Kemirgenler için Tüm Hayvan Perfüzyon Fiksasyon

Bu prosedürün genel amacı, immünohistokimya işlemleri için sıçan beyin dokusunun uygun şekilde korunmasını sağlamak amacıyla fizyolojik basınçların kullanımına odaklanan perfüzyon fiksasyon tekniğimizi göstermektir. İlk olarak, perfüzyon aparatının kullanımı ve kurulumu gösterilmektedir. Ardından, hem perfüzyon cerrahisini hem de beyin çıkarma işlemini gerçekleştirmek için gereken araçlar hazırlanır ve derin anestezi altındaki hayvan, kırılmış buzla doldurulmuş sığ tepsiye yerleştirilir.

Kaburga kafesinin hemen altına, deri ve karın duvarı boyunca beş ila altı santimetrelik lateral bir insizyon yapılır. Kalp açığa çıkarılır ve hayvan perfüze edilir. Son adım, beynin çıkarılması ve beynin kendi hacminin en az 10 katı kadar sıvı içeren bir fiksatif şişesine yerleştirilmesidir.

Bu prosedürün genel amacı, immünohistokimya için sıçan beyin dokusunu uygun şekilde korumak amacıyla fizyolojik basınçların kullanımını vurgulayan perfüzyon fiksasyon tekniğimizi göstermektir. İlk olarak perfüzyon düzeneğini hazırlayarak başlayacağız. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürecektir. 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak, tüm hava kabarcıkları giderilene kadar fiksatif hattını tampon çözelti ile defalarca yıkayın ve temizleyin.

Bir perfüzyonun başarısı için hatların hiçbirinde hava kabarcığı bulunmaması kritik önem taşır. Bu, çıkış valfinin tampon çözelti ile dolu bir behere yerleştirilmesiyle sağlanır. Şimdi, çıkış valfini kapatın.

Ardından, tüpün ucundan bir damla tampon sarkacak şekilde sıkarak tüpü şırıngadan çıkarın. Dolu tüpü, fiksatif giriş kısmı hayvan başına 200 milliliters paraldehit fiksatif içeren bir şişeye yerleştirin. Bu işlemi yaparken hava kabarcığı girmemesine dikkat edin.

Sızdırmazlığın düzgünce oturduğundan emin olarak kapağı sıkın. Eğer düzgünce oturmamışsa, kapalı sistem içindeki basınç korunmayacaktır. Şişeyi perfüzyon düzeneğine yerleştirin.

Çıkış portunu kapatıp tampon valfini fiksatif valfiyle aynı konuma getirerek akışı yalnızca tampon hattından sağlayın. Çıkış portunu açın ve fiksatif hattı için daha önce yapıldığı gibi tampon hattını temizleyin. Hat temizlendikten sonra tüpü tampon şişesine yerleştirin.

Ardından, sistemin basıncı tutma kapasitesini test edin. Kauçuk manometre pompasının sıkılmasıyla bir direnç oluşacaktır. Son bir hazırlık olarak.

Havanın girmesini önlemek için perfüzyon iğnesini tampon çözelti ile doldurun. Sistem artık perfüzyon için hazırdır. Ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle cerrahi anestezi düzlemi kontrol edilerek ketamin ksilazin karışımı uygulandıktan sonra, tamamen anestezi altındaki sıçanı kırılmış buzla doldurulmuş sığ bir tepsiye yerleştirin.

Hayvan tamamen anestezi altına alınmadan işleme devam etmeyin. Cerrahi işleme, göğüs kafesinin hemen altındaki deri ve karın duvarı boyunca beş ila altı santimetrelik lateral bir insizyon yaparak başlayın. Karaciğeri diyaframdan dikkatlice ayırın.

Kavisli küt uçlu makas kullanarak diyaframda küçük bir insizyon yapın. Parmağınızın konumu ve uyguladığınız basınç, diyaframı kesme işlemini kolaylaştırabilir. Plevral boşluğu açığa çıkarmak için diyafram insizyonunu tüm göğüs kafesi uzunluğu boyunca sürdürün.

Kavisli küt uçlu makası kaburgaların bir kenarı boyunca yerleştirin, akciğerleri dikkatlice kenara çekin ve göğüs kafesi boyunca köprücük kemiğine kadar bir kesi yapın. Ardından karşı tarafta da benzer bir kesi yapın. Şimdi sternumu yukarı kaldırın ve kalbe bağlanan tüm dokuları dikkatlice temizleyin.

Sternumun ucunu hemostatla kenetleyin ve hemostatı başın üzerine yerleştirin. Thorax, ana damarların net bir şekilde görülmesini sağlayacak şekilde yukarı kalkacaktır. İris makası kullanarak sol ventrikülün posterior ucuna küçük bir insizyon yapın.

15 gauge küt uçlu veya zeytin uçlu bir perfüzyon iğnesini, kesilen ventrikülden geçirerek asendan aortaya yerleştirin. İğne ucu aort duvarından görünür olmalı ve brakiyal ile karotis arterlerin ayrıldığı aort kemerine ulaşmamalıdır. İğneyi sabitlemek ve sızıntıyı önlemek için kalbi bir hemostat ile klempe edin.

Son olarak, sağ atriumda geniş bir çıkış noktası oluşturmak için iris makasını kullanın. İnen aortaya zarar vermemeye dikkat edin. Bu noktada hayvan perfüzyona hazır hale gelmiştir.

Hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek sağ atriumdaki perfüzyon iğnesini çıkış portuna bağlayın ve çıkış portunu açın. Ardından, manometre ampulini hızlı ve eşit bir şekilde 80 mmHg basınca kadar şişirin. Tampon infüzyon süresi boyunca bu basıncı koruyun.

Şimdi bir zamanlayıcıyı başlatın. Akışın en güçlü olduğu noktaya göre iğne açısını ayarlayın ve tampon çözelti bitmeye yakın olduğunda tampon valfini değiştirin. Karaciğer perfüze edildiğinde sıvı berrak akmaya başlayacaktır.

Bu durum, iyi bir perfüzyonun göstergesidir ve karaciğerin temizlenme zamanı çok hızlı bir şekilde kaydedilmelidir. Bu olaydan sonra fiksasyon tremorları gözlemlenecektir. Bunu gerçek fiksasyon zamanı olarak belirtin. Sabit bir akış hızını korumak için basınç, kademeli olarak maksimum 130 millimeters of mercury değerine kadar artırılabilir.

Fiksatif neredeyse bittiğinde, çıkış valfini kapatın ve saati not edin. Sıçanın şu an sertleşmiş olması gerekir. Sıçanın organları artık hasat edilebilir. Beyni çıkarmak için, sabitlenmiş sıçanın diseksiyonuna başı bir giyotin kullanarak ayırarak başlayın.

Ardından, boyundan buruna kadar deri boyunca bir orta hat insizyonu yapın ve kafatasını makasla açığa çıkarın. Kafatasının tabanının açığa çıkması için geri kalan boyun kaslarını kesin. Bir iris makasının sivri ucunu bir taraftaki foramen magnum'a yerleştirin ve makası kafatasının iç yüzeyi boyunca dikkatlice kaydırın.

Ardından, posterior kafatası yüzeyinin distal kenarına kadar uzanan bir kesi yapın. Kontralateral tarafta da aynı kesiyi gerçekleştirin. Daha sonra, serebellum çevresindeki kafatasını temizlemek için theros kullanın.

Makasın ucunu, kafatasının iç yüzeyi boyunca dorsal distal posterior köşeden distal frontal çıkıntıya doğru dikkatlice kaydırın. Bıçağın ucunu yukarı kaldırarak beyne zarar vermekten kaçının. Bu işlem sırasında, aynı kesme işlemini karşı tarafta da tekrarlayın.

Ardından pensler kullanarak, kafatasının dorsal yüzeyini beyinden ayırın. Yine pensler kullanarak kafatasının yan kısımlarını kesin. Şimdi bir spatula yardımıyla, beynin ventral yüzeyi boyunca olfaktör bulbları ve sinirsel bağlantıları kesin ve beyni nazikçe kafadan ayırın.

İris makası kullanarak, beyni kafatasına bağlayan tüm dura kısımlarını kesin. Beyin çıkarıldıktan sonra, beynin kendi hacminin en az 10 katı hacme sahip bir fissatif şişesine yerleştirin. Şişeyi 24 saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın.

24 saat sonra, beyni hafifçe çalkalayarak 3 kez PBS ile yıkayın. Beyin daha sonra PBS veya Hanks dengeli tuz çözeltisinde saklanabilir. Sodyum azid ile dört °C'de, beyinler üç ay boyunca saklanabilir.

Kesitlenmemiş. Uzmanlaşıldığında, tüm perfüzyon beş ila sekiz dakika arasında tamamlanabilirdi.