Name: Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin Cre-LoxP rekombinasyonu kullanarak canlı organizmalarda hücre füzyon olaylarını izleme yöntemini. Biyolüminesans sinyalleriyle gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar cömertçe H1 MKH, ve Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing Song ve Wisconsin Kardiyovasküler Fizyoloji Üniversitesi Bayan Jill Koch sağlamak için Dr. Peiman Hemmati (Tıp Fakültesi, University of Wisconsin-Madison) teşekkür etmek istiyorum Fare cerrahisine Core Tesisi. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Brian Freeman ve NIH R21 HL089679 Yüksek Lisans Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.

1. Donör Hücre Transfeksiyon <ol><li> Hasat mezenkimal kök hücreler (MKH, lütfen Dr. Peiman Hematti tarafından bağışlanan H1, embriyonik kök hücrelerinden elde edilen alternatif olarak, in vivo olarak sigorta varsayımla herhangi bir türün herhangi bir hücre tipi istihdam edilebilir) 70 -% 80 1X tripsin ile konfluent (Mediatech 5 dakika için Manassas VA) α-MEM tam orta (ücretsiz, antibiyotik Invitrogen, Carlsbad CA) 18 tripsin İnaktivasyon. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle supernatant aspirat ve yeniden askıya pelet 1X PBS 1 mL ve bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı. </li><li> 1.5 mL santrifüj tüpüne transfer 1,5 x 10 6 hücre. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle supernatant aspire. R Buffer (Neon Transfeksiyon Sistemi, Invitrogen) ve 6 mg (2 mcg / 5,0 x 10 5 hücre) 300 mcL yeniden süspanse pelet P231 pCMVe betaAc-STOP-luc (Addgene, Cambridge, MA). E Tampon Yeri 3 mL (Invitrüreticinin protokol başına elektroporasyon yerleştirme port (Neon Transfeksiyon Sistemi, Invitrogen) içine ogen). </li><li> 100 mcL Neon pipetlemeyin ucu hücre plazmid çözüm aktarın ve bir darbe süresi 20 ms ve 1500 volt bir büyüklük ile electroporate. 9.7 mL α-MEM tam orta içeren 15 ml konik bir tüp içine yerleştirin hücreleri electroporated. </li><li> 10 ml toplam hacmi verim 1.5 iki kez ve havuz transfekte hücreler adımı yineleyin. 10 ml tam orta α-MEM içeren bir T175 balona 10 ml hücre süspansiyonu (1.5 x 10 6 hücre) ekleyin. Elektroporasyon sonra hücre canlılığı, T175 başına yaklaşık 4,5 x 10 5 canlı hücreleri verim, yaklaşık% 30&#39;dur . </li><li> Değişim transfeksiyon şu ortamda 24 saat α-MEM tam. </li><li> % 80 konfluent (~ 2 - - 3 gün sonra elektroporasyon) Hasat 70 hücreleri transfekte. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştir ve 1.0 x 10 6 bir konsantrasyon hücreleri tekrar süspansiyonα-MEM tam orta cells/50 mcL. En aza indirmek zaman hücreleri, enjeksiyon için önce hücre ölümü azaltmak için süspansiyon geçirirler. </li></ol> 2. Intramiyokardiyal Enjeksiyon <ol><li> Transgenik fareler üzerinde her hücrede yapısal ifade Cre recombinase (B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J, Jackson Laboratuvarı, Bar Harbor, mühendislik (Phoenix Pharmaceuticals, Inc, St Joseph, MO) izofluran ile anestezinin neden ME). </li><li> Saç kesme makineleri veya kimyasal saç çıkarıcı kullanarak göğüs bölgesinden saç çıkarın. </li><li> - 120 150 mcL bir atım hacmi ile dakikada 130 nefes fare ventilatör 18 gauge kateter (Becton Dickinson &amp; Co, Franklin Göller NJ) ve yeri ile entübe. </li><li> Böylece bir torakotomi üreten dördüncü interkostal alanı boyunca yatay kesi olun. </li><li> Kalp görselleştirme, 1 ml şırınga (Temuro Medical Corporation, Somerset, NJ) ve 28 gauge iğne (Bect kullanarak iki transfekte hücre süspansiyonu 25 mcL enjeksiyonlarıDickinson &amp; Co, Franklin Lakes NJ). Intramiyokardiyal enjeksiyon kolaylığı ve organ aşırı zarar görmesini önlemek için, iğne başı ~ 90 derece bükün. </li><li> Enjeksiyonundan sonra, kaburga ve kas tabakaları kapatmak için emilebilir dikişlerle (örneğin, Vicryl) kullanın. Sütür cilt 4-0 naylon veya ipek kullanılarak kapalı. </li><li> Fare, anestezi ve ekstübe kurtarmak için izin verin. </li><li> Kontrol grupları Cre sadece untransfected hücreleri ve transfekte hücreler (alternatif olarak, Cre fareler sigorta eğilimli transfekte hücreleri) alan vahşi tip fareler aynı konsantrasyonda, Cre fareler orta enjeksiyon uygulanan farelerin içermelidir. </li></ol> 3. Biyofotonik Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme, intraperitoneal (IP) 15 mg / mL D-luciferase (Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) fare vücut ağırlığının gram başına 10 mcL enjekte beş ile on beş dakika önce. </li><li> Izofluran üzerinden fareler üzerinde anestezi indüksiyon için% 4 nedenbakım için d 1 -% 2. </li><li> Yüz maskesi 1 idare ile görüntüleme kutusunda yatar Yeri fareler -% 2 izofluran bakım anestezi (Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi, Hopkinton, MA). Birkaç fareler aynı anda görüntülü olabilir. Işıklı sinyal kolay karşılaştırma için deneysel fare ile Resim sahte kontrol fare. </li><li> Yaşam Görüntü yazılım (Xenogen) kullanarak, uygun pozlama süresi (genellikle 60 sn, bakınız). Farelerin uyum ve duyarlılık değişiklikleri önlemek için, görüntüleme boyunca alanında tutarlı tutmak için görüntü alan ayarlayın. 4.5 cm konu yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Görüş alanı içinde fare ya da fare ile ilgili lüminesans yoğunluğu sinyali Edinme ve değiştirilmemiş görüntü dosyalarını kaydetmek. Süreç görüntüleri bir kontrol ya da unmanipulated fare ile ilgili arka plan sinyali kaldırın. Yoğunluk değerleri yukarıda arka plan hayvan içinde erimiş hücrelere karşılık gelir. Yoğunluk analizi Yaşam Görüntü yazılım (Xenogen) ya da açık kaynak kodlu bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir. Typically, ilgi çeken bir bölge (ROI) hayvanlar ve deneyler arasında yoğunluk verileri karşılaştırmak için seçilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi duyarlılık, yapısal C57/Bl6 fareler (Jackson Laboratory) miyokarda teslim edildi (231-LUC-D3H1, Xenogen) lusiferaz ifade eden bir hücre hattı belirlemek için. Hücreler 1 x konsantrasyonları enjekte edildi 10 6, 1 x 10 3 veya 1 x 10 1 hücre hücre teslim Altı saat sonra, fareler luciferase ile intraperitoneal enjekte Xenogen sistemini kullanarak görüntülü edildi. 1000 hücreleri (2 6 fareler, görüntülü Şekil 2) ile özel bir sinyal tespit, ancak algılama 10,000 hücreleri (görüntülü 6 farelerin 6) ile daha güvenilir olabilir. Daha da önemlisi, bu çalışma aynı zamanda lusiferaz ifade hücreleri ve sinyal yoğunluğu sayısı arasında bir kaba ilişki kurmak için görev yaptı. Kre-ifade farelerin miyokarda teslim edildi. Hücre doğumdan sonra yaklaşık bir hafta, fare ilk kez D-luciferase enjeksiyon olmadan Xenogen sistemi kullanılarak görüntülenmiştir . Enzimatik substrat olmadan, beklenen, hiçbir yoğunluk sinyali (Şekil 3) tespit edildi. Sonra, D-luciferase intraperitoneal ve lusiferaz yoğunluğuna karşılık gelen bir sinyal enjekte edildi ve böylece hücre füzyonu test iki dört farelerde tespit edildi. Bu durumda, çalışma, kalp ve çevresindeki doku değerlendirilmesi için izin sona erdirildi benzer bir sinyal. MSC-çiftli füzyon ürünleri, in vivo olarak korunabilir, en geç bir hafta (Şekil 3) tespit edildi, ancak bir tasavvur olabilir uzun vadeli bir analiz ve bakım, proliferasyon izlemek için daha sık görüntülemeFarelerde füzyon ürünleri d belki de göç. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig1.jpg" /> Şekil 1. In Vivo Hücre Fusion Algılama Tekniği şematik arasında füzyon Cre ifade fare hücreleri ve nakledilen hücrelerin meydana gelen bir floxed lusiferaz plazmid ifade, lusiferaz ifade edilmesi durumunda. Lusiferaz Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi (19 uyarlanmıştır) kullanarak fare fare enzimatik substrat, D-luciferase, enjekte ve daha sonra görüntüleme ile tespit edilebilir <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig2.jpg" /> Şekil 2. Tespiti Hassasiyet lusiferaz ifade biyofotonik görüntüleme ile kalp dokusunda hücreler. Yapısal (231-LUC-D3H1, Xenogen) lusiferaz ifade hücre hattı çeşitli toplam hücre sayıları C57/Bl6 farelerin intramiyokardiyal alana teslim edildi. Farelerin Temsilcisi görüntüleri yeniden1 x 10 6, 1 x 10 3 ve 1 x 10 1 hücreleri (soldan sağa) ceiving gösterilmiştir, görüntüleme enjeksiyon yaklaşık 6 saat sonra yapıldı. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3581/3581fig3.jpg" /> Şekil 3. Hücre Fusion Endikatif Vivo Lüminesans Niceleme. MKH plazmid LoxP-Stop-LoxP-Lusiferaz ve Kre-ifade farelerin miyokarda teslim ile transfekte. Hücre doğumdan sonra yaklaşık bir hafta ve iki hafta, Cre fareler, hücre füzyonu göstergesidir lüminesans yoğunluğunu ölçmek için Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi kullanarak görüntülü. 17 gün hücre doğumdan sonra (A) sham ve fareler 1-4 lüminesans fotoğraf ve yoğunluğu Kaplama (soldan sağa). (B) sham ve fareler 1-4 lüminesans Yoğunluğu (soldan sağa) hücre doğumdan sonra 17 gün. Ilgi bölgeye enjeksiyon yerinde ve yoğunluğu l uygun seçildi (sarı)evels ImageJ (ücretsiz kaynak) yazılımı 20 kullanılarak belirlenmiştir. (C) lüminesans yoğunluğu tüm deneysel koşullar altında, aynı bölgede sahte fare faiz normalize edildi. Bir hafta, 3 ve 4 fareler, bir fare hücre ve nakledilen MSC spontan füzyon düşündüren pozitif lüminesans sinyal gösterdi. Fare 3 sinyali iki hafta devam etti. Fare 3 karşılık gelen sinyal organ belirli bir yeri belirlemek için, göğüs boşluğu maruz kalan ve birincil organları eksize görüntülendi. (D), fotoğraf ve fare 3 lüminesans yoğunluğu Yerleşimi. Not yerelleştirme ince bağırsakta yoğunluğu sinyali. (E) Yoğunluk fare 3 lüminesans. (F), fotoğraf ve sahte fare lüminesans yoğunluğu Yerleşimi. (G) Yoğunluk sahte fare lüminesans.

<ol><li>Bernirschke, K. K. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBernirschke%2C+KKP+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , Springer. New York. (2000).</li>
<li>Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+localization+of+chorionic+gonadotropin+alpha+and+placental+lactogen+mRNAs+during+development+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta.</a> J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).</li>
<li>Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+deportation+in+human+pregnancy--its+relevance+for+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Trophoblast deportation in human pregnancy--its relevance for pre-eclampsia.</a> Placenta. 20, 531-539 (1999).</li>
<li>Redman, C. W., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+debris%2C+oxidative+stress+and+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, 597-602 (2000).</li>
<li>Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+fusion+of+cells+between+species+yields+transdifferentiation+and+retroviral+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo.</a> FASEB. J. 18, 548-550 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+hematopoietic+cells+generate+cardiomyocytes+at+a+low+frequency+through+cell+fusion%2C+but+not+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation.</a> Nat. Med. 10, 494-501 (2004).</li>
<li>Nygren, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+and+lymphoid+contribution+to+non-haematopoietic+lineages+through+irradiation-induced+heterotypic+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion.</a> Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).</li>
<li>Kutschka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+human+BCL-2+transgene+expression+attenuates+early+donor+cell+death+after+cardiomyoblast+transplantation+into+ischemic+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts.</a> Circulation. 114, I174-I180 (2006).</li>
<li>Min, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+cord+blood+derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+into+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium.</a> Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).</li>
<li>Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characterization+and+hormonal+regulation+of+kidney+androgen-regulated+protein+%28Kap%29-luciferase+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice.</a> Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).</li>
<li>Weir, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophotonic+imaging+in+HO-1.luc+transgenic+mice%3A+real-time+demonstration+of+gender-specific+chloroform+induced+renal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity.</a> Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).</li>
<li>Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O'Callaghan, D., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+bioluminescent+Brucella+melitensis+mutants+GR019+%28virB4%29%2C+GR024+%28galE%29%2C+and+GR026+%28BMEI1090-BMEI1091%29+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice.</a> Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+monitoring+of+catheter-associated+urinary+tract+infections+and+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice.</a> Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).</li>
<li>Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+monitoring+in+real+time+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+gene+expression+under+relaxin-induced+conditions+in+a+novel+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).</li>
<li>Noiseux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+overexpressing+Akt+dramatically+repair+infarcted+myocardium+and+improve+cardiac+function+despite+infrequent+cellular+fusion+or+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation.</a> Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).</li>
<li>Ajiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+transplantation+in+rats%3A+fusion+of+donor+muscle+to+the+recipient+site%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site.</a> Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).</li>
<li>Trivedi, P., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+immunological+characterization+of+mesenchymal+stromal+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells.</a> Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).</li>
<li>Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+cell+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological implications of cell fusion.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem küçük hayvanlar da dahil olmak üzere, canlılar, ilk kez izin verir hücre füzyonu ayrık tanımlama ve temporal analiz tarif. Bu yaklaşım daha sonraki biyofotonik görüntü analizi ile Cre-LoxP rekombinasyon birleştirir. Sadece hücre-hücre füzyonu izlemeye müsait bir yaklaşım, aynı zamanda virüs hücre füzyonu ve benzeri viral enfeksiyonlar izlemek için faydalı olabilir. Görüntü analizi hızlı ve görüntü aynı anda birden fazla küçük hayvanlar için mümkündür. Füzyon tespiti, bunlara karşılık gelen mikroçevrele...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Neon Transfeksiyon Sistemi </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> MPK5000 </td><td></td></tr><tr><td> Neon 100 mcL Kiti </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> MPK10025 </td><td> R ve E Tampon içerir. </td></tr><tr><td> a-MEM toz </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> Hyclone, Logan, UT </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> B6.C-Tg (CMV-CRE) 1Cgn / J </td><td> Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME </td><td> 006054 </td><td></td></tr><tr><td> 10X tripsin </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td&gt; <td> MT-25-054-Cl </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferase </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA </td><td> 122796 </td><td></td></tr><tr><td> Xenogen biyofotonik Görüntüleme Sistemi </td><td> Kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA </td><td> IVIS Spektrum </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Biocarbonate </td><td> Sigma Aldrich, St Louis, MO </td><td> S6014-500G </td><td></td></tr><tr><td> Sigara esansiyel amino asitler </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr></tbody></table>

hücre fusion tespit cre-etox p rekombinasyon yaklaşım in vivo</em

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

Sigorta için aynı tipte iki veya daha fazla hücre yeteneği, iskelet, kas, kemik ve plasenta da dahil olmak üzere pek çok kompleks organ, form, evrim boyunca metazoans kullanılmıştır. Çağdaş çalışmalar aynı tip hücrelerin füzyonu gelişmiş fonksiyonu bahşeder göstermektedir. Örneğin, plasenta sigorta trofoblast hücreleri syncytiotrophoblast formu ne zaman, syncytiotrophoblast daha iyi bir halkaya yapışmamış trofoblast 1-4 daha maternal-fetal bariyer boyunca besin ve hormonlar taşımak mümkün. Daha yeni çalışmalarda farklı tipte hücrelerin füzyonu, hücre kaderini doğrudan göstermektedir. Füzyon &quot;reversion&quot; veya hücre kaderinin değiştirilmesi kez hücre kültürü sistemleri ile sınırlı olduğu düşünülüyordu. Ama kök hücre nakli gelişi bize keşfine yol açtı ve, kök hücre in vivo somatik hücre ile sigorta ve kök hücre farklılaşması füzyon 5-7 kolaylaştırır . Böylece, hücre füzyonu düzenlenmiş bir süreç cböylece, hücre yaşamını ve farklılaşmasını teşvik apable ve gelişme, doku onarımı ve hatta hastalığın patogenezinde için merkezi bir önemi olabilir. Uygun teknoloji eksikliği) 1, hücre füzyon çalışma sınırlandırılması doğru zaman içinde) izlemek füzyon ürünleri füzyon ürünleri belirlemek ve 2. Burada füzyon üzerine biyoparlaklık indüksiyon (Şekil 1) ile iki kısıtlamalarını ortadan kaldırmak için yeni bir yaklaşım mevcut. Biyoparlaklık in vivo 8-15 yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir bir yapı ateşböceği lusiferaz kodlama kullanır (Photinus pyralis) gen bitişik yerleştirilen bir stop kodon LoxP dizileri ile çevrili. Cre recombinase protein ifade hücreleri ile bu gen sigorta ifade hücreleri LoxP siteleri bölünmüş ve stop sinyali lusiferaz transkripsiyonunu izin eksize edilir. sinyali induci olduğundanble, yanlış pozitif sinyallerin sıklığı çok düşüktür. Cre / LoxP sistemi 16, 17 kullanan mevcut yöntemlerden farklı olarak, bir &quot;canlı&quot; bir saptama sinyali dahil ve böylece ilk defa hücre füzyon kinetiği, in vivo olarak takip etme olanağı göze. Yaklaşım göstermek için, yayg Cre recombinase ifade fareler, bir floxed stop kodon lusiferaz downstream ifade etmek için bir yapı ile transfekte kök hücre alıcıları olarak görev yaptı. Kök hücreler intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla nakledilen ve nakli intravital varlığını izlemek için görüntü analizi yapıldı zaman içinde kalp ve çevresindeki dokularda füzyon ürünleri. Bu yaklaşım, geliştirme, hastalık veya yetişkin doku onarımı herhangi bir aşamasında, herhangi bir doku tipi hücre füzyon analiz adapte olabilir.

, Zaman içinde canlı organizmaların hücre füzyon izlemek için bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşım kullanır Cre<em&gt; LoxP</em&gt; Rekombinasyon hücre füzyonu üzerine lusiferaz ifade ikna etmek için. Periferik dokularda ~ 1.000 hücrelerinin algılama duyarlılığı ile biyofotonik görüntüleme sistemleri kullanılarak canlı organizmalarda üretilir Işıklı sinyal tespit edilebilir.

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo</em

Aynı tipteki iki veya daha fazla hücrenin kaynaşma yeteneği, evrim boyunca metazoalarda, ... dahil olmak üzere birçok karmaşık organı oluşturmak için kullanılmıştır.

Bu prosedürün genel amacı, in vivo ortamda hücre-hücre füzyonu olaylarını belirlemek ve takip etmektir. Bu işlem, öncelikle donör hücrelere floxlanmış bir lusiferaz geni transfekte edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, transfekte edilen hücrelerin, Cre rekombinazı konstitütif olarak eksprese edecek şekilde genetik olarak modifiye edilmiş bir farenin dokularına nakledilmesidir.Üçüncü adım, hücre hücre füzyon olaylarına karşılık gelen lüminesansın alıcı farelerin dokularında görüntülenmesidir. Bunu, deney koşullarına göre sinyal yoğunluklarının analizi takip eder. Sonuç olarak, hücre füzyonu ile ilişkili indüklenebilir lüminesansın tespiti yoluyla, canlı farelerde hücre hücre füzyon ürünlerinin lokalizasyonu ve trafiği gösterilebilir.Bu yöntem; hücre füzyonunun kök hücre programlamasını kolaylaştırıp kolaylaştırmadığı veya kanser metastazının hücre füzyonuna dayanıp dayanmadığı gibi gelişim, kök hücre biyolojisi ve kanser biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü; laboratuvarımızdaki öğrenciler Anthony Springers, Nicholas Co ve Brian Freeman ile tıp bölümünden yardımcı bilim insanı Gal Queen Song gösterecektir. Hücreler %70 ila %80 konfluans seviyesine ulaştığında, in vivo füzyon için hücreleri tripsinizle işlemeye başlayın. Bu çalışmada mezenkimal kök hücreler kullanılmıştır; tripsini, antibiyotiksiz alpha-MEM komple medyum ile inaktive edin ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 1 mL 1X PBS içinde resüspande edin. Hemositometre kullanarak hücreler sayıldıktan sonra, 1,5 milyon hücreyi bir santrifüj tüpüne aktarın ve bu hücreleri peletleyin.Süpernatant dikkatlice aspire edildikten sonra, üretici protokolünü takip ederek peleti, altı mikrogram plazmid içeren 300 µL R tamponunda resüspande edin. Elektroporasyon bağlantı portuna üç mililitre EBU yerleştirin.Ardından, hücre plazmit çözeltisinin 100 µL'sini bir neon pipet ucuna aktarın. Pipet ucunu elektroporasyon cihazına yerleştirin ve hücrelere elektroporasyon uygulayın.Şimdi bu hücreleri, 9,7 ml alfa MEM komple medyum içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Toplamda 300 µl elektropore edilmiş hücre elde etmek için elektroporasyon işlemini iki kez tekrarlayın ve tüm hücreleri alfa MEM komple medyumda birleştirin. Ardından hücreleri, 10 ml daha alfa MEM Komple içeren bir T 175 flaskına ekleyin.Transfeksiyondan 24 saat sonra besiyerini değiştirin; elektroporasyon sonrası hücre sağkalımı yaklaşık %30'dur ve bu da flask başına yaklaşık yarım milyon canlı hücre sağlar. İki veya üç gün sonra, hücreler %70 ila %80 konfluans düzeyine ulaşacaktır. Ardından, enjeksiyondan hemen önce hücreleri aktarın ve sayın Resus.Hücreleri, 50 microliter ortam başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda alfa MEM complete içerisinde süspanse edin ve hücre ölümünü minimize etmek için mümkün olan en kısa sürede enjekte edin. Bu prosedür, işleme geçmeden önce bir fare isoflurane kullanılarak anesteziye alındıktan sonra, Cre rekombinazı her yerde eksprese edecek şekilde mühendisliği yapılmış farelerin kullanımını içerir. Bir ağrı testi kullanarak farenin cerrahi anestezi düzeyinde olduğundan emin olun.Şimdi, saç kesme makinesi veya kimyasal tüy dökücü kullanarak göğüs bölgesindeki tüyleri temizleyin. Ardından, fareye 18 gauge kateter ile entübe ederek, onu bir fare ventilatörüne ve ısıtma pedine yerleştirerek cerrahiye hazırlayın. Şimdi, dördüncü interkostal boşluk boyunca lateral bir insizyon ile torakotomi gerçekleştirin.Kalbin net bir şekilde görülebileceği bir bakış açısı sağlayın. Bir mililitrelik şırıngaya takılı 28 gauge iğnenin ucunu yaklaşık 90 derece olacak şekilde bükün. Şırıngaya, tüm hücre hacminin iğneden dışarı atılabilmesi için bir miktar ek hava da dahil olacak şekilde, hazırlanan hücrelerden 50 µL yükleyin.Şimdi, transfekte edilmiş hücre süspansiyonundan 25 µL'lik 2 intramyokardiyal enjeksiyonu sol ventrikülün ön boşluğuna yapın. Hücre enjeksiyonunun doku içinde olduğundan emin olmak önemlidir. Bu durum, enjeksiyon yapılırken doku dallanmasının gözlemlenmesiyle doğrulanabilir. Enjeksiyonların ardından.Kaburgaları ve kas tabakalarını kapatmak için Vicryl sütürler gibi emilebilir sütürler kullanın. Cildi dört sıfır naylon veya ipek kullanarak kapatarak cerrahi işlemi tamamlayın. Cerrahi operasyonu ve enjeksiyonu gerçekleştirirken hızlı hareket edin, çünkü başarı bu prosedürün kısa sürmesine bağlıdır.Şimdi farenin ısıtma plakası üzerinde anesteziden ayılmasını bekleyin ve fare öksürdüğünde veya refleks aktivitesi sergilediğinde entübasyon tüpünü çıkarın. Kontroller için, krem buzla transfekte hücre içermeyen alpha MEM besiyeri enjekte edilmeli ve yabanıl tip farelere transfekte hücreler enjekte edilmelidir. Görüntüleme yapılacak fareleri %4 isof fluorine kullanarak anesteziye alın.Fareleri intraperitonyal D Lucifer enjeksiyonu ile hazırlayın. Anestezi uygulanmış ve lusiferaz yüklenmiş her fareyi sırtüstü pozisyona getirin. Görüntüleme kutusunda, sham enjeksiyon kontrol faresi de dahil olmak üzere birkaç fare aynı anda görüntülenebilir.Bir gaz maskesi kullanarak, anesteziyi %1 ila 2 isoflurane ile sürdürün. Görüntüleme kutusunu mikroskobun altına yerleştirin ve görüntüleme işlemleri için ticari olarak mevcut bir yazılım paketini açın. Uygun pozlama süresini ayarlayarak yazılımı hazırlayın.Ardından, bir fare üzerinde görüntülenecek alanın şeklini belirleyin ve aynı görüntüleme şeklini görüntülenecek diğer tüm fareler için kullanın. Daha sonra, denek yüksekliğini 4,5 santimetre olarak ayarlayın. Görüş alanı içindeki fare veya farelere karşılık gelen bir lüminesans yoğunluk sinyali elde edin.Ardından değiştirilmemiş görüntü dosyasını kaydedin. Görüntüleri, kontrol faresinin arka plan lüminesansına karşılık gelen yoğunluk değerlerini çıkararak, hayvan içindeki füzyon hücrelerine karşılık gelen arka plan sinyalini gidermek için işleyin. Görüntü sonrası işlem için ImageJ açık kaynaklı yazılımının kolayca uyarlanabilir ve güvenilir olduğunu tespit ettik.Bu analizi gerçekleştirmek için, Xeno gen yazılımından elde edilen görüntülerin T dosyaları olarak dışa aktarılması kritik öneme sahiptir. Yoğunluk analizi, ticari olarak mevcut veya açık kaynaklı görüntü analiz yazılımları kullanılarak yapılabilir. Görüntüleme sisteminin hassasiyetini belirlemek amacıyla, genellikle hayvanlar ve deneyler arasındaki yoğunluk verilerini karşılaştırmak için bir ilgi bölgesi seçilir.Lusiferazı konstitütif olarak eksprese eden bir hücre hattı, farklı konsantrasyonlarda C 57 black six farelerin miyokardına enjekte edildi. Altı saat sonra, fareler lüminesans sinyali için görüntülendi. 1000 hücre enjekte edilen altı fareden ikisinde ve 10.000 hücre enjekte edilen altı hayvanın tamamında sinyal tespit edildi.Bu videoyu izledikten sonra, indüklenebilir lüminesans tespiti aracılığıyla in vivo hücre-hücre füzyon ürünlerinin nasıl tanımlanacağı ve izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-cre-lox-p-recombination-approach-for-detection-cell-fusion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video hücrelerin verimli elektrofüzyon...

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Protein-protein etkileşimleri, bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) birleştirilerek nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip hücrelerde görselleştirilir. Burada açıklanan, bireysel Ras-Raf komplekslerinin nano ölçekli kümelenmesini ve difüzyonunu görselleştirmek için U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntülemek için BiFC-PALM'in kullanılmasıdır.

Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Bu protokolün amacı, melez hücreler oluşturmak için iki farklı hücre türünü birleştirmektir. Erimiş hücrelerin floresan mikroskobu analizi hücresel organellerin menşe hücresini izlemek için kullanılır. Bu tetki, hücre yapısı nın ve fonksiyonun hücre füzyonu ile tedirginlik lere nasıl tepki verdiğinin araştırılması için kullanılabilir.

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Bu protokol, C. elegans germline yerinde protein-protein etkileşimleri için prob yakınlık ligasyon test kullanımını göstermektedir.

Yakınlık Ligasyon Tayini kullanılarak C. elegans Germline Ribonükleoprotein Kompleksi Montaj Yerinde Algılama

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Öğrenin Cre-LoxP rekombinasyonu kullanarak canlı organizmalarda hücre füzyon olaylarını izleme yöntemini. Biyolüminesans sinyalleriyle gerçek zamanlı görüntüleme sağlar.

Hücre Fusion Tespit Cre-ETOX P Rekombinasyon Yaklaşım In Vivo

Daha fazla video keşfet