Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Kardiyak türevli hücreler, simüle edilmiş iskemi için hücre kültürü plakalarına yerleştirilir. Reperfüzyon model iskemi glukoz içermeyen bir ortamda 150 dakika ile elde edilirken, oksijen seviyesi %0.5'in altındadırBu iskemik dönem çoğu hücrenin küçülmesine ve çırpınmasına yol açar. Daha sonra reperfüzyonu simüle etmek için normal ortam ve oksijen seviyeleri yeniden verilir.

Mezenkimal kök hücreler, hasarlı hücrelerle birlikte eklenir ve yetiştirilir. 24 saatlik birlikte yetiştirme hücrelerinden sonra hücreler kalsiyum ve Ethereum homodimer ile boyanır Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için, konfokal mikroskop, iki hücre popülasyonunun ve etkileşimlerinin akış sitometrisi analizinin, bir grafik üzerinde çizilebilen ve istatistiksel olarak analiz edilebilen üç hasarlı hücre kümesini ortaya çıkardığını açıkça gösterir Kök hücre nakli. Protokoller klinik uygulamaya girmek, daha iyi sonuçlar almak, protokolleri daha sağlam hale getirmek ve implante edilebilir hücreler için yeni kaynaklar bulmak son araştırmaların odak noktasıdır.

Hücre tedavilerinin etkinliğini araştırmak kolay bir iş değildir ve tedavi sürecinde yer alan mekanizmaları araştırmak için yeni araçlara ihtiyaç vardır. İskemi, perfüzyon hasarı sırasında ve kök hücre nakli sonrası hücresel bağlantıların ve hatta hücre altı mekanizmaların gözlenmesine olanak sağlamak için deneysel bir protokol tasarladık. Tasarım kriterlerimiz, tamamen in vitro sistemimiz, ancak sadece konak ve verici hücreler mevcuttur.

Böylece çevre dokudan izole edilir. Yaralanma öncesinde, sırasında ve sonrasında 24 saate kadar hücre canlılığının sürekli ölçümü. Ve her iki hücre popülasyonunun net bir şekilde tanımlanması, böylece aşılanmış hücrelerin kaderi izlenebilir.

Bu hedefe ulaşmak için, genellikle OGD olarak kısaltılan bir oksijen, glikoz yoksunluğu protokolü oluşturduk ve ardından bir yeniden oksijenlendirme periyodu oluşturduk. Konak hücre seçimimiz, bilinen kırmızı kardiyokardiyo miyoblast hücre hattı aracılığıyla dokuz yaş C iki hücre idi. OGD sonrası kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler kültüre eklenerek transplantasyon ile hasarlı hücreler desteklendi.

Bu kurulum, konfokal orman ve mikroskopi kullanarak hücreler arası bağlantıları araştırmamıza ve akış sitometrisi ile hasarlı hücrelerin hayatta kalma oranını ölçmemize izin verdi. İşe koyulalım ve nasıl yaptığımızı görelim. Kültür ortamını H dokuz C iki hücreden çıkarın.

Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve% 0.05 tripsin EDTA ile sindirin, Petri kaplarını beş dakika boyunca yerleştirin. 37 derecelik bir inkübatörde, tripsini DMEM kültür ortamı ile inhibe edin. Hücreleri sekiz dakika boyunca 1200 RPM'de döndürün.

Süper natin bir milimetre DM EM kültüründe hücreleri yeniden askıya aldıktan sonra, triam mavisi boyama C 30, 000 H dokuz C kuyu başına iki hücre kullanarak sitometre ile orta sayım hücreleri. 12 oyuklu bir plakada, plakayı 24 saat boyunca 37 derece karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Ortamı aspirasyon ile çıkarın, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Üç milimetre glikozsuz ortam ekleyin. Plakayı hücre inkübasyon sistemine yerleştirin. Oksijeni inkübasyon sisteminden çıkarmak için nitrojen gazını başlatın.

Oksijen seviyesi %0,5'e ulaşana kadar bekleyinArdından zamanlayıcıyı başlatın,% 0,5 Oksijen, yaklaşık üç milimetre cıva kısmi gerilime maruz kalan hücrelerin 150 dakikalık simüle edilmiş iskemiye maruz kalması anlamına gelir. İskemi sırasında hücreler yüzeyden ayrılır ve zarları çatlamaya başlar. Her popülasyonun biraz farklı uzunluklara ihtiyaç duyduğunu, hücre görüntüsünün %60 ila 80'ine ulaşmadığını bulduk.

Bu yüzden iki R inkübasyonu ile başlamanızı öneririz. Ve yeterli değilse, OGD'nin süresini artırın. Bizim durumumuzda, dokuz C iki hücre tipik olarak simüle edilmiş iskeminin sonunda 150 ila 70 dakikalık OGD'ye ihtiyaç duyar.

Glikoz içermeyen ortamı hücrelerden çıkarın, normal kültür ortamını kuyucuklara pipetleyin. 37 derecelik karbondioksit inkübatörüne 30 dakika boyunca 12 oyuklu bir plaka yerleştirin. Bu reperfüzyon dönemidir.

Simüle edilmiş iskemi sırasında, transplantasyon için kurtarma hücreleri hazırlayın. Floresan diyeti, canlı DID'yi DMEM kültüründe bir ila 200 oranında seyreltin. Kurtarma hücrelerinden orta aspirat ortamı ve 37 derecelik karbondioksit inkübatöründe 30 dakika boyunca canlı Brent Place Petri kaplarından 300 mikrolitre DMEM ekleyin.

Reperfüzyonun sonunda 30 dakika sonra, post iskemik H, dokuz C, iki kardiyak miyoblasta kadar kuyu başına bin mezenkimal kök hücre. İlk adımlar H ile aynıdır: dokuz C, iki tohumlama, iki kez PBS, tripsin ile yıkama ve sayma. Hücrelerin kokültür kültürünü 24 saat boyunca 37 derece karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

24 saat sonra. Kuyucuklardan bir kültür ortamı ve yapışma hücrelerini izasyon ile hasat edin. Bir kültür ortamının toplanması da çok önemlidir, çünkü bazı ölü hücreler 24 saatlik inkübasyon sırasında kültürlenmiş çanak yüzeyinden ayrılabilir.

Hücreleri 500 mikrolitre canlı, ölü, kalıp çözeltisi, beş NMO kalsiyum ve 400 NMO Ethereum homodimerinde PBS'de beş kez 10 mililitre başına dört hücre kuvvetine kadar askıya alın. Ko kültürleri durumunda, mezenkimal kök hücreler, ilgili floresan hücre etiketlemesi ile H dokuz C iki hücreden ayırt edilir. Bu şekilde hücre füzyonunu ve hücreden hücreye temas bölgelerini tespit etmek mümkündür.

Ölü hücrelerin oranı, her kültür için kör bir şekilde 10 kat objektif kullanılarak dört bağımsız bakış alanında değerlendirilebilir ve bu da tekrarlanabilir bir hücre sayımı sonucu verir. Hücreleri akış sitometrik tüplere aktarın. Akış sitometresini ölçüm için ayarlamak üzere hücre Quest Pro yazılımını başlatın.

Canlı ve ölü hücrelerin kontrol örneklerini hazırlayın. Canlı hücreler normal koşullarda aynı yoğunlukta kültürlenir ve kalsiyum ile boyanır. Ölü hücreler, Ethereum, homodimer ile boyanmış 10 mikromol hidrojen peroksit ile bir saatlik muamele ile hazırlanır ve cihaz ayarlarının aynı şekilde toplanması, canlı hücrelerin kalsiyum pozitif ve Ethereum homodimer negatif olması için ayarlanması gerekir.

Ölü hücreler kalsiyum negatif ve Ethereum homodimer pozitif iken, bu popülasyonların yüzdesi bir grafik üzerinde çubuklar olarak ifade edilebilir ve bu değerler üzerinde istatistiksel analiz yapılabilir. Sağlıklı kök hücrelerin eklenmesinin popülasyonda hayatta kalan hücrelerin oranını artırdığını bulduk. İlginç bir şekilde, yaralanmadan sonra kurtarılan hücrelerin ölü olanlardan ve aynı zamanda hayatta kalanlardan da ayrılabileceğini gözlemledik.

Bu nüfusun daha fazla araştırmayı gerektirdiğine inanıyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro kök hücre nakli ile simüle edilmiş iskemi deneylerinin standart bir şekilde nasıl yürütüleceğini iyi anlamış olmalısınız. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar. Herhangi bir teknik sorunuz olması durumunda, bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Yardım etmek için orada olacağız.