Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Simüle edilmiş iskemi için kalp kaynaklı hücreler hücre kültürü plaklarına yerleştirilir. Reperfüzyon model iskemi, oksijen seviyesi %0,5'in altındayken glukozsuz bir ortamda 150 dakika bekleterek gerçekleştirilir. Bu iskemik dönem, hücrelerin çoğunda büzülme ve kabarcıklanmaya yol açar. Ardından, reperfüzyonu simüle etmek için normal besiyeri ve oksijen seviyeleri yeniden sağlanır.

Mezenkimal kök hücreler eklenir ve hasarlı hücrelerle birlikte kültüre edilir. 24 saatlik ko-kültürden sonra hücreler, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kalsiyum ve Ethereum homodimer ile boyanır; konfokal mikroskop, iki hücre popülasyonunu ve bunların etkileşimlerini net bir şekilde göstermektedir. Akış sitometrisi analizi, bir grafiğe dökülebilen ve istatistiksel olarak analiz edilebilen üç hasarlı hücre kümesi ortaya çıkarır. Kök hücre transplantasyon protokolleri klinik uygulamaya girmektedir; daha iyi sonuçlar almak, protokolleri daha sağlam hale getirmek ve implante edilebilir hücreler için yeni kaynaklar bulmak güncel araştırmaların odak noktasını oluşturmaktadır.

Hücre tedavilerinin etkinliğini araştırmak kolay bir görev değildir ve tedavi sürecinde yer alan mekanizmaların incelenmesi için yeni araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. İskemi, perfüzyon hasarı ve kök hücre transplantasyonu sırasında hücresel bağlantıların ve hatta hücre altı mekanizmaların gözlemlenmesine olanak tanımak amacıyla deneysel bir protokol tasarladık. Tasarım kriterlerimiz, sadece konakçı ve donör hücrelerin bulunduğu, tamamen in vitro bir sistemdir.

Böylece çevre dokudan izole edilmiş olur. Yaralanma öncesinde, sırasında ve sonrasında 24 saate kadar hücre canlılığının sürekli ölçümü yapılır. Ayrıca, greftlenen hücrelerin akıbetinin izlenebilmesi için her iki hücre popülasyonu da net bir şekilde tanımlanır.

Bu hedefe ulaşmak için, yaygın olarak OGD olarak kısaltılan oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolü oluşturduk ve bunu bir reoksijenasyon dönemi ile takip ettik. Konak hücre olarak, bilinen bir kırmızı kardiyomiyoblast hücre hattı olan dokuz yaşındaki C2 hücrelerini seçtik. OGD sonrası hasarlı hücreler, kültüre eklenerek kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre transplantasyonu ile desteklendi.

Bu düzenek, konfokal floreşan mikroskopi kullanarak hücreler arası bağlantıları incelememize ve akış sitometrisi ile hasarlı hücrelerin hayatta kalma oranını belirlememize olanak sağladı. Hadi işe koyulalım ve bunu nasıl yaptığımızı görelim. H nine C two hücrelerinden kültür ortamını uzaklaştırın.

Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve Petri kaplarını beş dakika boyunca %0,05 trypsin EDTA ile sindirin. 37 °C'lik bir inkübatörde, trypsin etkisini DMEM kültür medyumu ile inhibe edin. Hücreleri 1200 RPM'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 1 mL DMEM kültür ortamında yeniden süspande edin; hücreleri tripan mavisi boyama kullanarak hemositometre ile sayın. 12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 30.000 H9 hESC ekleyin. Plağı 24 saat boyunca 37 °C CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ortamı aspirasyonla uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Üç mililitre glukozsuz ortam ekleyin. Plakayı hücre inkübasyon sistemine yerleştirin. İnkübasyon sistemindeki oksijeni uzaklaştırmak için azot gazını başlatın.

Oksijen seviyesi %0,5'e ulaşana kadar bekleyin. Ardından zamanlayıcıyı başlatın; %0,5 oksijen, yaklaşık üç milimetreküme cıva kısmi basınç anlamına gelir. Hücreleri 150 dakika boyunca simüle edilmiş iskemiye tabi tutun. İskemi sırasında hücreler yüzeyden kopmaya başlar ve membranlarında kabarcıklar oluşur. Her popülasyonun biraz farklı sürelerle, hücre görüntüsünün %60 ila %80'ine ulaşana kadar işlem görmesi gerektiğini saptadık.

Bu nedenle, iki R inkübasyonu ile başlamanızı öneririz. Ve eğer bu yeterli olmazsa, OGD süresini artırın. Bizim durumumuzda, dokuz yaşındaki C two hücreleri simüle edilmiş iskeminin sonunda tipik olarak 150 ila 70 dakika OGD'ye ihtiyaç duyar.

Hücrelerden glikozsuz ortamı uzaklaştırın ve kuyucuklara normal kültür ortamı pipetleyin. 12 kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37 °C karbon dioksit inkübatöründe bekletin. Bu aşama reperfüzyon dönemidir.

Simüle iskemi sırasında, transplantasyon için kurtarma hücrelerini hazırlayın. Floresan diyeti, vibrant DID'yi DMEM kültür ortamında 1:200 oranında seyreltin. Kurtarma hücrelerinden ortamı aspire edin ve vibrant Brent Place Petri kaplarına 300 µL DMEM ekleyerek 37 °C'lik karbondioksit inkübatöründe 30 dakika bekletin.

Reperfüzyonun sonunda 30 dakika sonra, post-iskemik H9C2 kardiyak miyoblastlarının bulunduğu her kuyucuğa bin mezenkimal kök hücre ekleyin. İlk adımlar H9C2 ekimi, iki kez PBS ile yıkama, tripsinleme ve sayım işlemleriyle aynıdır. Hücrelerin ko-kültürünü 24 saat boyunca 37 °C karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

24 saat sonra, kültür ortamını ve kuyucuklardaki yapışkan hücreleri aspirasyon ile toplayın. Bazı ölü hücrelerin 24 saatlik inkübasyon sırasında kültür kabı yüzeyinden ayrılmış olabilmesi nedeniyle, kültür ortamının da toplanması oldukça önemlidir.

Hücreleri 500 µL canlı, ölü, ölen çözeltisi, 5 µM kalsiyum ve PBS içerisinde 400 µM Ethidium homodimer ile 5 × 10⁴ hücre/mL konsantrasyonunda süspande edin. Ko-kültürlerde, mezenkimal kök hücreler, ilgili floresan hücre işaretlemesi ile H9C2 hücrelerinden ayırt edilir. Bu sayede hücre füzyonunun ve hücreden hücreye temas bölgelerinin tespit edilmesi mümkündür.

Ölü hücre oranı, her kültür için 10x objektif kullanılarak körleme yöntemiyle dört bağımsız görüş alanında değerlendirilebilir; bu işlem tekrarlanabilir bir hücre sayım sonucu sağlar. Hücreleri akış sitometrisi tüplerine aktarın. Ölçüm için akış sitometresini kurmak amacıyla Cell Quest Pro yazılımını başlatın.

Canlı ve ölü hücrelerin kontrol örneklerini hazırlayın. Canlı hücreler normal koşullarda aynı yoğunlukta kültüre edilir ve kalsiyum ile boyanır. Ölü hücreler, 10 micromole hidrojen peroksit ile bir saatlik uygulama ile hazırlanıp Ethereum homodimer ile boyanır ve aynı şekilde toplanır; cihaz ayarları, canlı hücrelerin kalsiyum pozitif ve Ethereum homodimer negatif olacağı şekilde düzenlenmelidir.

Ölü hücreler kalsiyum negatif ve Ethereum homodimer pozitifken, bu popülasyonların yüzdesi bir grafikte çubuklar şeklinde ifade edilebilir ve bu değerler üzerinden istatistiksel analiz gerçekleştirilebilir. Sağlıklı kök hücre eklemesinin popülasyondaki sağ kalan hücre oranını artırdığını saptadık. İlginç bir şekilde, hasar sonrası kurtarılan hücrelerin hem ölü hücrelerden hem de canlı kalan hücrelerden ayrı olarak kapılanabildiğini (gate edilebildiğini) gözlemledik.

Bu popülasyonun daha detaylı incelemeleri hak ettiğine inanıyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro kök hücre transplantasyonu ile simüle iskemik deneylerin standart bir şekilde nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz. Herhangi bir teknik sorunuz olması durumunda bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Size yardımcı olmak için burada olacağız.