Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.

Bu prosedürün genel amacı, kök ur nematodları ile enfekte olmuş bitkileri taramaktır. İlk olarak, kumlu toprakta veya büyüme torbalarında sağlıklı fideler yetiştirin. Ardından, kök ur nematodlarının yüksek düzeyde enfekte olmuş ikinci evre juvenilerinden oluşan bir inokülum hazırlayın.

Ardından fideleri uygun şekilde inoküle edin ve enfekte edin. Son olarak, konukçu kök sistemindeki nematod yumurta kütlelerinin gelişimini değerlendirin. Kökleri olan bitkilerle, nematodlarla değil, yüksek ve düşük kapasiteli taramaları göstereceğiz.

Yüksek kapasiteli sistemin temel avantajları, bitki büyümesi için sınırlı alan gereksinimi ve enfeksiyon değerlendirmesinin kolaylığıdır. Bu yaklaşımlar; tekrarlanabilir ve tekdüze bir enfeksiyona, yani bitki köklerinin nematod enfeksiyonuna ve dolayısıyla bitkinin konukçu durumunun daha iyi değerlendirilmesine olanak tanıyacaktır. Genel olarak, kökleri nematodlar ile değerlendirme konusunda deneyimsiz kişiler, kökleri nematodlarla enfekte etmek için uygun gelişim aşamasını kullanmadıkları için zorluk yaşayabilirler.

Ayrıca, genellikle düşük enfektiviteye sahip olan birkaç günlük enfektif evre juvenilyle kullanılarak, prosedürün uygulanması lisans ve lisansüstü öğrencilere gösterilecektir. Laboratuvarımda, saksı deneyleri için büyüme keselerinde tarama yapma prosedürünü göstereceğim. Domates tohumlarını, Sunshine Mix gibi organik maddece zengin bir toprakla doldurulmuş tek bir saksıya ekin ve çimlenmeden sonra serayı 22 ile 28 °C arasında tutun.

Çimlenmeden yaklaşık iki hafta sonra, iki gerçek yaprak aşamasındayken haftada bir kez Miracle-Gro ile gübreleyin; tekil fideleri %90 kum ve %10 organik madde içeren steril kumlu toprakla doldurulmuş saksılara şaşırtın. OsmoCoat yavaş salınımlı gübre ekleyin ve iki hafta boyunca 22 ila 28 °C sıcaklıktaki bir serada tutun. Haftada bir kez Miracle-Gro ile gübrelemeye devam edin.

Yüksek kapasiteli taramalar için, bitki tohumlarını kumlu toprak içeren tepsilere doğrudanlekin. Çimlenme gerçekleşene kadar plastik filmle örtün ve daha önce açıklanan şekilde muhafaza edin. Çimlenmeden sonra, Osmo coat yavaş salınımlı gübre ekleyin ve haftada bir kez miracle grow ile gübreleyin; tohumları, bir inkübatörde 25 ila 28 °C'de tutulan ve birkaç kat Kim White kağıdı ile kaplanmış bir Petri kabında çimlendirin ve ardından fideleri bireysel poşetlere aktarın.

Alternatif olarak, tohumları doğrudan bireysel poşetlerde çimlendirmek için kağıt oluğa yerleştirin. Poşetleri, her klasöre birer tane gelecek şekilde plastik asılabilir dosyalara yerleştirin ve dosyaları bir rafa dikey konumda düzenleyin.

Rafı, 25 ila 28 derece Celsius sıcaklıkta ve 16 saat ışık, sekiz saat karanlık döngüsünün korunduğu kontrollü bir ortam odasına yerleştirin. Ekimden yaklaşık 10 ila 14 gün sonra torbaları günde bir veya iki kez ters osmoz suyu ile sulayın. Tersiyer kök uçlarına sahip yeterli bir kök sistemi geliştiğinde, fideler inokülasyon için hazır hale gelir. Yumurta ekstraksiyonuna başlamadan önce, kontaminasyonu önlemek için çalışma alanını ve tüm aletleri sıcak suyla iyice yıkayın.

Çözeltiyi geçirmek için lavaboya bir kova yerleştirin ve üst kısmına tel örgü destek konumlandırın. Yumurtaların 25 mikronluk elekte toplanması için üç eleği, gözenek boyutları yukarıdan aşağıya doğru azalan şekilde üst üste dizin. Enfekte bitkilerin üst kısımlarını kesin ve dikkatlice atın.

Bitkiyi saksıdan çıkarın ve su dolu plastik bir kovaya daldırarak kökleri yıkayın. Toprak partikülleri temizlenene kadar kökleri akan su altında daha fazla durulayın. Ardından, enfekte domates köklerinden kök ur nematod yumurtalarını ekstrakte edin.

İlk olarak, makas kullanarak kökleri küçük parçalar halinde kesin ve kazık kökü atın. Tek bir bitkiden elde edilen doğranmış kökleri kapaklı büyük bir plastik kavanoza koyun ve kökleri örtecek kadar %10'luk çamaşır suyu çözeltisi ekleyin. Kapağı kapatın ve kavanozu iki dakika boyunca çalkalayın.

Kavanozu açın, kökleri üst süzgece dökün ve püskürtme uçlu bir hortumla yıkayın. Tüm çamaşır suyu kokusu gidene kadar iyice yıkayın. Süzgecin tıkanmasını önlemek için süzgeçlerin yanlarına bir tokmakla hafifçe vurun.

Duraklatın, üstteki eleği çıkarın ve kalıntıları durulayın. Ardından ikinci eleği çıkarın ve bir su şişesinden gelen hafif bir akışla, önceki elekten gelen yumurtaları da içeren ince kalıntıları toplayın.

Kalıntıları eleğin bir yanına itin. Kalıntıları ve yumurtaları minimum miktarda su ile temiz bir behere toplayın. Kaçmış olabilecek yumurtaları toplamak için kovada biriken suyu 25 mikronluk elekten geçirin.

Su ile iyice durulayın ve aynı beherde toplayın. Temiz bir metal sepeti birkaç kat Kim wipe kağıdı ile kaplayın ve sepetin altı ile petri kabı arasında bir santimetre mesafe kalacak şekilde cam bir petri kabına yerleştirin.

Ekstrakte edilen nematod yumurtalarını kağıdın üzerine dökün. Tel sepetin içine. Tel sepetin tabanı su yüzeyine temas edecek ancak suyun içine gömülmeyecek kadar sıvı ekleyin.

Üst kısmı her gün plastik bir kapakla kapatın. Su buharlaşmasını kontrol edin ve sepetin tabanı suya değecek şekilde Petri kabına bir miktar su ekleyin. Yumurtaların kurumasını önlemek için, altı ila sekiz gün boyunca gün aşırı olarak, ikinci evre juvenileri veya J2'leri içeren suyu Petri kabından bir behere toplayın.

Kullanılmayacaksa, toplanan inokülümü laboratuvar hava kaynağı veya akvaryum pompasıyla üretilen hava kullanarak oda sıcaklığında hemen havalandırın. Bir sonraki adıma, inokülümü düşük hızda bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde karıştırarak başlayın. Toplanan nematodların üç alikvotunu kullanın.

Muhasebe işlemlerindeki J ikililerinin sayısını belirlemek için lam veya kap kullanın, ortalamayı hesaplayın ve inokülasyon için gereken hacmi belirleyin. Bunlar, mikroskop altında görüntülenen J ikilileridir.

Genellikle, saksılardaki bitki başına 3000 J twos ve fide tepsilerinde yetiştirilen bitkiler için 500 J twos kullanılır. Bitkileri inoküle etmeden önce, toprağın nemli olduğundan ancak çok ıslak olmadığından emin olun. Saksı inokülasyonu için, her domates kök sisteminin etrafındaki kuma, yaklaşık saksı derinliğinin yarısı kadar üç delik açın.

Bir kurşun kalem kullanarak, J twos'u bir pipet yardımıyla üç deliğe aktararak her bir bitkiyi inoküle edin. Ardından, tepsilerdeki yüksek verimli taramalar için delikleri kapatın. Yan kısımlarında delikler bulunan ve beş mililitrelik bir pipete yapıştırılmış, modifiye edilmiş sızdırmaz uçlu bir iğne kullanın.

J twos'u toprağa iletmek için bir pipetleyiciyi eğiniz. Bitkileri altı ila sekiz hafta boyunca 24 to 27 °C sıcaklıktaki bir serada tutunuz. Ayda iki kez miracle grow ile gübrelemeye devam ediniz.

Enfeksiyon değerlendirmesi için. Üst kısımları kesin, bitkileri saksılardan dikkatlice çıkarın ve kökleri yıkayın. Ardından, kökleri litre başına bir miligram çözeltiye daldırarak yumurta kütlelerini maviye boyayın.

15 dakika boyunca Aerio ile parlatma işlemi yapın. Kökleri suyla durulayın ve tekil kök sistemleri üzerindeki boyanmış yumurta kitlelerini sayarak değerlendirme yapın. Yumurta kitlelerini görüntülemek, nematodları saymak, inokulumu hazırlamak ve daha önce açıklandığı üzere manyetik karıştırıcı plaka üzerinde karıştırmak için aydınlatmalı bir stereo mikroskop kullanılabilir.

Keseleri askılı dosyalardan çıkarın ve yatay bir yüzeye yerleştirin. Her bir keseye, beş mililitrede 1.500 J2 inoküle edin. Kesenin plastik kapağını kaldırın ve nematodları köklerin yüzeyine eşit şekilde dağıtın.

İnokülasyondan sonra poşetleri, ışığı engellemek için koyu renkli kağıtla örtülmüş şekilde 24 saat boyunca yatay pozisyonda tutun. Ardından poşetleri, büyüme odasındaki suyun içinde bulunan asılı dosyalara geri yerleştirin. Gübreye karşı bir yanıt gözlemlenene kadar bitkilerin, yaklaşık üç gün boyunca günde bir veya iki kez yarı konsantrasyonlu Hoagland çözeltisi ile beslenmesi gerekir.

Genellikle artmış yaprak yeşilliği ve daha güçlü sürgün büyümesi görülür. Üç gün sonra, torbaları su ile nemli tutun. İnokülasyondan yaklaşık 30 gün sonra, her torbaya yaklaşık 10 ila 20 mililitre 75 miligram liter infüze edin.

Hava ile parlatma. Torbaları gece boyunca yatay pozisyonda boya ile dolu tutun. Ertesi gün torbaları boşaltın ve aydınlatmalı bir masa altında yumurta kütlelerini sayarak kök sistemlerini değerlendirin.

Burada büyütülmüş olarak gösterilenler, yaygın mavi boyalı yumurta kütleleri içeren, yoğun şekilde enfekte olmuş bir domates bitkisinin kökleridir. Tepsilerin kullanımı, küçük bir yetiştirme alanında yüzlerce bitkinin taranmasına olanak tanır. Yetiştirme torbaları ayrıca, kökleri yıkamaya gerek kalmadan, köklerin ve nematod enfeksiyonlarının hızlı ve yeterli şekilde tahribatsız değerlendirilmesine imkan sağlar.

Bu yöntem ayrıca, küçük bir büyüme alanında binlerce bitkinin yüksek verimli taranmasına olanak tanır. Burada, bir poşette yetiştirilen bir cow P bitkisinin kök sistemi, inokülasyon sonrası maviye boyanmış yumurta kütlelerini göstermektedir. Nematodlarla yapılan bitki deneylerinde enfeksiyon zamanlaması oldukça kritiktir.

Bu nedenle, enfeksiyonun sadece birkaç gün geciktirilmesi bile enfeksiyon seviyelerinin çok düşük olmasına yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bitkilerin kök ur nematodları ile nasıl enfekte edileceği ve değerlendirileceği konusunda artık iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Nematodla enfekte olmuş köklerin uygun şekilde işlenmesi gerektiğini unutmayın.

Köklerin imha edilmeden önce otoklavlanması, nematodun yayılmasını sınırlayacaktır. Ayrıca, yüksek dozlarda kullanıldığı için havayolu glisinin kullanımı sırasında dikkatli olun. Kanserojendir.

Bu nedenle, hem bu kimyasalla enfekte olmuş kökleri işlerken hem de bu kimyasalın hazırlanması sırasında eldiven kullanmanız gerekir.