Name: Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13 C-etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Öğrenin bakteri metabolizmasını karbon-13 izotop etiketleme ve GC-MS kullanarak analiz etme yöntemini. Bu teknik mikrobiyal protein sentezi ve metabolik yol haritalarının keşfi için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, bir NSF Kariyer Grant (MCB0954016) ve DOE Biyoenerji Araştırma Bursu (DEFG0208ER64694) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü (Şekil 1) <ol><li> Iz elementler, tuzlar, vitaminler ve yolağı soruşturma için en iyi olan, özellikle etiketli karbon substratları ile en az orta hücreleri büyütün. Hücre kültürü için sallayarak matara veya biyoreaktörler ya kullanın. Organik besinler, maya özü gibi, amino asit etiketleme ölçümü ile engel olabilir ve bu nedenle kültür ortamı mevcut olamaz. </li><li> UV / VIS spektrofotometre ile optimal bir dalga boyu (örneğin, Cyanothece 51.142 OD 730) kültür optik yoğunluk hücre büyümesini izleyin . </li><li> Hücreler ilk etiketli olmayan bir ortamda yetiştirilebilir. Orta-log büyüme aşamasında hücreleri etiketli orta aşılama (hacim aşılama oranı% 3 (v / v)) için kullanılacak tercih edilir. Etiketli ilk inokulum olmayan etiketli karbon giriş önlemek için etiketli aynı ortamda kültür (% 3 v / v aşılama oranı) alt kültür olmalıdır. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Amino asit ekstraksiyon <ol><li> Santrifüj (10 dakika, 8000 × g) ile orta-log büyüme aşamasında Hasat alt-kültür hücreleri (10 ml). </li><li> 6M HCl 1.5mL içinde pelletini tekrar ve net bir cam, vida-üst GC flakon aktarmak. Şişeleri Cap ve biyokütle proteinler amino asitlere hidroliz 24 saat boyunca 100 ° C fırında koyun. Biyokütle pelet Hidroliz 20 ortak amino asitler (Şekil 2) 5 16 verim alınabilir. Sistein ve triptofan bozulmuş, glutamin ve asparajin sırasıyla, glutamat ve aspartat dönüştürülür. </li><li> 2 ml Eppendorf tüpler kullanılarak 5 dakika 20.000 amino asit çözeltisi × g Santrifüj, ve yeni bir GC şişeleri süpernatantlar aktarmak. Bu adım, hidroliz çözüm katı partikülleri. </li><li> GC flakon kapaklarını çıkarın ve örnekleri Thermo Scientific Reacti Vap evaporatör (not kullanarak hava akımı altında tamamen kuru bir dondurarak kurutma makinesi de kullanılabilir.o kuru örnekler). Bu adım, bir gecede yapılabilir. </li></ol> 3. Amino asit türevlendirme ve GC-MS koşulları GC ile amino asitler ya da yüksek ücret / polar metabolitler analizi, bu metabolitlerin amino asitler, uçucu ve gaz kromatografisi 2 ile ayrılabilir, böylece derivatized olmasını gerektirir. <ol><li> 150 mcL tetrahidrofuran (THF) ve N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide türevlendirme reaktifi 150 mcL ile kurutulmuş örnekleri çözülür. </li><li> Tüm örnekler, 65 ve 80 ° C &#39;de 1 saat süreyle arasında bir fırın veya bir su banyosunda inkübe edin. Flakonda metabolitleri çözülür emin olmak için ara sıra karıştırın. </li><li> 10 dakika 20.000 × g örnekleri santrifüj, ve ardından yeni bir GC şişeleri supernatant aktarmak. Süpernatant berrak ve sarımsı bir çözüm olmalıdır. Dedektörleri doygunluk nedeniyle, GC-MS ölçüm hassasiyeti yüksek conce etkilenebilirntration enjekte TBDMS derivatized amino asitler (bu örnekler çoğu zaman koyu kahverengi renk gösterir), bu nedenle, biz bu örneklerin, GC-MS ölçüm 6 önce THF kullanılarak seyreltik olmalıdır . </li><li> GC-MS (1:05 ​​ya da 1:10 split oranı, enjeksiyon hacmi = 1 mcL, taşıyıcı gaz helyum = 1.2 ml / dak). Numunelerin analiz Aşağıdaki GC sıcaklık programı kullanın: tutun 150 ° C, 2 dakika boyunca 3 artış ° C dakikada 280 ° C, 20 artış ° C dakikada 300 ° C ve daha sonra 5 dakika boyunca tutun. Solvent gecikme ~ 5 dakika (30 metre GC sütun için) olarak ayarlanabilir. MS oranı (m / z) şarj etmek için kitle aralığı 60 ve 500 arasında ayarlanabilir. </li></ol> 4. GC-MS veri analizi <ol><li> GC ayrılık izotop ayrımcılıktan TBDMS derivatized amino asit ölçümü de etkilenebilir. Işık izotoplar GC sütunundaki izotoplar kabarması daha hızlı hafifçe hareket. Potansiyel ölçüm önyargı azaltmak için, biz bütün tayf ortalamaamino asit pik 6 </li><li> TBDMS derivatized metabolitleri GC ve MS spektrumları 7 önce bildirilmiştir. Her amino asit için GC saklama süresi ve eşsiz m / z doruklarına Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Amino asitler ya da merkez metabolitleri Türevlendirme 13 C (1.13%) de dahil olmak üzere önemli miktarda doğal etiketli izotoplar, 18 O (% 0,20), 29 Si (4.70%), ve 30 Si (3.09% ) tanıtır. Ham kitle isotopomer spektrumda doğal izotopları ölçüm gürültü yayınlanan yazılım 5, 8 kullanarak düzeltilebilir. Son izotopik etiketleme verileri kitle kesirler, örneğin, M 0, M 1, M 2, M 3 ve M 4 olarak bildirilmiştir (sıfır ile dört 13 C etiketli karbonlar içeren parçaları temsil eder). </li><li> 2-oxo-glutar: amino asit ölçümü sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında izotopik etiketleme bilgi sağlayabilir3-P-glycerate, asetil-KoA, erythrose-4-P, oksaloasetat, fosfoenolpiruvat, piruvat ve riboz-5-P, yedik. Bu metabolitlerin etiketleme desen birçok merkez metabolik yollar (Şekil 2) 9 tanımlamak için kullanılır. Etiketleme deneyler sonucu diğer biyokimya yöntemlerini kullanarak (örneğin, RT-PCR) teyit edilebilir. </li></ol> 5. Etiketli amino asit verileri kullanarak Pathway analizi Iyi tasarlanmış 13 C tracer deneyler sadece bir kaç temel amino asitler araştıran, tüm merkezi metabolizma gelişmiş 13 C-metabolik akı analizi yapılmadan birçok benzersiz yollar veya enzim faaliyetlerini ortaya çıkarabilir. <ol><li> Entner-Doudoroff yolu: [1 - 13 C] glukoz karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, serin etiketleme, alanin 10 etiketleme anlamlı olarak daha düşük olacaktır . </li><li> Dallı TCA döngüsü: [1 - 13 C]pirüvat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. TCA döngüsü kırık ise sadece bir karbon 11, 12 glutamat ile etiketlenmiş ise, aspartat iki karbonlar etiketli olabilir. </li><li> Mixotrophic metabolizmasında Calvin-Benson-Bassham döngüsü ile CO 2 fiksasyonu: CO 2 Sigara etiketli ve karbon substratlar etiketli karbon kaynağı olarak kullanılır. Calvin döngüsü fonksiyonel ise, serin ve histidin etiketleme diğer amino asitler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde, seyreltilmiş olacaktır. Bu yöntem orta 13 organik karbon kaynakları mevcut olduğunda göreli CO 2 fiksasyonu belirleyebilirsiniz. </li><li> Oksidatif pentoz fosfat: [1 - 13 C] glikoz, karbon kaynağı olarak kullanılabilir . Yolun etkinse, etiketli alanin&gt; 50% 12 olacaktır. </li><li> Anaplerotic yolağı (örneğin, KEP + CO 2 à oksaloasetat): 13 CO 2 ve olmayan etiketli karbon yüzeylerde (örneğin, gliserin veya piruvate) karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, aspartat etiketleme, 13 serin alanin ve karşılaştırarak önemli ölçüde zenginleştirilmiş olacak. </li><li> Re-sitrat sentaz: [1 - 13 C] pirüvat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Enzim aktif ise β-karboksil grubu 3, 4, glutamat etiketlenmiştir. </li><li> Citramalate yolu: [1 - 13 C] piruvat, [2 - 13 C] gliserol, ya da [1 - 13 C] asetat, karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, lösin ve izolösin etiketleme tutarları 14 aynıdır. </li><li> Serine isocitrate liaz döngüsü: [1 - 13 C] pirüvat veya [1 - 13 C] laktat karbon kaynağı olarak kullanılabilir. Yolun etkinse, serin üçüncü konuma karbon 15 etiketli olacaktır. </li><li> Besin kullanımı (örneğin, eksojen amino asitler): tam etiketli karbon yüzeyleri ve etiketli olmayan amino asitler ile bir kültür ortamıkullanılabilir. Hücrelerin bu takviye etiketli olmayan besinleri seçerek kullanır, biz biyokütle bu amino asitlerin önemli bir etiketleme seyreltme göreceksiniz. Bu yöntem, hangi besin takviyeleri 16 hücre tarafından tercih edilmektedir araştırmak için kullanılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Son biyoenerji çalışmaları, biyoenerji üretimi için yeni fototrofik mikroorganizmalar kullanılarak ilgi yeniden canlandı ve 2 yakalama CO . Geçmiş yıllarda, biyokimyasal bilgi merkezi metabolik yollar iyi değil, çünkü oldukça gelişmiş 13C-Metabolik Akı Analizler (13C-MFA) dahil olmak üzere birkaç 13C-metabolizma analizleri, merkezi metabolizmaları fototrofik bakteri araştırmak için uygulanan edilmiştir olmayan bu model organizmaların 10, 11, 17-20. Burada, biz, Cyanothece, alternatif bir izolösin yolun keşif 51.142 21 bir örnek sunuyoruz . Camgöbeğiothece 51.142 tipik izolösin sentez yolu 2-ketobutyrate treonin dönüşüm katalize enzimi (EC 4.3.1.19, treonin amonyak liaz) içermez. Izolösin yol gidermek için, 54 mM gliserol (2-13C,&gt;% 98) Cyanothece 51.142 ASP2 orta 22 (20 ml) büyür. Cyanothece 51.142 ana karbon kaynağı olarak etiketlenmiş gliserol 2. konumunu kullanır. Izolösin üç karbonlar ile etiketlenmiş ise treonin ve alanin bir karbon etiketli olduğunu gözlemliyoruz. Bu nedenle, çoğu organizmalar (Şekil 4) tarafından istihdam treonin güzergahtan Cyanothece 51.142 sentezi elde edilebilir. Öte yandan, lösin ve izolösin, belgeye dayanan aynı etiketleme kalıpları (M-15) ve parça (M-159) . Örneğin, M-15 isotopomer veri [] + (parçalanmamış amino asitleri içeren), lösin için aynı etiketleme (M0 = 0.01 = 0.21 M1 = 0.03, M2, M3 = 0.69) Ve izolösin (M0 = 0.01, M1 = 0.03, M2 = 0.24, M3 = 0,67). Böylece lösin ve izolösin aynı öncüleri (yani, piruvat ve asetil-CoA) sentezlenen olmalıdır. Bu gözlem, izolösin sentezi için citramalate yol etiketli karbon geçiş ile tutarlıdır. Bu yolun onaylamak için, Joint Genom Enstitüsü veritabanında arama ve Cyanothece citramalate sentaz Cima (cce_0248) varlığı bulmak. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: 13 C-destekli yolak analizi adımları . <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 metabolik öncüleri etiketleme desen elde etmek için kullanılan Amino asitler. ACoA, asetil-CoA; AKG, α-Ketoglutarate; C5P, riboz 5-fosfat; CIT, sitrat; E4P, erythrose 4-fosfat; G6P, glukoz 6-fosfat; OAA<html> oksaloasetat; KEP fosfoenolpiruvat; PGA, 3-fosfogliserat; PYR, piruvat. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. 16 amino asitler için GC zirveleri. MS TBDMS derivatized amino asitler iki parça halinde kırık: (E-57) +, tüm amino asit içeren ve (M-159) +, α amino asidin karboksil grubu yoksun. Lösin ve izolösin için (E-57) + diğer kitle zirveleri ile çakışmış oldu. Biz tüm amino asit etiketleme analiz parçası (E-15) + kullanmanızı öneririz. (F302) + grup, bir amino asit omurga sadece ilk (α-karboksil grubu) ve ikinci karbonlar içeren, en çok amino asit tespit edilmiştir. Bu MS tepe sık sık yüksek gürültü-sinyal oranları olduğundan, (F302) + metabolik akıları 7 kantitatif analiz için tavsiye değildir. igure 4 &quot;/&gt; Şekil 4 Cyanothece 51.142 (önceki kağıt değiştirilmiş) 21 izolösin yollar geçişler Etiketleme.

<ol><li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li>
<li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li>
<li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluxome+analysis+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li>
<li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li>
<li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis%3A+mass+isotope+correction%2C+data+consistency+checking%2C+and+precursor+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li>
<li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li>
<li>Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li>
<li>Tang, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li>
<li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe%28III%29-NTA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li>
<li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li>
<li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calvin+cycle+flux%2C+pathway+constraints%2C+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li>
<li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase%2Freductase%3A+The+ethylmalonyl-CoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li>
<li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li>
<li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unicellular%2C+aerobic+nitrogen-%C3%AF%C2%AC%C2%81xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li>
<li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li>
<li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li>
<li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-based+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol etiketli substrat hücre GC-MS ile amino asitler beslenme ve elde edilen izotopik etiketleme desen ölçme oluşmaktadır. MS veri (m / z oranlarına) MS iyonlarının etiketleme sadece toplam miktar vermek zamandan beri, biz inceleyerek hem de parçalanmamış (E-57) + m / z oranları ve parçalanmış amino asitler, amino asitlerin isotopomer dağılımları değerlendirmek için (yani, (M-159) + (F302) +). Ayrıca, kimyasal olarak benzer bir ortamı ancak farklı etiketleme desenleri (1</sup...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Etiketli karbon substrat </td><td> Cambridge İzotop Laboratuvarlarında </td><td> Deneysel gereksinimi bağlıdır. </td><td> Web sitesi <a href="http://www.isotope.com">:</a> http://www.isotope.com </td></tr><tr><td> Gaz kromatograf </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, model 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC Kolonları </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Kütle spektrometresi </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-Vap Evaporator </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18.825 </td><td> Amino asit örnekleri kurutma için </td></tr></tbody></table>

sayesinde metabolik pathway onay ve keşif 13</supaminoasittir> c-etiketleme

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Mikroplar, biyokimya ve işlevsel genomik yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır karmaşık metabolik yollar var. Hücre merkezi metabolizma incelemek ve yeni enzimler keşfetmek için önemli bir teknik, 13 C-destekli metabolizma analizi 1 . Bu teknik izotopik etiketleme, mikropların 13 C etiketli substratları ile beslenen sayede dayanmaktadır. Biyokimyasal ağ metabolitleri arasında atom geçiş yolları takip ederek, işlevsel yollar belirlemek ve yeni enzimler keşfetmek. Transkriptomik ve proteomik, metabolik yollarının isotopomer yardımlı analizi için tamamlayıcı bir yöntem yaklaşımları üç önemli adımlar 2 içeren İlk 13 C etiketli substratlar hücreleri büyür. Bu adımda, orta ve etiketli yüzeylerin seçimi kompozisyon iki önemli faktör vardır. Besin takviyeleri etiketli karbon ölçümü gürültüleri önlemek için, Tek bir karbon kaynağı ile en az bir ortam gereklidir. Ayrıca, etiketli bir substrat seçim analiz edilen yolun açıklamak ne kadar etkili dayanmaktadır. Roman enzimler genellikle farklı reaksiyon stereokimya genel veya ara ürünler, içerdiğinden, tek başına etiketli karbon yüzeyler, roman yollar 3, 4 tespiti için düzgün etiketli olanlardan daha roman yollarının tespiti için daha bilgilendirici İkincisi, biz GC kullanarak amino asit etiketleme kalıplarını analiz -MS. Amino asitler protein bol miktarda bulunmaktadır ve dolayısıyla, biyokütle hidroliz elde edilebilir. Amino asitler, GC ayırma önce N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatized olabilir. TBDMS derivatized amino asitler, MS ve parçaları farklı diziler sonucu parçalanmış olabilir. Parçalanmış ve parçalanmamış amino asitler (m / z) oranı sorumlu kitle dayanarak, merkezi metabolitlerin mümkün etiketli desen anlayamayacağımızamino asitlerin öncüleri Üçüncü olarak, biz bu yolları 2 aktif olup olmadığını onaylamak, isotopomer verilere göre, önerilen yollar 13C karbon geçişleri izlemek ve. Amino asit ölçümü izotopik etiketleme merkezi metabolizma sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında bilgi sağlar. Bu metabolik anahtar düğümler ilişkili merkezi yollarının fonksiyonlarını yansıtır. Aminoasittir ile 13 C-destekli metabolizma analizi kötü karakterize mikrobiyal metabolizma 1 fonksiyonel karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılır . Bu protokol, yeni enzimatik fonksiyonları keşfetmek için etiketli karbon substratların kullanımını göstermek için model suşu olarak Cyanothece 51.142 kullanacaktır.

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Mikroplar, biyokimya ve fonksiyonel genomik yöntemler kullanılarak incelenebilen karmaşık metabolik yolaklara sahiptir. ... incelemek için kullanılan önemli bir teknik...

Bu protokolün amacı, karbon 13 destekli metabolizma analizi kullanarak bakteriyel metabolizmayı incelemektir. Başlangıçta, mikroplar, mikrobiyal proteinlere dahil olan işaretli karbon substratlarının varlığında yetiştirilir. Ardından mikroplar hasat edilir ve amino asitler ekstre edilip hidrolize edilir ve türevlendirmeye tabi tutulur.Numuneler bir gaz kromatografı ve kütle spektrometresine veya GCMS'e uygulanır. Biyokimyasal ağdaki metabolitler arasındaki atom geçiş yolları takip edilerek, mikrobun kullandığı fonksiyonel metabolik yollar belirlenebilir. Ben Bert Burla.Burada sunduğumuz yöntem, mikroplardaki metabolik yolakların belirlenmesinde transkriptomik ve proteomiğin tamamlayıcısı olarak kullanılabilir. Bu tekniği, siyanobakteriler gibi fotosentetik mikropların miyotrofik veya heterotrofik karbon kullanımını araştırmak için kullandık. Bu videoda, yeni enzimatik fonksiyonların keşfi için işaretli karbon substratlarının kullanımını göstermek amacıyla model suş olarak ANOTHE 5 1 1 42'yi kullanacağız.Prosedürü ben, li Yu ve Chu Yang Fang gerçekleştireceğiz. Bu prosedüre, cyana thesei bakterilerini etiketsiz bir besiyerinde büyüterek başlayın. Bakteriler orta logaritmik büyüme ev

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş Su

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.

Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Sıvı kromatografisi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştirilmiş 13C6-Glikoz etiketleme yöntemi çok yönlüdür ve tıbbi bitkilerde ikincil metabolitlerin sentezinde yer alan birincil organlar ve yollar ile bu ikincil metabolitlerin kapsamlı kullanımı hakkında gelecekteki çalışmaların temelini oluşturur.

13C 6-LC-MS ile İlişkili Glikoz Etiketlemesi: İkincil Metabolit Sentezinde Bitki Birincil Organlarının Tanımlanması

İlişikteki video GELFREE 8100 Fraksiyonu Sistemi kullanımı, kompleks protein örneklerinin moleküler ağırlık bazında bölümleri açıklar ve sıvı faz fraksiyonları kurtarır. Video teknoloji, nasıl kullanılır, inşaat işleri ve fraksiyone sığır karaciğer Homojenat poliakrilamid jel elektroforezi analizleri ile ortaya çıkan veri sağlar.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

Öğrenin bakteri metabolizmasını karbon-13 izotop etiketleme ve GC-MS kullanarak analiz etme yöntemini. Bu teknik mikrobiyal protein sentezi ve metabolik yol haritalarının keşfi için değerlidir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif^{13 C-etiketleme}

Daha fazla video keşfet