Kök Hücre yüklü Chitosan Mikrokürelerin teslimi için bir Kollajen Hidrojel oluşturma

Bu protokol, kök hücreleri kitosan mikrokürelerinden bir kollajen jel iskelesine, hasada ve kültüre iletmek için in vitro bir strateji sunar. Birincil adiposit kök hücreleri daha sonra emülsifiye olur ve kitosan mikrokürelerinin bir preparatını geri kazanır. Daha sonra, kök hücreleri kitosan mikroküreleri üzerine tohumlayın ve CS yüklü bir CSM üretmek için sekiz mikron gözenek boyutunda bir membran kültür plakası ekinde kültürleyin, son olarak mikroküre dağıtım sistemini üç boyutlu bir kollajen jel iskelesi ile karıştırın.

Sonuç olarak, bu CSM sistemi rejeneratif tıpta ve ilaç dağıtımında kullanım potansiyeli sunar. Bu tekniğin hücre enjeksiyonu veya mikroenkapsülasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, hücrelerin bir taşıyıcı materyale yapışma ve ilk uygulamadan sonra devam etme yeteneğidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, esan mikroküreciklerinin doğal bir statik yüke sahip olması nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Ve hücreleri bir mikroküre yatağına yüklemek, onları rahatsız etmeden zor olacaktır. Bir sargıdan eksize edin ve yıkayın, perineal ve epidermal yağ dokusunu kıyın, daha sonra% 1 FBS içeren 25 mililitre HBSS'ye bir ila iki gram aktarın. Santrifüjlemeden sonra, serbest yüzen yağ dokusu tabakasını 125 mililitrelik bir erlenmeyer şişesine toplayın.

25 mililitre kollajenaz tip iki ekleyin ve reaksiyonu bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Şimdi yağ ve yağ tabakasının altındaki sıvı fraksiyonu dikkatlice çıkarın ve 170 mikronluk naylon ağ filtrelerden sırayla süzün. Hücreleri 25 mililitre ile iki yıkamadan sonra santrifüjleme ile hasat edin.

HBSS Resus, peleti 30 mililitre takviye edilmiş mesen pro büyüme ortamında askıya alır. Saflaştırılmış adipoz türetilmiş kök hücreleri iki T 75 kültür şişesine bölün ve A SC preparatını 37 santigrat derecede %5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde çoğaltın. Bu CSM protokolü, iyonik bir koer tekniği kullanan bir yağ içinde su emülsifikasyon işlemidir.

Kararlı su ve yağ emülsiyonuna bir saat boyunca zıt yönlerde aynı anda baş üstü ve manyetik karıştırma kullanarak 100 mililitre bir yağ fazı karışımında altı mililitre sulu bir kitosan çözeltisi emülsifiye edin, dört saat boyunca her 15 dakikada bir n sekizli olarak 1.5 mililitre% 1 potasyum hidroksit ekleyin. İyonik çapraz bağlama reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, yağ fazını yavaşça boşaltın ve küreleri hemen 100 mililitre asetona ekleyin. Yağ fazı tamamen çıkana kadar küreleri asetonla yıkayın.

Daha sonra kurtarılan küreleri bir vakumda kurutun. Kurutma, partikül boyutu analizörünü kullanarak ortalama CSM partikül boyutunu, miligram başına yüzey alanını ve birim kübik hacmi belirler. Kalan tuzları çıkarmak için CSM'yi steril suyla üç kez yıkamaya devam edin.

Şimdi, CSM preparatını 50 mililitrelik bir cam tüpte hücre deneylerinde kullanılmak üzere mutlak alkolle sterilize edin, beş miligram mikroküreyi bir mililitre% 0.5 TNBS çözeltisi ile karıştırın, 40 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Daha sonra üç mililitre altı normal hidroklorik asit ekleyin ve iki saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığına soğuttuktan sonra beş mililitre deiyonize su ve 10 mililitre Ethel Ether ekleyin.

Serbest TNBS'yi çıkarmak için, sulu fazın beş mililitrelik bir alikotunu çıkarın ve ortam sıcaklığına soğuduktan sonra kalan eteri buharlaştırmak için bir su banyosunda 15 dakika boyunca 40 santigrat dereceye ısıtın. Bir spektrofotometre ile 15 mililitre su ile seyreltin. Hazırlanan kitosan mikrokürelerinin emilimini TNBS'yi boş olarak kullanarak 345 nanometrede ölçün.

Ayrıca CSM hazırlığı için kullanılan kitosanı da ölçün. Şimdi, CSM'nin serbest amino gruplarının sayısını, kitosandaki toplam amino grubu sayısına göre hesaplayın. Sterilize edilmiş CSM'nin beş miligramını gece boyunca steril HBSS'de dengeleyin.

CSM'yi 24 kuyulu kültür plakası için sekiz mikronluk bir membran ekine aktarın. CSM yerleştikten sonra, HBSS'yi dikkatlice aspire edin. Şimdi kesici ucun iç kısmına 300 mikrolitre büyüme ortamı ve ek parçanın dışına 700 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin. Resus.

Adipoz türevli kök hücreleri 200 mikrolitre büyüme, ortam ve tohum içinde kültür plakası içindeki CSM üzerinde askıya alın. 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde 24 saat boyunca inkübe edin. SC yüklü CSM'yi, insert membranına göç eden hücreleri rahatsız etmeden steril bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Şimdi kalan ortamı çıkarın ve her tüpe 250 mikrolitre taze büyüme ortamı ekleyin. Mililitre MTT çözeltisine 25 mikrolitre beş miligram ekleyin ve dört saat inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 250 mikrolitre dimetil sülf oksit girdabı ekleyin, böylece kompleks santrifüj formu, CSM'yi 2.700 G'de beş dakika çözündürün.

Referans olarak 630 nanometre kullanarak 570 nanometrede süpernatan absorbansını ölçün. Bilinen canlı A SC sayılarından elde edilen absorbans değerine göre CSM ile ilişkili hücre numarasını belirlemeye devam edin. SC yüklü bir CSM'nin beş miligramını mililitre başına 7.5 miligram ile karıştırın. Sıçanlardan elde edilen bir kollajen yazın.

Kuyruk tendonu, iki normal sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 6.8'e ayarlayın ve bir kültür plakasına dökün. Fibrilatlamak için yerleştirin, şimdi 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve 30 dakika inkübe edin. Kuluçka süresinin her iki gününde bir kollajen A-S-C-S-M jelleri için ortamı yenilemeye devam edin.

Ayrıca standart mikroskopi tekniklerini kullanarak hücrelerin CSM'den jele geçişini ve salınımını izleyin. Aşağıdaki örnek, adipoz türevli kök hücreleri kitosan mikrokürelerinden bir kollajen jel iskelesine iletmek için in vitro stratejiyi açıklamaktadır. SEM ve TEM görüntüleri, tek tip boyutta gözenekli bir CSM hazırlığını gösterir.

Mikrokürelerin birincil adipoz türevli kök hücrelerle inkübasyonu, miligram CSM kalsiyum başına 4.000 hücreyi gösterir. Bir SC'nin boyanması, filopodia'nın mikrosferin gözenekli yarıklarına uzanmasıyla CSM üzerine yayılmayı gösterir. Hücre yüklü CSM kollajen jeli ile karıştırıldığında, hücreler jelin içine göç eder ve zamanla takip edilebilir.

Bu tekniğin etkileri hemen masif ve kronik doku kaybının tedavisine kadar uzanır. Bununla birlikte, bu tedavi rejimi, farklı seviyelerde yumuşak ve kalp dokusu kayıplarını tedavi etmek için kullanılan çeşitli hücreler ve/veya biyomateryallerle entegre olma çok yönlülüğü nedeniyle çok daha fazla potansiyele sahiptir. Bu yöntemin konak hücre iletimi hakkında bilgi sağlayabileceğinden şüphe edin.

Enjektabllar, terapötik ilaçların verilmesi, hem hücrelerin hem de terapötik ilaçların birlikte verilmesi için hibrit sistemlerin geliştirilmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.