Name: Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Keşfedin insan eklem kondrositleri için sinovya sıvısı kullanan 3D kültür sistemini. Bu yöntem, kıkırdak rejenerasyonu ve artrit tedavisi araştırmalarında uzun süreli hücre canlılığı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Robin Nye (Tufts Tıp Merkezi), Tomoya Uchimura ve Dana Cairns (Tufts Üniversitesi), sinoviyal sıvı depolama ve santrifüj ile yardım sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LZ (1R01AR059106-01A1) NIH tarafından finanse edildi

Sinoviyal sıvı, kültür, insan eklem kondrosit için bir 3D sistemi Bu çalışmada, modifiye edilmiş bir imalat önerilen kapsülleme protokolü (Lonza, ve 31) kullanılarak aljinat boncuk insan eklem kondrosit kapsüllü. Bu 3D yapıları kullanarak, çeşitli yüzdeler insan sinovyal sıvı içeren bir kültür ortamı kültür hücreleri için bir sistem geliştirdik ve kıkırdak gen ekspresyonu için bu 3 boyutlu yapıları değerlendirilir. 1. Üç boyutlu (3D) kapsülleme için insan eklem kondrosit hazırlayın (HAC) <ol><li> Insan eklem kondrosit (HAC) (Lonza) (Passage 2) 37 ° C su banyosunda 1 dakika için bir şişe (1 ml) Çözülme. </li><li> Kondrosit büyüme ortam (Lonza) hücreleri toplamak için 3-5 dakika süreyle 3000 rpm&#39;de santrifüj 1 ml ile karıştırın. Süpernatantı atın. </li><li> Kondrosit büyüme ortamı yeniden süspanse hücre pelletini (Lonza). </li><li> 10 cm doku Levha hücrelerikültür plakasına (BD Biosciences), kondrosit büyüme ortamı (Lonza) kültür ve hücrelerin konfluent. kadar. HACs 3 veya 4 den daha yüksek (P3 veya P4) bir geçiş sayısı kullanılmalıdır. </li><li> Aljinat boncuk kapsülleme hücreleri toplamak için trypsinzation takip 155mm NaCl yerine standart PBS, plaka üzerinde HACs yıkayın. Hücreleri müstakil, 5dakika 3000rpm hücreler aşağı doğru döndürün. Hücreler artık 3D kapsülleme için hazır. </li></ol> 2. 3D boncuk HACs kapsülleyen 8x10 5 hücre / ml yoğunluğu% 1.2 aljinat çözeltisi (Sigma) HACs tekrar Hücre sayıları kullanarak, standart bir cep sayacı önce kapsülleme belirlendi. Bu çok önemli bir boncuk hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için iyice karıştırın. <ol><li> Pipet 22-gauge iğne (Tyco sağlık, Inc.) Bağlı 12 ml enjektöre HAC / Aljinatta çözüm karışımı. </li><li> Bu arada, 50 ml beher 102 m hazırlamak.Bir ses seviyesinde M CaCl 2 5 kez HAC / aginate çözüm. Yerleştirin ve bir kabın içinde karıştırın çubuğunda (yaklaşık 150 rpm&#39;de) 102 mM CaCl 2 çözümü yavaş yavaş karıştırın . </li><li> CaCl 2 çözüm yüzeyinden yaklaşık 6 inç şırınga ucu tutun ve CaCl 2 çözüm damla damla içine HAC / aljinat karışımı ekleyin. Genel olarak, aljinat boncuk yaklaşık 10 4 hücre / boncuk bir kapsülleme yoğunluğu ile çapı 2mm. Not: CaCl 2 çözüm üzerinde şırınga yüksekliği önemlidir. Kısa mesafe düzensiz mekanik bütünlüğü ve hücre kapsülleme neden, küresel şekilli boncuk yerine şeklindeki gözyaşı damla neden olacaktır. </li><li> Boncuklar ilave edin, 20-25 dakika süreyle CaCl 2 çözüm olsun . Diğer aljinat encapsulation protokoller 10dk çok daha kısa bir inkübasyon süresi işaret ederken, biz CaCl 2 çözümü ile inkübasyon süresi daha uzun olabilir bütünlüğünü gelişmiş bulundu.reklamlar. </li><li> CaCl 2 çözüm çıkarın, kondrosit farklılaşmasını orta (Lonza) bir kez daha sonra 2-3 defa 2-3 hacim NaCl boncuk yıkayın ve. Aljinat boncuk encapsulation protokoller yukarıdaki yıkama işlemleri için bir filtre kullanarak ilgili olsa da, biz genellikle böylece encapsulation etkinliğini azaltan aljinat boncuklar, filtre ve kuru bir çıkış tuzak haline bulundu. Biz en verimli boncuk atılmadan önce beher alt çözüm yerleşmek için izin bulundu. </li><li> Boncuk kültür kaplarına transferi için standart bir spatula kullanın. Biz genellikle kültür kondrosit büyüme ortamında 2 gün 3 cm başına 12 boncuk kondrosit sürecinden önce sinovyal sıvı ile kondrosit farklılaşmasını orta (Lonza) geçiş yetiştiği ortamda ayarlamak için izin vermek. </li></ol> 3. Sinoviyal sıvı kültür ortamında Kültür kondrosit <ol><li> Taze sinoviyal sıvı bir o elde edilebilirutpatient kliniği (sinoviyal sıvı Tufts Tıp Merkezi&#39;nden elde edilen). Sinovyal sıvı laboratuvarda 15ml şahin tüpler ve hemen 15 dakika için 3000 rpm&#39;de santrifüj hücre enkaz kaldırmak için olabilir. 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler içine kısım hücre ücretsiz sinovyal sıvı, donma-çözülme tekrarlanan önlemek için. Süpernatant -80 ° C kullanana kadar saklanabilir. </li><li> Önce kültür, sabit bir 100 mM askorbik asit konsantrasyonu ve 9 mM CaCl 2 (2 CaCl bu iz miktar aljinat bütünlüğünü sağlamak için, hacimsel oranları değişen kondrosit farklılaşması orta sinovyal sıvı karışımı (CDM, Lonza) boncuk gibi). </li><li> 37 ° C inkübatör içinde sallanan platform üzerinde plaka tutun (sallanan frekansı: yaklaşık 75 kez / dk) aljinat boncuklar içinde besin dağıtım yardımcı olmak ve boncuk topaklanma azaltmak için. Bu zaman uzun bir süre için (en fazla 4 hafta) kültürü bu kondrosit olarak özellikle önemlidir. NotKondrosit büyüme ve farklılaşma medya (Lonza) iki yaygın olarak kullanılan antibiyotik gentamisin ve amfoterisin içerirken kondrosit kültür için farklı yüzde sinovyal sıvı kullanıldığı zaman, herhangi bir antibiyotik takviyesi vermedi. No kirlenme hiç gözlendi. </li><li> Her 2-3 günde bir medya karışımlar değiştirin. Sinovyal sıvının viskozitesi, uzun vadeli kültürleri sırasında aljinat boncuk kapsüllü kültür kondrosit büyük bir engel olmuştur. Biz de aljinat boncuk bütünlüğünü güçlendirir 102mm CaCl 2 (% 50 V / V), sinoviyal sıvı takviye orta sulandırmak için en etkili bulundu. Bu şekilde, orta boncuklar zarar vermeden yavaş yavaş bir pipetlemeyin kaldırılır olabilir. </li></ol> 4. Gen ekspresyon analizi için aljinat boncuk Hasat HACs Gen ekspresyon analizi için aljinat boncuk HACs hasat zaman özel bir dikkat gerekir. <ol><li> Aljinat boncuk 3 ti yıkayınher zaman için yaklaşık 5 dakika 102 mM CaCl 2 mes. </li><li> 4-5 kez boncuk hacmi 55 mM NaCitrate ekleyerek kondrosit al. Aljinat boncuk NaCitrate çözümü tamamen dalmış olduğu önemlidir. 20-30 dakika sallayın veya kaya. </li><li> Hücrelerin Spin ve süpernatantı atın. </li><li> RT-PCR analizi için, hücre, hücre lizis tamponunda pelet (Qiagen RNA izolasyon kiti) ve RNA arıtma ile devam tekrar süspansiyon. </li></ol> 5. Histolojik analiz için aljinat boncuk HACs Fix Özel bakım, histolojik analiz için 3 boyutlu boncuk HACs hasat alınmalıdır. <ol><li> 5 dakika hakkında her zaman için 102 mM CaCl 2 aljinat boncuk, 3 kere yıkayın . Viskoz sinovyal sıvı tamamen uzak yıkamak için, biz, 37 ° C inkübatör (sallanan frekans de sallanan bir gecede kondrosit farklılaşmasını orta (Lonza) ile yıkamak için en etkili bulundu: yaklaşık 75 kezs / dak). Kondrosit büyüme ortamı, bu uzun süreli yıkama kondrosit hayatta kalmasını sağlamak için ve sabitleme ajanı maksimum penetrasyon sağlamak için kullanılır oldu. </li><li> Bir gecede% 70 etanol boncuk Fix ve histolojik analizi ile devam edin. DAPI boyama gerçekleştirmek için, nazik sallanan altında 1hr DAPI çözüm (500ng/ml) ile aljinat boncuk inkübasyon ve 102mm CaCl 2 15 dakika için her zaman 3 kere yıkayın. DAPI görüntüler daha sonra bir floresan mikroskop altında görülebilir. Boncuklar da alcian mavi ve H &amp; E boyama kesitli olabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Sinovyal sıvıda yüksek oranda insan kondrosit 3D kültür yöntemi şematik diyagramı Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi tasvir edilmiştir. Insan kondrosit aljinat boncuk kapsüllü sonra, onlar, sinovyal sıvı oranları değişen ile takviye ortamda büyümeye izin verildi. Çünkü sinovyal sıvının viskozitesi, esastırkültür kondrosit sürekli sallanan koşullar altında, kıkırdak yapıları topaklanma önlemek ve hatta besinlerin dağılımını sağlamak için. Bu sabitleme veya lizis tamponu boncuklar nüfuz edebilir (Şekil 1), kondrosit almadan önce yoğun aljinat boncuk yıkamak için de çok önemlidir. Aljinat boncuk kondrosit Parlak alan (BF) görüntüleri Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. DAPI boyama, boncuk içinde hücrelerin usniform dağılımı (Şekil 2) onaylamak için yapıldı. 21 günlük kültür dönemi sonunda, gen ekspresyon analizi QRT-PCR tarafından yapıldı. Kondrosit 32 qPCR analizi için en güvenilir referans genlerin biri olarak tespit edilmiştir referans gen GAPDH, tüm PCR normalleşmesi için kullanılır oldu. Şekil bir örnek gösterilmiştir. 3, osteoartriti olan altı hastanın sinovyal sıvı toplanmış kültür insan eklem kondrosit sonuçları analiz edildi. Gerçeği ile de uyumlu olduğundan kondrositLonza, kaçınılmaz olarak de-farklılaşma 33 yol açacak 2B kültürleri, genişletilmiş var, biz o kıkırdak matriks genleri Gün 0 kondrosit minimal düzeyde (Şekil 3) olarak ifade edilmiştir. Sinovyal sıvı ile takviye kondrosit farklılaşmasını orta (Lonza) ya da orta kondrosit 3D kültür kıkırdak kollajen, aggrecan ve MMP13, Day 21 (Şekil 3) 34-farklılaşma kondrosit gösterir gen ekspresyonu önemli ölçüde arttı . Medya sinovyal sıvı oranının arttırılması kıkırdak matriks belirteçler kollajen II ve aggrecan mRNA (Fig.3A 3B) karşılaştırılabilir düzeyde sonuçlandı. Ayrıca, orta yalnız (Fig.3C) kültürlü olanlar ile karşılaştırıldığında% 100 sinovyal sıvıda kültür kondrosit bile kıkırdak parçalayıcı enzim MMP13 mRNA bir düşüş sergiledi. İlginç bir şekilde, yavaş yavaş hücre ölümü göstergesi kaspaz 3 ekspresyon seviyesi düşündüren sinovyal sıvı artan oranları azalmıştır olduğunu synovial sıvı kültür azalmış apoptozis düzeyleri (Şekil 3D) yol açmıştır. Bu nedenle, 3 boyutlu bir ortamda sinovyal sıvıda yüksek düzeyde kültür insan eklem kondrosit uygun bir teknoloji olduğunu göstermektedir. Tablolar ve Şekiller <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> Şekil 1. 3D aljinat boncuk sinovyal sıvıda yüksek oranda insan eklem kondrosit kültürü yöntemi şematik. İlk olarak, kondrosit ve aljinat çözüm karıştırılır. CaCl 2 çözüm açılan akıllıca uygulandığında, kondrosit çapraz Ca-aljinat hidrojel boncuklar içinde hareketsiz. Bu 3 boyutlu yapıları, insan sinovyal sıvı oranları değişen kondrosit farklılaşmasını orta (Lonza) kültür. Kültür sallanan bir koşul altında 21 gün sonra, hücre içeren aljinat boncuk hücreleri gen alınacağı sonra yoğun yıkanırekspresyon analizi. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> Şekil 2: Aydınlık alan (BF) ve insan eklem kondrosit DAPI görüntüler% 0,% 30,% 50,% 70 ve% 100 sinovyal sıvıda kapsüllü kültürler . Kondrosit tüm kültür koşullarında şeklinde küresel. Aydınlık alan (BF) ve DAPI Görüntüler kondrosit yeri ve dağıtım onaylamak için üst üste. Parçalar, büyütülmüş görüntüler. Ok uçları, BF ve DAPI boyama görüntüleri kondrosit ko. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> Şekil 3 gün kapsüllü insan eklem kondrosit QRT-PCR analizi 0 (D0) sinovyal sıvı (SF) (% 0,% 30,% 50, 70 arasında değişen oranlar ile desteklenmiş orta kültür (D21) 21 gün sonra % ve% 100). Dört bağımsız örnekler sonuçları burada gösterilmiştir. GAPDH tüm PCR için dahili referans olarak kullanılmıştır. <strong&gt; A. Kollajen II mRNA B. Aggrecan mRNA C. MMP13 mRNA D. Kaspaz 3 mRNA. İstatistiksel anlamlılık Günü 0 örnekler ve% 0 Gün 21 örnek ve INSTAT&#39;ın yazılımı kullanarak% 100 sinoviyal sıvı (SF) kültür değerlendirildi. * Gösterir p &lt;0.05.

<ol><li>Centers for Disease Control and P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+state-specific+increases+in+self-reported+doctor-diagnosed+arthritis+and+arthritis-attributable+activity+limitations--United+States%2C+2005-2030%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morb.+Mortal.+Wkly.+Rep%22%5BJournal%5D)">Projected state-specific increases in self-reported doctor-diagnosed arthritis and arthritis-attributable activity limitations--United States, 2005-2030.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56, 423-425 (2007).</li>
<li>Theis, K. A., Murphy, L., Hootman, J. M., Helmick, C. G., Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+correlates+of+arthritis-attributable+work+limitation+in+the+US+population+among+persons+ages+18-64%3A+2002+National+Health+Interview+Survey+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Prevalence and correlates of arthritis-attributable work limitation in the US population among persons ages 18-64: 2002 National Health Interview Survey Data.</a> Arthritis Rheum. 57, 355-363 (2007).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cartilage+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering cartilage tissue.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 60, 243-262 (2008).</li>
<li>Glowacki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+engineering+of+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rehabil.+Res.+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro engineering of cartilage.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 37, 171-177 (2000).</li>
<li>Chokalingam, K., Hunter, S. A., Gooch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-In+vitro+Effects+of+Compression+and+Time+in+Culture+on+Aggregate+Modulus+and+on+Gene+Expression+and+Protein+content+of+Collagen+Type+II+in+Murine+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">3D-In vitro Effects of Compression and Time in Culture on Aggregate Modulus and on Gene Expression and Protein content of Collagen Type II in Murine Chondrocytes.</a> Tissue Eng. Part A. , (2009).</li>
<li>Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering%3A+the+role+of+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering: the role of biomechanics.</a> J. Biomech. Eng. 122, 570-575 (2000).</li>
<li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> J. Cell. Physiol. 213, 626-634 (2007).</li>
<li>Zvaifler, N. J., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+in+chronic+inflammatory+synovitis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Rheumatol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cytokines in chronic inflammatory synovitis.</a> Scand. J. Rheumatol. Suppl. 76, 203-210 (1988).</li>
<li>Rhee, D. K., Marcelino, J., Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secreted+glycoprotein+lubricin+protects+cartilage+surfaces+and+inhibits+synovial+cell+overgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth.</a> J. Clin. Invest. 115, 622-631 (2005).</li>
<li>Campo, G. M., Avenoso, A., Nastasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+reduces+inflammation+in+experimental+arthritis+by+modulating+TLR-2+and+TLR-4+cartilage+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan reduces inflammation in experimental arthritis by modulating TLR-2 and TLR-4 cartilage expression.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2011).</li>
<li>van de Lest, C. H., van den Hoogen, B. M., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Biorheology. 37, 45-55 (2000).</li>
<li>Saxne, T., Heinegard, D., Wollheim, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+arthritic+synovial+fluid+influences+proteoglycan+biosynthesis+and+degradation+in+organ+culture+of+bovine+nasal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human arthritic synovial fluid influences proteoglycan biosynthesis and degradation in organ culture of bovine nasal cartilage.</a> Coll. Relat. Res. 8, 233-247 (1988).</li>
<li>Lee, D. A., Salih, V., Stockton, E. F., Stanton, J. S., Bentley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+normal+synovial+fluid+on+the+metabolism+of+articular+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of normal synovial fluid on the metabolism of articular chondrocytes in vitro.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 228-238 (1997).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+nonresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor+1+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte nonresponsiveness to insulin-like growth factor 1 in experimental arthritis.</a> Arthritis Rheum. 32, 894-900 (1989).</li>
<li>Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van Wyk, J. J., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+stimulation+of+chondrocyte+proteoglycan+synthesis+by+human+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor stimulation of chondrocyte proteoglycan synthesis by human synovial fluid.</a> Arthritis Rheum. 32, 66-71 (1989).</li>
<li>Joosten, L. A., Schalkwijk, J., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+unresponsiveness+to+insulin-like+growth+factor-1.+A+novel+pathogenetic+mechanisms+for+cartilage+destruction+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte unresponsiveness to insulin-like growth factor-1. A novel pathogenetic mechanisms for cartilage destruction in experimental arthritis.</a> Agents Actions. 26, 193-195 (1989).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., Dombrecht, E. J., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+and+peripheral+blood+immune+complexes+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+induce+apoptosis+in+cytokine-activated+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol.+Int%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid and peripheral blood immune complexes of patients with rheumatoid arthritis induce apoptosis in cytokine-activated chondrocytes.</a> Rheumatol. Int. 27, 901-909 (2007).</li>
<li>Hegewald, A. A., Ringe, J., Bartel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+and+autologous+synovial+fluid+induce+chondrogenic+differentiation+of+equine+mesenchymal+stem+cells%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study.</a> Tissue Cell. 36, 431-438 (2004).</li>
<li>Xu, Q. R., Dong, Y. H., Chen, S. L., Bao, C. D., Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+normal+articular+cartilage+induced+by+late+phase+osteoarthritic+synovial+fluid+in+beagle+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Degeneration of normal articular cartilage induced by late phase osteoarthritic synovial fluid in beagle dogs.</a> Tissue Cell. 41, 13-22 (2009).</li>
<li>Kruger, J. P., Endres, M., Neumann, K., Haupl, T., Erggelet, C., Kaps, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+subchondral+progenitor+cells+is+impaired+by+rheumatoid+arthritis+synovial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human subchondral progenitor cells is impaired by rheumatoid arthritis synovial fluid.</a> J. Orthop. Res. 28, 819-827 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., Bruns, J., Niggemeyer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+culture+system%3A+Synovial+fibroblasts+modulate+articular+chondrocyte+matrix+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Perfusion culture system: Synovial fibroblasts modulate articular chondrocyte matrix synthesis in vitro.</a> Tissue Cell. 42, 151-157 (2010).</li>
<li>Yang, K. G., Saris, D. B., Verbout, A. J., Creemers, L. B., Dhert, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+synovial+fluid+from+injured+knee+joints+on+in+vitro+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">The effect of synovial fluid from injured knee joints on in vitro chondrogenesis.</a> Tissue Eng. 12, 2957-2964 (2006).</li>
<li>Skoog, V., Widenfalk, B., Ohlsen, L., Wasteson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+growth+factors+and+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+perichondrium%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Plast.+Reconstr.+Surg.+Hand.+Surg.%22%5BJournal%5D)">The effect of growth factors and synovial fluid on chondrogenesis in perichondrium.</a> Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. Hand. Surg.. 24, 89-95 (1990).</li>
<li>Nuver-Zwart, I., Schalkwijk, J., Joosten, L. A., van den Berg, W. B., van de Putte, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+synovial+fluid+and+synovial+fluid+cells+on+chondrocyte+metabolism+in+short+term+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Effects of synovial fluid and synovial fluid cells on chondrocyte metabolism in short term tissue culture.</a> J. Rheumatol. 15, 210-216 (1988).</li>
<li>Beekhuizen, M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M., Koevoet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+tissue+inhibits+proteoglycan+production+in+human+osteoarthritic+cartilage%3B+Establishment+and+characterisation+of+a+long-term+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial tissue inhibits proteoglycan production in human osteoarthritic cartilage; Establishment and characterisation of a long-term coculture.</a> Arthritis Rheum. , (2011).</li>
<li>Rodrigo, J. J., Steadman, J. R., Syftestad, G., Benton, H., Silliman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+human+knee+synovial+fluid+on+chondrogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Knee.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of human knee synovial fluid on chondrogenesis in vitro.</a> Am. J. Knee. Surg. 8, 124-129 (1995).</li>
<li>van den Hoogen, B. M., van de Lest, C. H., van Weeren, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading-induced+changes+in+synovial+fluid+affect+cartilage+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Loading-induced changes in synovial fluid affect cartilage metabolism.</a> Br. J. Rheumatol. 37, 671-676 (1998).</li>
<li>Webb, G. R., Westacott, C. I., Elson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritic+synovial+fluid+and+synovium+supernatants+up-regulate+tumor+necrosis+factor+receptors+on+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritic synovial fluid and synovium supernatants up-regulate tumor necrosis factor receptors on human articular chondrocytes.</a> Osteoarthritis Cartilage. 6, 167-176 (1998).</li>
<li>Kook, S. H., Son, Y. O., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+positively+the+proliferation+of+bovine+satellite+cells+and+their+myogenic+differentiation+through+up-regulation+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects positively the proliferation of bovine satellite cells and their myogenic differentiation through up-regulation of MyoD.</a> Cell. Biol. Int. 32, 871-878 (2008).</li>
<li>Knobloch, T. J., Madhavan, S., Nam, J., Agarwal, S., Agarwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chondrocytic+gene+expression+by+biomechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Eukaryot.+Gene.+Expr%22%5BJournal%5D)">Regulation of chondrocytic gene expression by biomechanical signals.</a> Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr. 18, 139-150 (2008).</li>
<li>Guo, J. F., Jourdian, G. W., MacCallum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+growth+characteristics+of+chondrocytes+encapsulated+in+alginate+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads.</a> Connect. Tissue. Res. 19, 277-297 (1989).</li>
<li>Toegel, S., Huang, W., Piana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+reliable+reference+genes+for+qPCR+studies+on+chondroprotective+action%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection of reliable reference genes for qPCR studies on chondroprotective action.</a> BMC. Mol. Biol. 8, 13-13 (2007).</li>
<li>Lin, Z., Fitzgerald, J. B., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+human+chondrocytes+during+passaged+monolayer+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of human chondrocytes during passaged monolayer cultivation.</a> J. Orthop. Res. 26, 1230-1237 (2008).</li>
<li>Goessler, U. R., Bieback, K., Bugert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chondrocytes+differentially+express+matrix+modulators+during+in+vitro+expansion+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Human chondrocytes differentially express matrix modulators during in vitro expansion for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Med. 16, 509-515 (2005).</li>
<li>Anat, J. 121, 107-118 (1976).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu raporda, insan sinovyal sıvıda yüksek konsantrasyonlarda içeren ortamda 3 boyutlu bir ortamda insan eklem kondrosit kültür sağlayan bir yöntem geliştirdi. Sinovyal sıvı eklem boşluğu, eklem kondrosit bulunduğu doğal ortamı oluşturan önemli bileşenlerinden biridir. Ancak, sinovyal sıvıda viskozite kondrosit üç boyutlu, uzun vadeli kültür için önemli bir sorun olmuştur. 3D viskoz bir ortamda inşa etmek ve önlemek için agregasyonu bile besin dağılımı sürdürmenin zorluğu aşmak için, sürekli hareket nazik sallanan altında...

Özel reaktifler ve ekipman Tablo: <table border="1"><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Aljinat için (Aljinik asit sodyum tuzu) </td><td> Sigma </td><td> A2158-250G </td><td> 40 ° C&#39;de depolanan% 2.4 çözümü </td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür Dihidrat, Granüler </td><td> JT Baker </td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Chondrogenic Büyüme ortamı </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC-3156 (baz medya) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4409 (ek) </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Chondrogenic Farklılaşma Media </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC-3226 (baz medya) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4408 (ek) </td></tr><tr><td> İnsan eklem kondrosit </td><td> Lonza </td><td > CC-2550 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindole dihidroklorür) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy mini kiti (RNA ekstraksiyonu için) </td><td> Qiagen </td><td > 74104 </td><td></td></tr><tr><td> PCR: SYBR-yeşil </td><td> Kuantum </td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ml şırınga </td><td> Tyco-Kendall-Monoject </td><td > 512852 </td><td></td></tr><tr><td> 22-Gague Hipodermik İğne </td><td> Tyco-Kendall-Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td> Platform rocker </td><td> Thermoscientific thermolyne </td><td > Vari-mix </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Astarlar dizileri </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Kollajen IIa ileri </td><td> 5&#39;-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Kollajen IIa-ters </td><td> 5&#39;-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 ileri </td><td> 5&#39;-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13 geri </td><td> 5&#39;-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Kaspaz 3-ileri </td><td> 5&#39;-TCA TTA TTC AGG SKK GCC GTG GTA-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Kaspaz 3 geri </td><td> 5&#39;-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TTK TTT -3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr></table>

sinovya sıvısı kültürleme İnsan eklem kondrosit 3d sistemi

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Kıkırdak imha osteoartrit merkezi bir patolojik özellik, ABD&#39;nin önde gelen sakatlık nedenidir. Kıkırdak yetişkin in vivo olarak çok verimli bir şekilde yeniden değildir; ve bunun sonucu olarak, osteoartrit, kıkırdak kaybı geri döndürülemez açar ve kronik ağrı ve hareketsizlik 1,2 eşlik ediyor . Kıkırdak doku mühendisliği, doku işlevini yeniden ve geri yüklemek için umut verici bir potansiyel sunmaktadır. Bu teknoloji, genellikle doğal veya sentetik iskeleleri ve kültür içine çıkan 3D 3-6 in vivo bir defekt içine nakledilen bir biyokimyasal ve biyomekanik olgun doku mühendisliği amacı ile bir süre içinde dengeli bir orta inşa ekim kondrosit içerir . Kondrosit büyüme ve matriks birikimi için optimal bir durum ulaşmak kıkırdak doku mühendisliği başarısı için esastır. Arktik doğal eklem boşluğu, kıkırdakkemik bilirsiniz yüzey sinovyal sıvıdaki yıkanıyor. Bu berrak ve yapışkan sıvı besin sağlar avasküler eklem kıkırdağı ve büyüme faktörleri, sitokinler ve kondrosit metabolizması 7,8 için önemli olan enzimleri içerir. Ayrıca, eklem sıvısı ile kıkırdak yüzeyler arasında esas olarak iki temel bileşen, hyaluronan ve lubricin 9 10 salgılayan düşük sürtünme hareketi kolaylaştırır. Buna karşın, doku mühendislik kıkırdak en sık yapay medyada kültüre. Bu medya muhtemelen kondrosit metabolizması eğitim için daha fazla tanımlanmış koşullar sağlamak mümkün iken, eklem sıvısı, eklem kondrosit içinde bulunduğu doğal çevreye en doğru yansıtan Gerçekten de, sinoviyal sıvı almak ve saklamak için kolay olma avantajı vardır ve genellikle düzenli olarak vücut tarafından doldurulan olabilir. Çeşitli gruplar büyüyen insan, sığır, tavşan ve köpek c sinovyal sıvı ile kültür ortamı takviyehondrocytes, ancak çoğunlukla sadece sinoviyal sıvı (% 20 altında) 11-25 düşük düzeylerde kullanılır. Tavuk, at ve insan kondrosit sinovyal sıvıda yüksek yüzdesi ile orta kültüre alınmış olsa da, bu kültür sistemleri, iki boyutlu 26-28 edildi. Burada 21 günlük bir süre içinde sinoviyal sıvının yüksek bir yüzdesi (% 100&#39;e kadar) insan eklem kondrosit kültür yöntemi ile 3D sistemi mevcut. Bunu yaparken, biz üstesinden sinovyal sıvıda yüksek viskozite tarafından sunulan önemli bir engel. Bu sistem, 3 boyutlu bir ortamda, daha doğal ortam taklit kıkırdak için doğal ortamı oluşturan diğer iki önemli faktörler (oksijen basıncı ve mekanik yükleme) 29,30 ile kombine edilebilir sinoviyal sıvı insan kondrosit eğitim imkanı sağlar kıkırdak büyüme. Ayrıca, Bu sistem kondrosit sinoviyal sıvı aktivitesi assaying için kullanılır ve geliştirmek için bir platform sağlamak olabilirkıkırdak rejenerasyon teknolojileri ve artrit için tedavi seçenekleri.

Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Kıkırdak yıkımı, ABD'deki engelliliğin önde gelen nedenlerinden biri olan osteoartritin temel patolojik özelliğidir. Erişkini kıkırdağı ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan eklem kondrositlerini sinovyal sıvı içerisinde uzun süreli kültürlerde büyütmektir. Bu işlem, öncelikle kondrositlerin aljinat boncuklar içine kapsüllenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından kondrositler, normal büyüme koşullarını taklit eden 3B bir ortamda çoğalmalarına olanak tanıyan sinovyal sıvı içerisinde kültüre edilir.Hücrelerin besin maddelerine yeterince erişebilmesini sağlamak için besiyeri periyodik olarak değiştirilmelidir. Prosedürün son adımı, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için kondrositlerin aljinat boncuklardan hasat edilmesidir. Bu analizler, aljinat boncuklarda kültüre edilen kondrositlerin canlı olduğunu, prolifere olduğunu ve önemli miktarda kıkırdak matrisi eksprese ettiğini doğrular.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kıkırdak hücrelerini 2D yerine üç boyutlu ortamlarda analiz ediyor olmamızdır. Ayrıca, yapay besiyeri yerine medya olarak sinovyal sıvı kullanıyoruz. Dolayısıyla, üç boyutlu yapı ile sinovyal sıvı kullanımının kombinasyonu, hücreleri bir plaka üzerindeki iki boyutlu ortama ve yapay besiyerine kıyasla daha doğal bir ortamda analiz etmemize olanak tanımaktadır.Bu yöntem, kıkırdak biyolojisi ve doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, kıkırdak hücreleri veya kondrositler uzun vadede sinovyal sıvı içerisinde nasıl davranır? Ayrıca, kıkırdak hücrelerini konakçılara nakletmeden önce sinovyal sıvıya alıştırmalı mıyız?Bir mililitrelik insan eklem kondrositleri veya hücre blokları flakonunu, ılık suyun içinde bir dakika boyunca çözdürerek hazırlayın. Ardından, hücre bloklarını iki mililitre ısıtılmış kondrosit büyüme medyası içeren bir flakonla karıştırın. DMSO içeren dondurma medyasını uzaklaştırmak için hücreleri 3000 RPM'de üç ila beş dakika boyunca pelletleyin, süpernatantı atın ve hücreleri yedi mililitre kondrosit büyüme medyası içinde yeniden süspande edin.Ardından, hücreleri 10 santimetrelik bir plağa aktarın ve hücreler konfluen olana kadar kültürleyin. HACK'lar üç veya dörtten daha yüksek olmayan bir pasaj sayısında kullanılmalıdır. Konfluen hale geldiklerinde, HACK'ları PBS yerine sodyum klorür çözeltisi ile yıkayın.Ardından, 0,5 mL standart tripsin EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri tripsinize ederek toplayın. Hücreler ayrıldıktan sonra, onları santrifüjle çöktürün; böylece 3D enkapsülasyona hazır hale geleceklerdir. Peletlenmiş hücreleri uygun bir pipetle alarak süpernatanı uzaklaştırın ve ardından hücreleri mililitre başına 800.000 hücre yoğunluğunda %1,2'lik bir aljinat çözeltisi içinde süspande edin.Şimdi, hac alginat çözeltisinin hacminin beş katı miktarında bir kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın. Hac alginat hazırlanırken çözeltiyi yavaşça karıştırmaya devam edin. Hac alginat çözeltisini, 22 gauge iğne takılmış 12 mililitrelik bir şırıngaya pipetle aktarın.Kalsiyum klorür hazır olduğunda, şırınga ucunu kalsiyum klorür çözeltisinin yüzeyinin yaklaşık altı inç üzerinde tutun. Şırınganın yüksekliği tamamdır. Kalsiyum klorür çözeltisi gerçekten önemlidir.Yeterince yüksekte tutmazsanız, boncuklar küresel ve şekilli olmaz. Ardından alginat karışımını ekleyin. Damla damla. Tipik olarak, sonuçta oluşan boncuklar iki milimetre çapında ve boncuk başına yaklaşık 10⁴ hücre içerir.Boncukların bütünlüğünü artırmak için, boncukların çözelti içinde 20 ila 25 dakika boyunca karıştırılmasına izin verin. Karıştırma işlemi tamamlandığında, boncukların çökmesini bekleyin ve kalsiyum klorür çözeltisini dekante edin. Ardından, boncukları, hacimlerinin yaklaşık iki ila üç katı miktarındaki sodyum klorür çözeltisi ile iki ila üç kez yıkayın.Filtre kullanmak yerine, yıkama solüsyonu değişimleri arasında boncukların çökelmesine izin vererek onları nemli tutun. Kalsiyum klorür yıkamalarını, bir yıkama ve kondrosit diferansiyasyon medyumu ile takip edin. Ardından bir spatula kullanarak boncukları kültür kaplarına aktarın ve onları kondrosit medyumuna geçirmeden önce 48 saat boyunca kondrosit büyüme medyumunda kültüre edin.Sinovyal sıvı içeren farklılaşma ortamı için sinovyal sıvı, toplandıktan hemen sonra hazırlanmalıdır. Taze sinovyal sıvıyı 15 mililitrelik tüplere aktarın ve vakit kaybetmeden 3000 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatan temiz sinovyal sıvıdır; optimal sinovyal sıvı konsantrasyonu belirlenene kadar eksi 80 derece Celsius'ta saklanmak üzere sıvıyı 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine paylaştırın.Sinovyal sıvı ve kondrosit farklılaşma ortamının, sabit askorbik asit ve kalsiyum klorür konsantrasyonu içeren farklı hacimsel oranlarda oluşturulduğu farklı kültür ortamları kullanın. Plakaları 37 °C'lik bir inkübatör içindeki sarsıntılı platforma yerleştirin. Eski ortamları uzaklaştırmadan önce, her iki ila üç günde bir ortamları değiştirin.Viskozitesini azaltmak ve aynı zamanda boncuk bütünlüğünü güçlendirmek için kalsiyum klorür çözeltisi ile seyreltin. Ardından, plakalardan yavaşça pipetle çekin. Boncuklar, proliferasyon matriks üretimine ve deneyin amaçlarına bağlı olarak, hasat edilmeden önce dört haftaya kadar kültüre edilebilir.Gen ekspresyonu veya histolojik analiz için alginat boncuklardan dokular hasat edilirken, gen ekspresyonu analizi için alginat boncukları filtre kullanmadan kalsiyum klorür çözeltisi ile üç kez yıkayın. Kondrositleri, boncukların hacminin dört ila beş katı hacmindeki sodyum sitrat içerisine daldırarak izole edin. Karışımı 20 ila 30 dakika boyunca çalkalayın ve ardından hücreleri 15 mililitrelik tüplerde santrifüjleyerek çöktürün.Süpernatanı uzaklaştırın, hücre peletini konvansiyonel bir kitin hücre lizis tamponunda yeniden süspande edin ve fiksasyon için yıkanmış boncukları hazırlamak amacıyla standart RNA saflaştırma protokolü ile devam edin. Kalsiyum klorür yıkamalarını, gece boyunca Wash Inc. Chondro diferansiyasyon medyumu ile takip edin.Boncukları, 4 °C'de 15 dakikadan fazla süreyle 2 mL %70 etanol içerisinde fikse edin ve DAPI boyama için histolojik analize geçin. Alginat boncukları, hafif sallama altında bir saat boyunca DAPI solüsyonunda inkübe edin. Ardından, alginat boncuklarını floresan mikroskobunda görüntülemeden önce kalsiyum klorür solüsyonu ile üç kez yıkayın.Boncuklar ayrıca Ian Blue ve h ve e boyaması için kesitlenebilir; dappy ile boyanmış alginat boncukların histolojik kesitlerinin brightfield görüntülerle üst üste bindirilmesi, sinovyal sıvı içermeyen medyumdan tamamen sinovyal sıvı tabanlı medyuma kadar tüm koşullar altında kültüre edilen boncuklar içinde hücrelerin homojen bir dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. 21 günlük kültür süresinin sonunda, önceki raporlarla tutarlı olarak, osteoartriti olan altı hastadan toplanan ve sinovyal sıvı içinde kültüre edilen insan eklem kondrositlerinden gen ekspresyonu ölçülmüştür. Sıfırıncı gün kondrositleri, kıkırdak matriks genlerini minimal düzeylerde eksprese etmiştir; kondrositlerin kondrosit diferansiyasyon medyumu veya sinovyal sıvı ile desteklenmiş medyum ile 3D kültürü, kollajen iki, acan ve MMP 13 kıkırdak gen ekspresyonunu anlamlı derecede artırmıştır ki bu durum kondrosit red diferansiyasyonuna işaret eder.21. güne gelindiğinde, ortamdaki sinovyal sıvı yüzdesinin artırılması, kıkırdak matriks belirteçlerinde benzer seviyelerle sonuçlanmıştır. %100 sinovyal sıvı içerisinde kültüre edilen kondrositlerde kolajen iki ve ANDCAN mRNA ekspresyonu, yalnızca ortamda kültüre edilenlere kıyasla, kıkırdak yıkıcı enzim MMP 13 mRNA ekspresyonunda bir azalma bile göstermiştir. İlginç bir şekilde, hücre ölümü göstergesi olan kaspaz üç ekspresyon seviyesi, sinovyal sıvı oranlarının artmasıyla kademeli olarak azalmış ve bu durum, sinovyal sıvı ile kültür yapmanın apoptoz seviyelerini düşürdüğünü düşündürmüştür.Bu nedenle, insan eklem kondrositlerinin ve yüksek düzeyde sinovyal sıvının 3B bir ortamda kültüre edilmesi uygulanabilir bir teknolojidir. Uzmanlaşıldığında, enkapsülasyon tekniğinin tamamlanması bir saatten az sürebilir. Besiyeri değişimleri arasında boncukların iyice yıkandığından emin olmalısınız.Ayrıca, pipet kullanırken boncuklara zarar vermemeye dikkat etmelisiniz.

a-3d-system-for-culturing-human-articular-chondrocytes-synovial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kondrositler tarafından kıkırdak ekstraselüler matriks biyosentezi mekanik uyaranlara uygulama etkilenebilir. Bu yöntem, 3D yapıları ve kondrosit metabolizması bağlı değişikliklerin değerlendirilmesi kapsüllü kondrositler dinamik basınç suşların uygulama tekniği anlatılmaktadır.

Kondrosit-agaroz Hidrojeller mekanik stimülasyonu

Bu yazıda anlatılan yöntemleri eşzamanlı UV polimerizasyon ile bir bioprinter içine ticari bir mürekkep püskürtmeli yazıcı dönüştürmek için nasıl gösterir. Yazıcı hücreleri ve biyomalzeme 3D doku yapısı oluşturmak yeteneğine sahiptir. Burada gösterilen çalışma 3D neocartilage inşa.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Kıkırdak onarımı, karşılanmamış bir tıbbi zorluğu temsil eder ve insan eklem kıkırdağını tasarlamak için hücre temelli yaklaşımlar umut verici bir çözümdür. Burada, insan eklem kondrositlerinin genişlemesi ve olgunlaşması için ideal bir araç olarak üç boyutlu (3D) biyomimetik hidrojelleri tanımlıyoruz.

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Bu makalede, kondrosit sıkıştırma için pnömatik olarak mikroakışkan bir cihaz imal etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı yöntemler sağlanmıştır.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

Bu protokol, insan eklem kıkırdağından kondrositlerin, Fibronektin Adezyon Testinden türetilmiş Kondroprojenitörlerin (FAA-CP'ler) ve Göçmen Kondroprojenitörlerin (MCP'ler) izolasyonunu detaylandırır. Bu hücreleri izole etmek ve karakterize etmek için enzimatik sindirim, fibronektin yapışması ve migrasyon bazlı testleri kapsar.

Fibronektin Adezyonu ve Migrasyon Testi Kullanılarak Kondrosit ve Kondroprojenitörlerin İzolasyonu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Sinovyumda akut iltihap, bulaşıcı ve yapısal değişiklikleri değerlendirebilen insan ex vivo transwell sistemi geliştirdik.

Korunmuş fonksiyon ve mimariyle ex vivo insan sinovyal dokusu kullanılarak sinovitin klinik öncesi modeli

Keşfedin insan eklem kondrositleri için sinovya sıvısı kullanan 3D kültür sistemini. Bu yöntem, kıkırdak rejenerasyonu ve artrit tedavisi araştırmalarında uzun süreli hücre canlılığı sağlar.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Daha fazla video keşfet