Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması
11 Mart 2012
Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.
Kütle kıvırma protokolü, izotopik metilasyon ve maldi kütle spektrometresi kullanarak lizin demetilaz aktivitesini ölçmeyi, önce metillenmiş lizin içeren peptitler üzerinde enzim katalizli demetilasyon reaksiyonlarını gerçekleştirmeyi amaçlar. Kalıntılar daha sonra demetilaz reaksiyonunun peptit ürünlerini döteryumlu formaldehit ile kimyasal olarak metilleştirir, maldi ile aynı şekilde iyonize olan düzgün metillenmiş peptitler üretir, her bir peptit türünü çoklu kütle spektrometresi ile nicelleştirmeye devam eder ve izotopik örtüşmeyi hesaba katar. Un mono boya ve trimm metillenmiş peptitlerin nispi miktarlarını tanımlamak için, kütle kıvranması sonuçları, kütledeki değişikliklere bağlı olarak her bir demetilaz reaksiyon ürününün nispi miktarlarını belirler.
Bu tekniğin rutin küflü kütle spektrometresi gibi mevcut yöntemlere göre birincil avantajı, kütle skorunun farklı metillenmiş peptitler arasındaki iyonlaşma farklılıklarını açıklamasıdır. Bu yaklaşım için ilk olarak, izotopik olarak ağır asetik anhidrit kullanarak histon asetilasyon seviyelerini ölçmek için bir yöntem geliştirdiğimizde aklımıza geldi. Bu tekniğin zorluğu, peptit izotopik zarfların üst üste binmesiyle karmaşıklaşabilen tepe alanı verilerinin çıkarılmasıdır.
Demetilaz reaksiyonu için, 125 nanogram rekombinant lizin spesifik demetilaz bir enzimi, 0.25 mikrogram biyotinile dimetil hison H üç peptit ile 20 mikrolitre demetilaz tamponunun nihai hacminde birleştirdi. Ayrıca, LSD bir enzim içermeyen 0.25 mikrogram peptit içeren bir kontrol numunesi hazırlayın, reaksiyonu ve kontrol tüplerini 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. R'yi hazırlamak için iki adet 20 mikron gözenekli boncuk hazırlamak için eşit hacimlerde boncuk ve metanolü karıştırın.
Daha sonra 10 hacim TFA formik asit ekleyin, her numuneye sekiz mikrolitre gözenekli boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayın. Bu arada, iki C 18 fermuar ucunu koşullandırın. 20 mikrolitre %0,1 TFA ile iki kez, %70 aseto nitril %0,1 TFA ile dört kez ve %0,1 TFA ile dört kez tekrar pipetleme.
Ardından, iki örneği şartlandırılmış fermuar uçlarına yükleyin. Bir pipetleyici ile hacmi C 18 reçinesinden geçirin. Her iki numunenin toplam hacmi fermuar uçlarından itilene kadar tekrarlayın.
Ardından, fermuar uçlarını 20 mikrolitre %0.1 TFA elute numunesi ile 40 mikrolitre illüzyon tamponunda iki kez yıkayın, bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurumaya devam edin. İlk olarak, numuneyi 100 mikrolitre 50 milimolar fosfat tamponu pH 7.4 içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra sekiz mikrolitre delik dimetil amin ve 16 mikrolitre değeri düşmüş formaldehit ekleyin.
Dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sıkıcı dimetil lamine ve döteryumlu formaldehit ekleyerek indirgeyici metilasyonu tekrarlayın ve iki saat inkübe edin. Üçüncü kez, sıkıcı dimetil lamine ekleyin ve 15 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Reaksiyonu 12.5 mikrolitre bir molar tris ile söndürün. pH 7.4, bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurumaya devam edin. İlk olarak, kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerini 100 mikrolitre 50 milimolar fosfat tamponu pH 7.4'te askıya alın.
Şimdi kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerine sekiz mikrolitre gözenekli boncuk ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi fermuar uçlarında toplayın. İki mikrolitrelik hacimlerde bir MALDI numune plakasına boşaltın ve kristalleşmeye kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Numuneleri kütle spektrometresi ile analiz etmeye devam edin.
Spectro dosyalarını çalışma yazılımında açın ve M over Z yazılımına aktarın. Tandem kütle spektrometresi ile reaksiyon ürünlerini daha fazla doğrulayın. İlk olarak, kontrol numunesi için mono izotopik tepe noktasına göre karbon 13 C iki ve karbon 13 C dört izotopun tepe alanı oranını belirleyin.
Her modifikasyonda mevcut olan nispi peptit miktarını ölçmek için bu hesaplanan oranları kullanın. Demetilaz reaksiyon örneğinin durumu. LSD bir enzimi, lizin demetilasyonunun kütle kıvranması miktar tayininde etkili bir şekilde kullanılabilir.
Kontrol reaksiyonu indirgeyici metilasyona uğramadığından, bu peptit için tipik izotopik zarfı gösterir Elde edilen tepe alanları, karbon 13 C iki ve karbon 13 C dörtte bulunan peptitin arka plan oranlarını belirler. İzotopik durumlar, kontrol reaksiyonu için kütle spektrumundan tepe alanları, her bir modifikasyon durumunda mevcut olan nispi peptit miktarının nicelleştirilmesine izin verir. Demetilaz reaksiyonunda, bu kontrol ve demetilaz reaksiyonlarından elde edilen tepe alanları, %33.7 dimetil lizin 4 42 %0.3 monometil lizin dördü ve %24 metillenmemiş lizin dördü belirler.
Bu kütle skuam yaklaşımı, histon lizin kalıntılarının demetilasyonunun çeşitli hastalıklara nasıl katkıda bulunduğu gibi histon epigenetiği alanına ilişkin önemli bilgiler sunar. Bu metilasyon testi, demetilazları incelemek için uygulanmış olsa da, metil transferazları incelemek için de kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, MALDI kütle spektrometrisi ve indirgeyici metilasyon kimyası kullanarak lizin demetilaz aktivitesini kantitatif olarak ölçmek için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, izotopik etiketleme yoluyla lizin metilasyon seviyelerindeki değişiklikleri ölçmeye olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Kütle Spektrometresi
Arka Plan
- Lizin metilasyonu, translasyon sonrası modifikasyonun kritik bir parçasıdır.
- Demetilaz aktivitesini anlamak, epigenetik araştırmalar için önemlidir.
- Mevcut yöntemler, metilasyonlu peptitlerdeki iyonizasyon farklılıklarını hesaba katmayabilir.
- Bu çalışma, histon asetilasyonunu ölçen önceki çalışmalar üzerine kuruludur.
Çalışmanın Amacı
- Lizin demetilaz aktivitesini kantitatif olarak ölçmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Metilasyon değişikliklerini tespit etmede kütle spektrometrisinin doğruluğunu artırmak.
- Biyolojik sistemlerde lizin metilasyonunun dinamikleri hakkında içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Metilasyonlu lizin peptitleri üzerinde enzim katalizli demetilasyon reaksiyonları.
- Demetilaz reaksiyon ürünlerinin ötelenmiş formaldehit ile kimyasal metilasyonu.
- Kantifikasyon için MALDI kütle spektrometrisinin kullanımı.
- Göreceli peptit miktarlarını belirlemek için izotopik üst üste binmenin analizi.
Ana Sonuçlar
- Modifiye edilmemiş ve metilasyonlu peptit türlerinin başarılı şekilde kantitatif analizi.
- Yöntemin geleneksel kütle spektrometrisine göre avantajlarının gösterimi.
- Tepe alanı veri çıkarımı ile ilgili zorlukların belirlenmesi.
- Karşılaştırmalı analiz yoluyla yaklaşımın doğrulanması.
Sonuçlar
- Yöntem, lizin metilasyonunun dinamiklerini incelemek için yeni bir yaklaşım sunar.
- Biyolojik bağlamlarda demetilaz aktivitesinin anlaşılmasını artırır.
- Gelecek uygulamaları, epigenetik ve proteomik gibi çeşitli alanlara uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of lysine demethylase activity is critical for epigenetic target validation and lead identification in drug discovery. The MassSQUIRM method addresses a key limitation of existing assays by enabling direct comparison of methylation states through isotopic standardization, thereby improving predictive confidence in mechanistic de-risking of epigenetic targets. This supports early discovery decisions by providing reproducible, quantitative readouts for target engagement and pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying demethylase activity on defined peptide substrates.
- Operational Value: Provides a standardized method to compare un-, mono-, di-, and tri-methylated lysine states, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative activity data that correlates with target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates uniformly ionizable peptides via reductive methylation, enabling reliable MALDI-MS quantification across methylation states.
- Scalability: Compatible with plate-format adaptation for medium-throughput screening of compound libraries against demethylase targets.
- Reproducibility: Corrects for differential ionization of methylated peptides, ensuring consistent quantitative outputs across experiments and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with disease-relevant systems by quantifying demethylase activity in histone and non-histone protein contexts.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal tracking of target modulation in preclinical models through quantitative methylation state resolution.
- Biomarker Alignment: Facilitates evaluation of methylation changes as potential pharmacodynamic biomarkers in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The MassSQUIRM method fits within the early discovery continuum, connecting target validation through quantitative biochemical assays to lead identification and preclinical evaluation by providing scalable, reproducible activity measurements.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying enzyme-specific demethylation activity on synthetic peptide substrates.
- Screening: Enables assay standardization and quantitative readouts for compound screening campaigns targeting lysine demethylases.
- Analytics: Delivers isotopic peak area ratios that allow direct comparison of modification states, facilitating data-driven decision-making in hit-to-lead progression.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling measurement of demethylase activity in disease-relevant peptide and protein substrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for epigenetic target characterization across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Quantitative assessment of demethylase activity, reduction of ionization bias in methylation state comparison, and improved target confidence.
- Operational Value: Standardization of peptide ionization, reproducibility across MALDI-MS platforms, and scalability to higher-throughput formats.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on quantitative target modulation data, reducing biological risk in epigenetic programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of epigenetic targets through reliable activity profiling and mechanistic insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology, peptide chemistry, and MALDI mass spectrometry data interpretation.
- Dependence on access to MALDI-MS instrumentation and reagents for isotopic reductive methylation (deuterated formaldehyde, borane dimethylamine).
- Necessitates standardized protocols for peptide synthesis, enzyme reaction setup, and isotopic labeling consistency across teams.
- Adaptation considerations include substrate specificity and compatibility with diverse peptide sequences beyond histone H3.
- Practical limitations include challenges in peak area deconvolution due to isotopic envelope overlap, requiring careful spectral analysis and software tools.
