Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Kütle kıvırma protokolü, izotopik metilasyon ve maldi kütle spektrometresi kullanarak lizin demetilaz aktivitesini ölçmeyi, önce metillenmiş lizin içeren peptitler üzerinde enzim katalizli demetilasyon reaksiyonlarını gerçekleştirmeyi amaçlar. Kalıntılar daha sonra demetilaz reaksiyonunun peptit ürünlerini döteryumlu formaldehit ile kimyasal olarak metilleştirir, maldi ile aynı şekilde iyonize olan düzgün metillenmiş peptitler üretir, her bir peptit türünü çoklu kütle spektrometresi ile nicelleştirmeye devam eder ve izotopik örtüşmeyi hesaba katar. Un mono boya ve trimm metillenmiş peptitlerin nispi miktarlarını tanımlamak için, kütle kıvranması sonuçları, kütledeki değişikliklere bağlı olarak her bir demetilaz reaksiyon ürününün nispi miktarlarını belirler.

Bu tekniğin rutin küflü kütle spektrometresi gibi mevcut yöntemlere göre birincil avantajı, kütle skorunun farklı metillenmiş peptitler arasındaki iyonlaşma farklılıklarını açıklamasıdır. Bu yaklaşım için ilk olarak, izotopik olarak ağır asetik anhidrit kullanarak histon asetilasyon seviyelerini ölçmek için bir yöntem geliştirdiğimizde aklımıza geldi. Bu tekniğin zorluğu, peptit izotopik zarfların üst üste binmesiyle karmaşıklaşabilen tepe alanı verilerinin çıkarılmasıdır.

Demetilaz reaksiyonu için, 125 nanogram rekombinant lizin spesifik demetilaz bir enzimi, 0.25 mikrogram biyotinile dimetil hison H üç peptit ile 20 mikrolitre demetilaz tamponunun nihai hacminde birleştirdi. Ayrıca, LSD bir enzim içermeyen 0.25 mikrogram peptit içeren bir kontrol numunesi hazırlayın, reaksiyonu ve kontrol tüplerini 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. R'yi hazırlamak için iki adet 20 mikron gözenekli boncuk hazırlamak için eşit hacimlerde boncuk ve metanolü karıştırın.

Daha sonra 10 hacim TFA formik asit ekleyin, her numuneye sekiz mikrolitre gözenekli boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayın. Bu arada, iki C 18 fermuar ucunu koşullandırın. 20 mikrolitre %0,1 TFA ile iki kez, %70 aseto nitril %0,1 TFA ile dört kez ve %0,1 TFA ile dört kez tekrar pipetleme.

Ardından, iki örneği şartlandırılmış fermuar uçlarına yükleyin. Bir pipetleyici ile hacmi C 18 reçinesinden geçirin. Her iki numunenin toplam hacmi fermuar uçlarından itilene kadar tekrarlayın.

Ardından, fermuar uçlarını 20 mikrolitre %0.1 TFA elute numunesi ile 40 mikrolitre illüzyon tamponunda iki kez yıkayın, bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurumaya devam edin. İlk olarak, numuneyi 100 mikrolitre 50 milimolar fosfat tamponu pH 7.4 içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra sekiz mikrolitre delik dimetil amin ve 16 mikrolitre değeri düşmüş formaldehit ekleyin.

Dört santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sıkıcı dimetil lamine ve döteryumlu formaldehit ekleyerek indirgeyici metilasyonu tekrarlayın ve iki saat inkübe edin. Üçüncü kez, sıkıcı dimetil lamine ekleyin ve 15 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Reaksiyonu 12.5 mikrolitre bir molar tris ile söndürün. pH 7.4, bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurumaya devam edin. İlk olarak, kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerini 100 mikrolitre 50 milimolar fosfat tamponu pH 7.4'te askıya alın.

Şimdi kontrol ve demetilaz reaksiyon örneklerine sekiz mikrolitre gözenekli boncuk ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi fermuar uçlarında toplayın. İki mikrolitrelik hacimlerde bir MALDI numune plakasına boşaltın ve kristalleşmeye kadar oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Numuneleri kütle spektrometresi ile analiz etmeye devam edin.

Spectro dosyalarını çalışma yazılımında açın ve M over Z yazılımına aktarın. Tandem kütle spektrometresi ile reaksiyon ürünlerini daha fazla doğrulayın. İlk olarak, kontrol numunesi için mono izotopik tepe noktasına göre karbon 13 C iki ve karbon 13 C dört izotopun tepe alanı oranını belirleyin.

Her modifikasyonda mevcut olan nispi peptit miktarını ölçmek için bu hesaplanan oranları kullanın. Demetilaz reaksiyon örneğinin durumu. LSD bir enzimi, lizin demetilasyonunun kütle kıvranması miktar tayininde etkili bir şekilde kullanılabilir.

Kontrol reaksiyonu indirgeyici metilasyona uğramadığından, bu peptit için tipik izotopik zarfı gösterir Elde edilen tepe alanları, karbon 13 C iki ve karbon 13 C dörtte bulunan peptitin arka plan oranlarını belirler. İzotopik durumlar, kontrol reaksiyonu için kütle spektrumundan tepe alanları, her bir modifikasyon durumunda mevcut olan nispi peptit miktarının nicelleştirilmesine izin verir. Demetilaz reaksiyonunda, bu kontrol ve demetilaz reaksiyonlarından elde edilen tepe alanları, %33.7 dimetil lizin 4 42 %0.3 monometil lizin dördü ve %24 metillenmemiş lizin dördü belirler.

Bu kütle skuam yaklaşımı, histon lizin kalıntılarının demetilasyonunun çeşitli hastalıklara nasıl katkıda bulunduğu gibi histon epigenetiği alanına ilişkin önemli bilgiler sunar. Bu metilasyon testi, demetilazları incelemek için uygulanmış olsa da, metil transferazları incelemek için de kullanılabilir.