Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif ^{13 C-etiketleme}

Bu protokolün amacı, karbon 13 destekli metabolizma analizi kullanarak bakteriyel metabolizmayı incelemektir. Başlangıç olarak, mikroplar, mikrobiyal proteinlere dahil edilen işaretli karbon substratlarının varlığında büyütülür. Ardından mikroplar hasat edilir ve amino asitler ekstre edilir, hidrolize edilir ve türevlendirilir.

Numuneler, bir gaz kromatografı ve kütle spektrometresine veya GCMS'e uygulanır. Biyokimyasal ağdaki metabolitler arasındaki atom geçiş yolları izlenerek, mikrobun kullandığı fonksiyonel metabolik yollar belirlenebilir. Ben Bert Burla.

Burada sunduğumuz yöntem, mikroblardaki metabolik yolları belirlemek için transkriptomik ve proteomiğe tamamlayıcı olarak kullanılabilir. Bu tekniği, siyanobakteriler gibi fotosentetik mikropların miyotrofik veya heterotrofik karbon kullanımını incelemek için kullandık. Bu videoda, yeni enzimatik işlevleri keşfetmek amacıyla işaretli karbon substratlarının kullanımını göstermek için model suş olarak ANOTHE 5 1 1 42'yi kullanacağız.

Prosedürü ben, li Yu ve Chu Yang Fang uygulamalı olarak göstereceğiz. Bu prosedüre, cyana thesei bakterilerini etiketsiz bir besiyerinde büyüterek başlayın. Bakteriler logaritmik büyüme fazının ortasına ulaştığında, hacimce %3 oranında karbon 13 işaretli besiyerine inoküle edin.

Ardından, başlangıç inokülüm alt kültüründen gelen markalanmamış karbonun, orta logaritmik büyüme fazındaki aynı markalı ortama karışmasını önlemek gerekir. Karbon 13 markalı Cy Thesei bakterileri orta logaritmik büyüme fazına ulaştığında, santrifüj ile 10 mililitre hasat edin. Peleti 1,5 mililitre altı molar hidroklorik asit içinde yeniden süspande edin ve şeffaf cam vidalı kapaklı bir gaz kromatografisi veya GC vialine aktarın.

Biyokütle proteinlerini amino asitlere hidroliz etmek için flakonların kapaklarını kapatın ve 100 °C sıcaklığındaki fırında 24 saat bekletin. Biyokütle peletlerinin hidrolizi, yaygın 20 amino asidin 16'sını verir. Hidrolizden sonra, amino asit çözeltisini 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve ardından katı partikülleri çöktürmek için 20,000 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra, hidroliz çözeltisindeki katı partiküllerin GC kolonuna girmesini önlemek için süpernatantları yeni GC viallerine aktarın. Ardından, gaz kromatografisi ile ayrılabilmeleri için uçucu hale getirmek amacıyla amino asitleri kurutun. Kurutulmuş örnekleri 150 µL tetrahidrofuran (THF) ve 150 µL N-metil-N-trifloroasetil-N'-metil-N'-bis(trimetilsilil)trifloroasetamid (BSTFA) ile çözün.

Acetamide, T-B-D-M-S türevlendirme reaktifi ile tüm örnekleri 65 ve 80 °C arasındaki bir sıcaklıkta bir saat boyunca inkübe edin. Flakondaki metabolitlerin çözündüğünden emin olmak için örnekleri ara ara vorteksleyin. Örnekleri 20,000 ×g hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatanı yeni GC flakonlarına aktarın.

Süpernatan berrak, sarımsı bir çözelti olmalıdır. GC sıcaklıkları şu şekildedir: iki dakika boyunca 150 °C'de tutun. Dakikada 3 °C artışla 280 °C'ye kadar yükseltin.

Sıcaklığı dakikada 20 °C artırarak 300 °C'ye çıkarın ve ardından beş dakika boyunca sabit tutun. Daha sonra, 30 m'lik bir GC kolonu için solvent gecikmesini yaklaşık beş dakikaya ve kütle/yük oranı aralığını 60 ile 500 arasına ayarlayın. Numuneleri, GCMS ile, bir ila beş veya bir ila 10 split oranıyla 1 µL enjeksiyon hacmi ve 1,2 mL/dk helyum taşıyıcı gaz kullanarak, çalışma programını takiben analiz edin.

GCMS verilerini Microsoft Excel kullanarak analiz edin. Her bir amino asit için GC tutulum süresi ve kendine özgü kütle/yük oranı pikleri bu şekilde gösterilmiştir.T-B-D-M-S. Türevlendirilmiş amino asitler genellikle MS tarafından iki yüklü fragmana net bir şekilde ayrılır; amino asidin tamamını içeren M eksi 57 fragmanı ve lösin ile izölösin için amino asidin alfa karboksil grubundan yoksun olan M eksi 1 59 fragmanı.

M minus 57 pikinin üzerine diğer kütle pikleri fragmanları bindi. Tüm amino asit etiketlemesini analiz etmek için N minus 15 kullanılabilir. Ayrıca, çoğu amino asitte genellikle F 3 0 2 grubu tespit edilir ve bu grup, amino asit iskeletindeki yalnızca ilk alfa karboksil grubunu ve ikinci karbonları içerir.

Bununla birlikte, bu Ms.Peak genellikle yüksek gürültü-sinyal oranlarına sahip olduğu için, metabolik akıların nicel analizi için F 3 0 2 önerilmez. Amino asitlerin veya merkezi metabolitlerin türevlendirilmesi, karbon 13, oksijen 18, silikon 29 ve silikon 30 dahil olmak üzere önemli miktarlarda doğal olarak etiketlenmiş izotoplar getirir. Ham kütle izotopu veya spektrumundaki doğal izotoplardan kaynaklanan ölçüm gürültüsü, yayınlanmış yazılımlar kullanılarak düzeltilebilir.

Nihai izotopik etiketleme verileri kütle fraksiyonları olarak rapor edilmiştir. Örneğin; sıfır ila dört karbon 13 etiketli karbon içeren fragmanları temsil eden M sıfır, M1, M iki, M üç ve M dört. Bu 5 1 1 2, tipik isle sentez yolunda treoninle treoninle 2-ketobutirat dönüşümünü katalize eden enzim treonin amonyak liyazı içermez.

Bu nedenle, bu organizmadaki isle yolağını çözmek için cyana THESEI 5 1 1 42, 54 milimolar gliserol içeren ASP two ortamında büyütülmüş ve burada gösterildiği üzere bu videoda açıklanan şekilde GCMS ile analiz edilmiştir. Cyana Thesei 5 1 1 4 2, ana karbon kaynağı olarak ikinci konumdan işaretli gliserolü kullanmaktadır; öncülü piruvat olan treonin ve alaninin bir işaretli karbona sahip olduğunu, izolösinin ise üç karbonla işaretlendiğini gözlemledik. Dolayısıyla, cyana these 5 1 1 4 2'de sentez, çoğu organizma tarafından kullanılan treonin yolundan türetilemez. Öte yandan, lösin ve izolösin, M eksi 15 fragmanı ve M eksi 1 59 fragmanına dayanarak özdeş işaretleme modellerine sahiptir.

Örneğin, PARÇALANMAMIŞ amino asitler içeren N-15 izotopu veya verileri, lösin ve izolösin için özdeş işaretleme göstermiştir. Bu nedenle lösin ve izolösin, aynı öncüllerden, yani piruvat ve asetil-CoA'dan sentezlenmiş olmalıdır. Bu gözlem, izölösin sentezi için sitramalat yolundaki işaretli karbon geçişiyle tutarlıdır.

Bu yöntem, çok çeşitli mikropların metabolizmasını incelemek için kullanılabilir ve yöntemde yetkinlik kazanıldıktan sonra, başlangıçtan bitişe kadar yaklaşık bir hafta içinde tamamlanabilir.