi

Dendritik dikenler, çoğu uyarıcı sinapsın post-sinaptik bölmeleridir. Dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikler, nörogelişim, yaşlanma, öğrenme ve birçok nörolojik ve psikiyatrik bozukluk sırasında meydana gelir ve güvenilir dendritik omurga analizinin önemini vurgular. Bu protokol, otomatik üç boyutlu nöron rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak dendritik omurga morfolojisinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini açıklar.

Otomatik Üç Boyutlu Nöron Rekonstrüksiyon Yazılımı Kullanılarak Dendritik Omurga Ölçümü

Keşfedin, sıçan beyni dokusunu immünohistokimya için fizyolojik basınçlar kullanarak düzgün bir şekilde koruyan düşük maliyetli ve hızlı bir perfüzyon fiksasyon tekniği. Bu yöntem, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Kemirgenler için Tüm Hayvan Perfüzyon Fiksasyon

Daha fazla video keşfet