Name: Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin, kök hücre nakli ile iskemi/reperfüzyon hasarlı kardiyak hücrelerin iyileşmesini değerlendirmek için in vitro model kurulumunu. Bu yöntem hücre etkileşimlerini ve tedavi mekanizmalarını incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma OTKA (Macarca Bilimsel Araştırma Fonu) D45933, T049621, TET (Macarca Bilim ve Teknoloji Vakfı) A4/04, Arg-17/2006 ve SIN, Bolyai, Öveges Burslar ve TÁMOP tarafından desteklenen 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 ve 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83.803. William Gesztes üzerinden ses sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.

1. H9c2 kardiyomyoblast hücrelerinin hazırlanması
H9c2 sıçan kardiyomiyoblastları ATCC'den (Wesel, Almanya) temin edilmiş ve %10 fetal bovine serum, 4 mM L-glutamin, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin içeren yüksek glukozlu (4.5 g/L) DMEM'de genişletilmiştir. H9c2 miyoblast hücre hattı, embriyonik sıçan kalbinden türetilmiştir ve hem iskelet hem de kalp kası için bir in vitro model olarak kullanılır 8,9.
H9c2 hücreleri içeren 12 kuyucuklu plak hazırlayın:
<ol>
	<li>H9c2 hücrelerinin bulunduğu Petri kabındaki kültür ortamını uzaklaştırın.</li>
	<li>Hücreleri iki kez 5 ml PBS ile yıkayın ve 2-3 ml %0,05 tripsin/EDTA ile sindirin.</li>
	<li>Petri kabını 5 dakika boyunca 37°C'deki inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Tripsini 10 ml DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.</li>
	<li>Hücreleri 1200 RPM'de 8 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 1 ml DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve Trypan Blue boyaması kullanarak hemositometre ile hücre sayımı yapın.</li>
	<li>12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa, 2 ml DMEM içerisinde 30.000 H9c2 hücresi ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 24 saat boyunca 37°C CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
</ol>
2. Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon
İskemi/reperfüzyon, H9c2 hücre kültürlerine oksijen glukoz yoksunluğu (OGD) uygulanarak in vitro olarak simüle edilmiştir. Bu işlem, OGD sırasında hücrelerin gözlemlenmesine olanak tanıyan PeCon hücre inkübasyon sistemine (Erbach, Almanya) sahip Zeiss konfokal mikroskobun tablasında gerçekleştirilmiştir.
<ol>
	<li>H9c2 hücrelerinin bulunduğu 12 kuyucuklu plakadan besiyerini aspirasyonla uzaklaştırın.</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 3 ml glukozsuz besiyeri ekleyin.</li>
	<li>Plakayı hücre inkübasyon sistemine yerleştirin.</li>
	<li>İnkübasyon sistemindeki oksijeni dışarı atmak için azot gazını başlatın.</li>
	<li>Oksijen seviyesi %0,5'e ulaşana kadar bekleyin ve ardından zamanlayıcıyı başlatın. %0,5 oksijen, yaklaşık 3 mmHg kısmi gerilim anlamına gelir. Hücreleri 150 dakikalık simüle edilmiş iskemiye tabi tutun.</li>
	<li>Simüle edilmiş iskemi sonunda, glukozsuz besiyerini hücrelerden uzaklaştırın.</li>
	<li>Kuyucuklara 2 ml normal kültür besiyeri pipetleyin.</li>
	<li>12 kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37°C CO2 inkübatöründe bekletin; bu "reperfüzyon dönemi"dir.</li>
</ol>
3. Kurtarma mezenkimal kök hücrelerinin hazırlanması
İnsan kaynaklı kemik iliği T75 flasklara alındı ve %10 fetal calf serum (FCS), 100 U/ml penisilin ve 100 μg/ml streptomisin, 4 mM L-glutamin ve 1 g/l glukoz içeren Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) kültür ortamı ile seyreltildi. Flasklar, %5 CO2 içeren tam nemlendirilmiş bir atmosferde, 37°C'de 3 gün boyunca inkübe edildi. İnkübasyon süresinin ardından BMSC'ler flaskların yüzeyine tutundu ve kemik iliğinin geri kalan bileşenleri PBS ile yıkanarak uzaklaştırıldı. Deneylerde kullanılan BMSC'ler 1 ila 5 pasaj arasındaydı. Hücrelerin kimliği, akış sitometrisi ile soyağa özgü hücre yüzey markerlarının varlığıyla doğrulandı. Hematopoetik soy ağacına özgü yüzey markerları (CD34, CD45) ve mezenkimal yüzey markerları (CD73, CD90, CD105 ve CD166) incelendi.
Simüle edilen iskemi sırasında, transplantasyon için kurtarma mezenkimal kök hücrelerini hazırlayın.
<ol>
	<li>Vybrant DiD floresan boyasını, DMEM kültür ortamında 1:200 oranında seyreltin.</li>
	<li>Kurtarma hücrelerindeki ortamı aspire edin ve 300 μl Vybrant DiD içeren DMEM ekleyin.</li>
	<li>Petri kabını 37°C CO2 inkübatöründe 30 dakika bekletin.</li>
	<li>Mezenkimal kök hücrelerin bulunduğu Petri kabındaki kültür ortamını uzaklaştırın.</li>
	<li>Hücreleri 5 ml PBS ile iki kez yıkayın ve 2-3 ml %0,05 tripsin/EDTA ile sindirin.</li>
	<li>Petri kabını 37°C inkübatörde 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Trypsin etkisini 10 ml DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.</li>
	<li>Hücreleri 1200 RPM'de 8 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 1 ml DMEM kültür ortamında yeniden süspanse edin ve Trypan Blue boyaması kullanarak hemositometre ile hücreleri sayın.</li>
	<li>Reperfüzyonun sonundaki 30. dakikada, post-iskemik H9c2 kardiyak miyoblastlarının bulunduğu her kuyucuğa 20.000 mezenkimal kök hücre ekleyin.</li>
	<li>Hücrelerin ko-kültürünü 24 saat boyunca 37°C CO2 inkübatöründe bekletin.</li>
</ol>
4. Konfokal mikroskopi ile analiz
Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon hasarının ardından, hücreler 24 saat boyunca normal kültür ortamında inkübe edilir.
<ol>
	<li>24 saat sonra hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 500 μl canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) (5x104 hücre/ml) 30 dakika boyunca boyayın.</li>
</ol>
Morfoloji ve floresanla seçilen canlı ve ölü hücrelerin konfokal görüntülerle değerlendirmesi ImageJ yazılımı (National Institutes of Health, ABD) ile gerçekleştirilebilir. Ko-kültürler durumunda, MSC'ler Vybrant DiD hücre etiketlemeleri sayesinde H9c2 hücrelerinden ayırt edilebilir. Ölü hücre oranı, her kültür için 4 bağımsız görüş alanında (10x objektif) körleme yöntemiyle değerlendirilebilir10.
42 mm'lik cam lamlar üzerinde kültüre edilen H9c2 kardiyomiyoblastları, konfokal mikroskobun hücre inkübasyon sistemi kullanılarak iskemi/reperfüzyon yaralanması sırasında ve sonrasında time-lapse video mikroskopi ile incelenebilir. Hücre füzyonu ve hücreler arası nanotüplerin oluşumu gibi hücreler arası etkileşimler zaman içinde çalışılabilir.
5. Akış sitometrisi ile analiz
Simüle edilmiş iskemi/reperfüzyon hasarının ardından, hücreler 24 saat boyunca normal kültür ortamında inkübe edilir.
<ol>
	<li>24 saat sonra kültür ortamını toplayın. 24 saatlik inkübasyon sırasında bazı ölü hücrelerin kültür kabı yüzeyinden ayrılmış olabileceği için kültür ortamının da toplanması çok önemlidir.</li>
	<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve %0,05 trypsin-EDTA ile sindirin.</li>
	<li>Trypsini DMEM kültür ortamı ile inhibe edin.</li>
	<li>Hücreleri ve toplanan kültür ortamını 1200 RPM'de (yaklaşık 150-200g) 8 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı uzaklaştırın.</li>
	<li>Hücreleri 30 dakika boyunca 500 μL canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) süspande edin (5x104 hücre/ml).</li>
	<li>Hücreleri akış sitometrisi tüplerine aktarın.</li>
	<li>CellQuest Pro yazılımını başlatın.</li>
	<li>Akış sitometresini ölçüm için ayarlamak amacıyla canlı ve ölü hücre kontrol örnekleri hazırlayın.
		<ol class="lalpha">
			<li>H9c2 hücrelerini, 1. maddede açıklandığı gibi, 12 kuyucuklu plakalara 3x104 yoğunluğunda ekin.</li>
			<li>1. maddede açıklandığı gibi, tek seferlik tripsinizasyon ile canlı hücre kontrollerini hazırlayın.</li>
			<li>10 μM H2O2 ile 1 saat boyunca işlem yaparak ölü hücre kontrollerini hazırlayın.</li>
			<li>Tripsinizasyon sonrası, canlı ve ölü hücre kontrollerini 500 μl canlı/ölü boya çözeltisinde (PBS içinde 5 nM calcein-AM ve 400 nM Ethidium-homodimer-2) yeniden süspande edin.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Cihaz ayarları, canlı hücrelerin calcein pozitif ve ethidium homodimer negatif, ölü hücrelerin ise calcein negatif ve ethidium homodimer pozitif olacağı şekilde ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Bu popülasyonların yüzdesi bir grafikte sütunlar olarak ifade edilebilir ve bu değerler üzerinden istatistiksel analiz gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Farklı deneysel grupları ölçün.</li>
</ol>
6. Temsili sonuçlar:
Sonuçlarımız, eklenen mezenkimal kök hücrelerin post-iskemik kardiyak hücrelerin sağkalımını iyileştirebileceğini göstermiştir. Konfokal mikroskopi görüntüleri, gözlemlenen korumada muhtemelen önemli bir rol oynayan, kısmi membran bağlantısı veya hücreler arası nanotüpler gibi doğrudan hücreden hücreye etkileşimleri ortaya çıkarmıştır10. Bu nanotüpler birkaç hücre çapı boyunca uzanmakta olup çapları 200 ve 500 nm arasındaydı (beyaz oklar).
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Floresan mikroskopi görüntüsü; yeşil ve kırmızı belirteçlerle hücre etiketlemesi, ölçek çubuğu 50 µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1. Hücreler arasında nanotüp oluşumu. Vybrant DiO ile etiketlenmiş kardiyomiyoblastlar ve Vybrant DiD ile etiketlenmiş mezenkimal kök hücreler arasında nanotüp oluşumu (beyaz ok) gözlemlenmiştir.
Akış sitometrisi analizi, hayatta kalan ve nekrotik kardiyomiyoblastlar ile mezenkimal kök hücre popülasyonlarını göstermiştir. İlginç bir şekilde, kalsiyen içeren ancak aynı zamanda ölü hücrelerin göstergesi olan etidyum homodimeri de içeren üçüncü bir 'hasarlı' kardiyomiyoblast hücre popülasyonu da gözlemledik (Şekil 2).
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Akış sitometrisi nokta grafiği, hücre canlılığı analizi: canlı, hasarlı, ölü ve döküntü hücre popülasyonları." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2. Simüle edilmiş iskemi sonrası farklı hücre popülasyonlarının temsili nokta grafiği.
Çeşitli deneylerin değerlendirmesi, mezankimal kök hücre eklemesinin, iskemi sonrası tek başına kültüre edilen kardiyomiyoblastlara kıyasla, post-iskemik H9c2 kardiyomiyoblastlarında canlı hücre yüzdesini anlamlı derecede artırdığını göstermiştir (Şekil 3).
<img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Kontrol, I-R modeli ve I-R+BMSC koşullarındaki canlı hücre yüzdesini gösteren sütun grafiği, analiz." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 3"> 
Şekil 3. Kök hücre tedavisinin post-iskemik kardiyomiyoblastlar üzerindeki etkisi. Canlı hücre yüzdesi, kontrole kıyasla simüle edilmiş iskemi sonrası önemli ölçüde azalmış (kontrol vs. I-R modeli: 90.36±2.60 vs. 10.52±0.48, *** p&gt;0.001), mezenkimal kök hücrelerin eklenmesiyle birlikte ise artış göstermiştir (I-R modeli vs. I-R + BMSC: 10.52±0.48 vs. 25.21±2.13, *** p&gt;0.001). Veriler ortalama±SEM olarak sunulmuştur. Verilerin istatistiksel analizi, Tukey çoklu karşılaştırma post hoc testi ile tek yönlü varyans analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

<ol><li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li>
<li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li>
<li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-based+CD133%2B+cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li>
<li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medicine%22%5BJournal%5D)">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li>
<li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair%3A+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li>
<li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li>
<li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+biochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+%28H9c2%29+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li>
<li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li>
<li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li>
<li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li>
<li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FReoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li>
<li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+%28oxygen-glucose+deprivation%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li>
<li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li>
<li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li>
<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
<li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Göstermiştir protokol in vitro bir yaklaşım, böyle bir modelin tüm avantaj ve dezavantajları ile miyokard infarktüsü kök hücre tedavisi, çok daha karmaşık bir sorun. Açıkçası miyokard infarktüsü sırasında ve sonrasında meydana gelen karmaşık olayları (örneğin immünolojik) yansıtmamaktadır ancak eklendi hücreleri postiskemik hücreleri üzerinde doğrudan etkileri odaklanabilirsiniz. H9c2 cardiomyoblasts simüle iskemi etkileri çok kullanılan hücre geçiş sayısı ve O 2 konsantrasyonu, OGD zaman bağlıdır. Bir doğru,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Calcein-AM </td><td> Moleküler Probları </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> ethidium homodimer-2 </td><td> Moleküler Probları </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant DID </td><td> Moleküler Probları </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler. <table border="1"><tbody><tr><td> Ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Pecon hücre kuluçka sistemi Zeiss mikroskoplar </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Ekipman.

bir kök hücre nakli in vitro simüle İskemi / reperfüzyon modeli

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Kök hücre naklinin klinik pratikte 1,2,3 kendi yolunu buluyor. , Daha iyi sonuçlar elde protokolleri daha güçlü hale getirmek ve implante edilebilir piller için yeni kaynaklar bulma 4,5 son araştırma odağı . Hücre tedavileri etkinliğinin incelenmesi kolay bir iş değildir ve yeni araçlar, tedavi sürecinin 6 katılan mekanizmalarının araştırılması için ihtiyaç vardır . Iskemi / reperfüzyon deneysel bir protokol, ve kök hücre nakli sonrası iskemi / reperfüzyon sırasında hücresel bağlantıları ve hatta hücre içi mekanizmaları gözlem izin ve hücre tedavisinin etkinliğini değerlendirmek amacıyla tasarlanmıştır. H9c2 cardiomyoblast hücreleri, hücre kültürü plakaları 7,8 üzerine yerleştirilir . İskemi glikoz serbest bir ortamda% 0.5 altında oksijen seviyesi ile 150 dakika ile simüle edildi. Sonra, normal medya ve oksijen seviyesi reperfüzyon simüle etmek için tekrar edilmiştir. Oksijen glikoz yoksunluk sonra,hasarlı hücreleri kültürüne ekleyerek elde edilen mezenkimal kök hücreler işaretli insan kemik iliği nakli ile tedavi edildi. Mezenkimal kök hücreleri, minimal invaziv cerrahi ile kolayca erişilebilir, kolayca genişletilebilir ve otolog, çünkü klinik çalışmalarda tercih edilir. Eş-yetiştiriciliği 24 saat sonra, hücreler canlı ve ölü hücrelerden ayırt etmek Calcein ve ethidium-homodimer ile boyandı. Bu kurulum bize konfokal floresan mikroskobu kullanarak hücrelerarası bağlantıları araştırmak ve postiskemik hücreler flow sitometri ile hayatta kalma oranını ölçmek için izin verdi. Mikroskopisi gibi hücre füzyon ve hücrelerarası nanotüpler oluşumu gibi iki hücre popülasyonlarının etkileşimleri gösterdi. Flow sitometri analizi hasarlı hücrelerinin bir grafik üzerinde çizilen ve istatistiksel analiz edilebilir 3 kümeleri ortaya çıkardı. Bu kesimler ayrı ayrı araştırılmalıdır ve sonuçlar simüle etkinliğini bu veriler üzerinde çizilebilirterapötik yaklaşım.

Biz kurmak nasıl göstermek<em&gt; In vitro</em&gt; Iskemi / reperfüzyon modeli ve nasıl postiskemik kalp hücreleri kök hücre tedavisinin etkisini değerlendirmek.

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Kök hücre transplantasyonu protokolleri klinik uygulamalara girmeye başlamıştır1,2,3. Daha iyi sonuçlar elde etmek, protokolleri daha sağlam hale getirmek ve ...

Simüle edilmiş iskemi için kalp kaynaklı hücreler hücre kültürü plaklarına yerleştirilir. Reperfüzyon model iskemi, oksijen seviyesi %0,5'in altındayken glukozsuz bir ortamda 150 dakika bekleterek gerçekleştirilir. Bu iskemik dönem, hücrelerin çoğunda büzülme ve kabarcıklanmaya yol açar. Ardından, reperfüzyonu simüle etmek için normal besiyeri ve oksijen seviyeleri yeniden sağlanır.Mezenkimal kök hücreler eklenir ve hasarlı hücrelerle birlikte kültüre edilir. 24 saatlik ko-kültürden sonra hücreler, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için kalsiyum ve Ethereum homodimer ile boyanır; konfokal mikroskop, iki hücre popülasyonunu ve bunların etkileşimlerini net bir şekilde göstermektedir. Akış sitometrisi analizi, bir grafiğe dökülebilen ve istatistiksel olarak analiz edilebilen üç hasarlı hücre kümesi ortaya çıkarır. Kök hücre transplantasyon protokolleri klinik uygulamaya girmektedir; daha iyi sonuçlar almak, protokolleri daha sağlam hale getirmek ve implante edilebilir hücreler için yeni kaynaklar bulmak güncel araştırmaların odak noktasını oluşturmaktadır.Hücre tedavilerinin etkinliğini araştırmak kolay bir görev değildir ve tedavi sürecinde yer alan mekanizmaların incelenmesi için yeni araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. İskemi, perfüzyon hasarı ve kök hücre transplantasyonu sırasında hücresel bağlantıların ve hatta hücre altı mekanizmaların gözlemlenmesine olanak tanımak amacıyla deneysel bir protokol tasarladık. Tasarım kriterlerimiz, sadece konakçı ve donör hücrelerin bulunduğu, tamamen in vitro bir sistemdir.Böylece çevre dokudan izole edilmiş olur. Yaralanma öncesinde, sırasında ve sonrasında 24 saate kadar hücre canlılığının sürekli ölçümü yapılır. Ayrıca, greftlenen hücrelerin akıbetinin izlenebilmesi için her iki hücre popülasyonu da net bir şekilde tanımlanır.Bu hedefe ulaşmak için, yaygın olarak OGD olarak kısaltılan oksijen ve glikoz yoksunluğu protokolü oluşturduk ve bunu bir reoksijenasyon dönemi ile takip ettik. Konak hücre olarak, bilinen bir kırmızı kardiyomiyoblast hücre hattı olan dokuz yaşındaki C2 hücrelerini seçtik. OGD sonrası hasarlı hücreler, kültüre eklenerek kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücre transplantasyonu ile desteklendi.Bu düzenek, konfokal floreşan mikroskopi kullanarak hücreler arası bağlantıları incelememize ve akış sitometrisi ile hasarlı hücrelerin hayatta kalma oranını belirlememize olanak sağladı. Hadi işe koyulalım ve bunu nasıl yaptığımızı görelim. H nine C two hücrelerinden kültür ortamını uzaklaştırın.Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve Petri kaplarını beş dakika boyunca %0,05 trypsin EDTA ile sindirin. 37 °C'lik bir inkübatörde, trypsin etkisini DMEM kültür medyumu ile inhibe edin. Hücreleri 1200 RPM'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra hücreleri 1 mL DMEM kültür ortamında yeniden süspande edin; hücreleri tripan mavisi boyama kullanarak hemositometre ile sayın. 12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 30.000 H9 hESC ekleyin. Plağı 24 saat boyunca 37 °C CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ortamı aspirasyonla uzaklaştırın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.Üç mililitre glukozsuz ortam ekleyin. Plakayı hücre inkübasyon sistemine yerleştirin. İnkübasyon sistemindeki oksijeni uzaklaştırmak için azot gazını başlatın.Oksijen seviyesi %0,5'e ulaşana kadar bekleyin. Ardından zamanlayıcıyı başlatın; %0,5 oksijen, yaklaşık üç milimetreküme cıva kısmi basınç anlamına gelir. Hücreleri 150 dakika boyunca simüle edilmiş iskemiye tabi tutun. İskemi sırasında hücreler yüzeyden kopmaya başlar ve membranlarında kabarcıklar oluşur. Her popülasyonun biraz farklı sürelerle, hücre görüntüsünün %60 ila %80'ine ulaşana kadar işlem görmesi gerektiğini saptadık.Bu nedenle, iki R inkübasyonu ile başlamanızı öneririz. Ve eğer bu yeterli olmazsa, OGD süresini artırın. Bizim durumumuzda, dokuz yaşındaki C two hücreleri simüle edilmiş iskeminin sonunda tipik olarak 150 ila 70 dakika OGD'ye ihtiyaç duyar.Hücrelerden glikozsuz ortamı uzaklaştırın ve kuyucuklara normal kültür ortamı pipetleyin. 12 kuyucuklu plakayı 30 dakika boyunca 37 °C karbon dioksit inkübatöründe bekletin. Bu aşama reperfüzyon dönemidir.Simüle iskemi sırasında, transplantasyon için kurtarma hücrelerini hazırlayın. Floresan diyeti, vibrant DID'yi DMEM kültür ortamında 1:200 oranında seyreltin. Kurtarma hücrelerinden ortamı aspire edin ve vibrant Brent Place Petri kaplarına 300 µL DMEM ekleyerek 37 °C'lik karbondioksit inkübatöründe 30 dakika bekletin.Reperfüzyonun sonunda 30 dakika sonra, post-iskemik H9C2 kardiyak miyoblastlarının bulunduğu her kuyucuğa bin mezenkimal kök hücre ekleyin. İlk adımlar H9C2 ekimi, iki kez PBS ile yıkama, tripsinleme ve sayım işlemleriyle aynıdır. Hücrelerin ko-kültürünü 24 saat boyunca 37 °C karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.24 saat sonra, kültür ortamını ve kuyucuklardaki yapışkan hücreleri aspirasyon ile toplayın. Bazı ölü hücrelerin 24 saatlik inkübasyon sırasında kültür kabı yüzeyinden ayrılmış olabilmesi nedeniyle, kültür ortamının da toplanması oldukça önemlidir.Hücreleri 500 µL canlı, ölü, ölen çözeltisi, 5 µM kalsiyum ve PBS içerisinde 400 µM Ethidium homodimer ile 5 × 10⁴ hücre/mL konsantrasyonunda süspande edin. Ko-kültürlerde, mezenkimal kök hücreler, ilgili floresan hücre işaretlemesi ile H9C2 hücrelerinden ayırt edilir. Bu sayede hücre füzyonunun ve hücreden hücreye temas bölgelerinin tespit edilmesi mümkündür.Ölü hücre oranı, her kültür için 10x objektif kullanılarak körleme yöntemiyle dört bağımsız görüş alanında değerlendirilebilir; bu işlem tekrarlanabilir bir hücre sayım sonucu sağlar. Hücreleri akış sitometrisi tüplerine aktarın. Ölçüm için akış sitometresini kurmak amacıyla Cell Quest Pro yazılımını başlatın.Canlı ve ölü hücrelerin kontrol örneklerini hazırlayın. Canlı hücreler normal koşullarda aynı yoğunlukta kültüre edilir ve kalsiyum ile boyanır. Ölü hücreler, 10 micromole hidrojen peroksit ile bir saatlik uygulama ile hazırlanıp Ethereum homodimer ile boyanır ve aynı şekilde toplanır; cihaz ayarları, canlı hücrelerin kalsiyum pozitif ve Ethereum homodimer negatif olacağı şekilde düzenlenmelidir.Ölü hücreler kalsiyum negatif ve Ethereum homodimer pozitifken, bu popülasyonların yüzdesi bir grafikte çubuklar şeklinde ifade edilebilir ve bu değerler üzerinden istatistiksel analiz gerçekleştirilebilir. Sağlıklı kök hücre eklemesinin popülasyondaki sağ kalan hücre oranını artırdığını saptadık. İlginç bir şekilde, hasar sonrası kurtarılan hücrelerin hem ölü hücrelerden hem de canlı kalan hücrelerden ayrı olarak kapılanabildiğini (gate edilebildiğini) gözlemledik.Bu popülasyonun daha detaylı incelemeleri hak ettiğine inanıyoruz. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro kök hücre transplantasyonu ile simüle iskemik deneylerin standart bir şekilde nasıl yürütüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz. Herhangi bir teknik sorunuz olması durumunda bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin. Size yardımcı olmak için burada olacağız.

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Teslimi için cerrahi işlem embriyonik kök hücre elde edilen endotel hücreleri iskemik hindlimb biyoparlaklık görüntüleme ile non-invaziv takibi ile gösterilmiştir.

Embriyonik Kök Hücre Tedavi Hindlimb İskemi Türetilmiş Endotel Hücreleri

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Serebral iskemi-reperfüzyon bir fare modeli kontur Patofizyoloji araştırmak için kuruldu. Klemple sağ orta serebral arter ve şu ortak Karotid arter ligate ve kan akımı iskemi 10-40 dakika sonra geri yükleme.

Serebral iskemi-reperfüzyon iki damar tıkanıklığı fare modeli

Burada rekonstrüktif mikrocerrahide iskemi-reperfüzyon hasarının patofizyolojisini incelemek için klinik öncesi bir hayvan modelini açıklıyoruz. Sıçanyüzeysel kaudal epigastrik damarlar dayalı Bu ücretsiz deri flep modeli de iskemi-reperfüzyon yaralanma ile ilgili hasarı dengelemek için farklı tedaviler ve bileşiklerin değerlendirilmesi için izin verebilir.

Rekonstrüktif Mikrocerrahide İskemi-Reperfüzyon Hasarı Nın İnceleştirilmesinde Klinik Öncesi Sıçan Modeli

Biz hücre tabanlı tedaviler için kök hücrelerin intramiyokardiyal uygulama etkisini ve güvenliğini test etmek için sol circumflex arter tıkanıklığı ve hızlı pacing tarafından indüklenen kalp yetmezliği bir domuz modeli kurmak için çalıştı.

Kök Hücre Tedavisi Için Post-miyokard Enfarktüsü Kalp Yetmezliği Domuz Modeli Oluşturma

Kök hücreler sürekli miyokardiyal hasarı olan bireyler için potansiyel tedaviler olarak araştırılır, ancak, onların azaltılmış canlılık ve yaralı doku içinde tutma onların uzun vadeli etkinliğini etkileyebilir. Bu yazıda iskemi reperfüzyon yaralanması nın bir murine modelinde kök hücre dağıtımı için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır.

Bir Murine Modelinde İskemi Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Kök Hücrelerin Gecikmiş İntramiyokardiyal Teslimi

Uzamsal mesafe, ayrı endotel ve kardiyomiyosit hücre katmanlarının bir ko-kültür modelinde hipoksi / reoksijenasyon hasarının değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da ilk kez, kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Bu makalede, I/R gelişimini ve tedavisini daha iyi anlamak için omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak 3 günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyon (I/R) modellemesi açıklanmaktadır. Bu model basit, hızlı ve ucuzdur.

Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Protokol, moyamoya dışı akut iskemik inmenin tedavisi için ensefalomiyosinanjiyozis-iskemik beyin dokusunun pial yüzeyine vasküler temporalis kas flebinin greftlenmesi için yöntemler sağlamayı amaçlamaktadır. Yaklaşımın anjiyogenezi arttırmadaki etkinliği, farelerde geçici bir orta serebral arter tıkanıklığı modeli kullanılarak değerlendirilir.

Farelerde Orta Serebral Arter Oklüzyonu Kaynaklı İnme Sonrası Ensefalomiyosinanjiyoz Tedavisi İçin Bir Model

Burada, yüksek metabolik proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenasyon hasarını modellemek için in vitro bir protokolü tanımlıyoruz. Bu model, proksimal tübul hasar belirteçlerinin ekspresyonu ve mitokondriyal solunum fonksiyonunun değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilen metabolik stres kaynaklı hasarı indüklemek için tasarlanmıştır.

Proksimal tübüler epitel hücrelerinde hipoksi/reoksijenlenme yaralanmasının modellenmesi

Öğrenin, kök hücre nakli ile iskemi/reperfüzyon hasarlı kardiyak hücrelerin iyileşmesini değerlendirmek için in vitro model kurulumunu. Bu yöntem hücre etkileşimlerini ve tedavi mekanizmalarını incelemeye olanak tanır.

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Daha fazla video keşfet