JoVE Journal
Immunology and Infection

This content is Free Access.

JoVE Journal Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Kök-ur Nematod ile Yüksek ve Düşük Throughput Ekranlar Meloidogyne spp.

Full Text

28,356 Views

11:46 min

March 12, 2012

DOI: 10.3791/3629-v

Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology,University of California, Riverside

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Kök-ur nematodları ile ekran bitkiler için iki farklı yöntem tarif edilmiştir. Açıklanan yaklaşımlar ıslah programlarında bu bitkilerin kullanımı kolaylaştıran bir zarar vermeden nematodlar ile yüksek verimlilik ekranlar yer alıyor.

Transcript

Bu prosedürün genel amacı, kök düğüm nematodları ile enfekte olmuş bitkileri taramaktır. İlk olarak, kumlu toprakta veya büyüme keselerinde sağlıklı fideler yetiştirin. Daha sonra, nematodlardan değil, yüksek derecede enfekte olmuş ikinci aşama kök yavrularından oluşan bir aşı üretin.

Daha sonra fideleri uygun şekilde aşılayın ve enfekte edin. Son olarak, konak kök sistemi üzerindeki nematod yumurta kütlelerinin gelişimini değerlendirin. Nematodlarla değil, kökleri olan bitkilerin yüksek ve düşük verimli ekranlarını göstereceğiz.

Ve yüksek verimli sistemin temel avantajları, bitki büyümesi için sınırlı alana ihtiyaç duyulması ve enfeksiyonun değerlendirilmesinin kolaylığıdır. Dolayısıyla bu yaklaşımlar, tekrarlanabilir ve homojen enfeksiyon, bitki köklerinin nematod enfeksiyonu ve dolayısıyla bitkinin konukçu durumunun daha iyi değerlendirilmesi ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle, genel olarak, nematodlarla değil, kökleri olan bitkileri değerlendirmeye yeni başlayan bireylerin, kökleri nematodlarla enfekte etmek için uygun gelişim aşamasını kullanmadıkları için mücadele etmeleri muhtemeldir.

Ve ayrıca, tipik olarak düşük enfektiviteye sahip birkaç günlük enfektif evre gençleri kullanarak, prosedürü göstermek atian ve yüksek lisans öğrencisine sarılmak olacaktır. Laboratuvarımda, pot tahlilleri için büyüme torbalarında tarama prosedürünü göstereceğim. Domates tohumlarını, güneş ışığı karışımı gibi organik açıdan zengin toprakla doldurulmuş tek bir tencereye ekin, çimlenmeden sonra serayı 22 ila 28 santigrat derecede tutun.

Haftada bir kez mucize ile büyütün, çimlenmeden yaklaşık iki hafta sonra, iki gerçek yaprak aşamasında, tek tek fideleri steril kumlu toprak,% 90 kum ve% 10 organik madde ile dolu saksılara nakledin. Osmo coat yavaş salınan gübre ekleyin ve iki hafta boyunca 22 ila 28 santigrat derecede bir serada tutun. Mucize büyüme ile haftada bir kez gübrelemeye devam edin.

Yüksek verimli elekler için, tohumları doğrudan kumlu topraktaki tepsilere ekin. Çimlenene kadar streç filmle örtün ve daha önce tarif edildiği gibi koruyun. Çimlenmeden sonra, Osmo coats yavaş salınan gübreyi ekleyin ve haftada bir kez, bir inkübatörde ve 25 ila 28 santigrat derecede tutulan birkaç kat Kim White kağıdı ile kaplı bir Petri kabında mucize büyüme çimlenir tohumları ile gübreleyin ve ardından fideleri ayrı ayrı torbalara aktarın.

Alternatif olarak, tohumları doğrudan ayrı torbalarda çimlenmek için kağıt oluğuna yerleştirin. Torbaları plastik bir asılı dosya klasörüne klasör başına yerleştirin ve klasörleri bir rafa yerleştirin. Dikey konumda.

Rafı, 25 ila 28 santigrat derece sıcaklıkta ve 16 saat ışıkta tutulan kontrollü bir ortam odasına yerleştirin. Sekiz saatlik karanlık döngü, tohumlamadan yaklaşık 10 ila 14 gün sonra torbaları günde bir veya iki kez ters mosis suyu ile sulayın. Üçüncül kök uçlarına sahip yeterli bir kök sistemi geliştiğinde, fideler aşılamaya hazırdır Yumurta ekstraksiyonuna başlamadan önce, kontaminasyonu önlemek için çalışma alanını ve tüm aletleri sıcak suyla iyice yıkayın.

Toplamak, çözeltiden geçirmek için bir lavaboya bir kova yerleştirin ve üstüne bir tel örgü desteği yerleştirin. Yumurtalar 25 mikronluk elekte toplanacak şekilde, azalan açıklık boyutuna göre üç elek yukarıdan aşağıya doğru istifleyin. Enfekte bitkilerin üst kısımlarını kesin ve dikkatlice atın.

Bitkiyi saksıdan çıkarın ve su dolu plastik bir kovaya batırarak köklerini yıkayın. Toprak parçacıkları yıkanana kadar kökleri akan su altında daha fazla durulayın. Daha sonra enfekte olmuş domates köklerinden kök düğüm nematod yumurtalarını çıkarın.

İlk olarak, musluk kökünü atarak makas kullanarak kökleri küçük parçalar halinde kesin. Tek bir bitkiden doğranmış kökleri kapaklı büyük bir plastik kavanoza koyun ve kökleri kaplayacak kadar %10'luk çamaşır suyu solüsyonu ekleyin. Kapağı kapatın ve kavanozu iki dakika sallayın.

Kavanozu açın ve kökleri üst elek üzerine dökün ve buğulanma nozulu yıkamasına bağlı bir hortumla yıkayın. Tüm çamaşır suyu kokusu gidene kadar. Ve eleğin tıkanmasını önlemek için eleklerin kenarlarına hafifçe vurmak için bir tokmak kullanın.

Duraklatın, üst eleği çıkarın ve kalıntıları durulayın. Ve ikinci elek. İkinci eleği çıkarın ve bir su şişesinden hafif bir akışla son elekten yumurtaları içeren ince kalıntıları toplayın.

Kalıntıları eleğin bir tarafına taşıyın. Kalıntıları ve yumurtaları minimum miktarda su ile temiz bir behere toplayın. Kovada toplanan suyu 25 mikronluk elekten geçirerek kaçmış olabilecek yumurtaları toplayın.

Su ile iyice durulayın ve aynı beherde toplayın. Temiz bir metal sepeti birkaç kat Kim ile hizalayın. Kağıdı silin ve bir cam petri kabına yerleştirin, kabın altı ile tabak arasında bir santimetre mesafe bırakın.

Çıkarılan nematod yumurtalarını kağıda dökün. Tel sepet içinde. Tel sepetin alt kısmı su yüzeyine değecek ancak suya batırılmayacak kadar sıvı ekleyin.

Üstünü her gün plastik bir kapakla örtün. Suyun buharlaşıp buharlaşmadığını kontrol edin ve sepetin alt kısmı suya değecek şekilde Petri kabına biraz su ekleyin. Yumurtaların altı ila sekiz gün boyunca her gün kurumasını önlemek için, ikinci aşama yavruları veya J ikilerini içeren suyu Petri kabından bir behere toplayın.

Kullanılmıyorsa, toplanan aşıyı bir laboratuvar, hava beslemesi veya bir akvaryum pompası tarafından üretilen hava kullanarak oda sıcaklığında hemen havalandırın. Bir sonraki adıma, aşıyı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde düşük hızda karıştırarak başlayın. Toplanan nematodların üç alikotunu kullanın.

Muhasebede J ikilerin sayısını saymak. Slayt veya çanak, ortalamayı hesaplayın ve aşılama için istenen hacmi belirleyin. Bunlar mikroskop altında bakıldığında J ikilerdir.

Tipik olarak, saksıda bitki başına 3000 J iki ve fide tepsilerinde yetiştirilen bitkiler için 500 J iki kullanılır. Bitkileri aşılamadan önce toprağın nemli olduğundan ancak çok ıslak olmadığından emin olun. Saksı aşılaması için, her bir domates kök sisteminin etrafındaki kumda yaklaşık yarım saksı derinliğinde üç delik açın.

Bir kalem kullanarak, J ikilerini bir pipet kullanarak üç deliğe sokarak her bitkiyi aşılayın. Daha sonra, tepsilerdeki yüksek verimli eleklerin deliklerini kapatın. Yanlarında delikler bulunan, beş mililitrelik bir pipete yapıştırılmış, modifiye edilmiş, sızdırmaz uçlu bir iğne kullanın.

J twos'u toprağa vermek için bir pipetleyici boyunca eğin. Bitkileri altı ila sekiz hafta boyunca 24 ila 27 santigrat derece arasında bir serada tutun. Mucize büyüme ile ayda iki kez gübrelemeye devam edin.

Enfeksiyonun değerlendirilmesi için. Üstleri kesin ve bitkileri saksılardan dikkatlice çıkarın ve köklerini yıkayın. Daha sonra kökleri litre başına bir miligrama batırarak yumurta kütlelerini maviye boyayın.

Aerio 15 dakika boyunca parlatıyor. Kökleri suyla durulayın ve tek tek kök sistemlerinde lekeli yumurta kütlelerini sayarak değerlendirin. Yumurta kütlelerini görselleştirmeye, nematod, aşılamayı saymaya ve daha önce açıklandığı gibi manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırmaya yardımcı olmak için ışıklı bir ölüm büyüteci kullanılabilir.

Torbaları asılı klasörlerden çıkarın ve yatay bir yüzeye yerleştirin. Her poşeti beş mililitrede 1.500 J iki ile aşılayın. Torbanın plastik kapağını kaldırın ve nematodları köklerin yüzeyine eşit olarak dağıtın.

Torbaları aşılamadan sonra 24 saat boyunca yatay konumda tutun, ışığı dışarıda bırakmak için koyu renkli kağıtla örtün. Daha sonra, torbaları büyüme odası suyundaki asılı klasörlere geri koyun. Bitkilere, gübreye bir tepki gözlenene kadar yarı güçlü hoagland çözeltisi ile yaklaşık üç gün boyunca günde bir veya iki kez ihtiyaç duyulur.

Tipik olarak gelişmiş yeşillik yeşillenmesi ve daha güçlü sürgün büyümesi. Üç gün sonra, torbaları suyla nemli tutun. Aşılamadan yaklaşık 30 gün sonra, her bir poşeti yaklaşık 10 ila 20 mililitre 75 miligram litre ile infüze edin.

Aero parlatıcı. Boya ile doldurulmuş torbaları gece boyunca yatay konumda tutun. Ertesi gün, torbaları boşaltın ve ışıklı bir masa altında yumurta kütlelerini sayarak kök sistemlerini değerlendirin.

Burada gösterilen büyüteç, yaygın yumurta kütleleri maviye boyanmış, iyi enfekte olmuş bir domates bitkisinin kökleridir. Tepsilerin kullanılması, küçük bir büyüme alanında yüzlerce bitkinin taranmasını sağlar. Büyüme torbaları ayrıca köklerin yıkanmasına gerek kalmadan nematod enfeksiyonlarının değil, kökün hızlı ve eksik tahribatsız değerlendirilmesine izin verir.

Bu yöntem aynı zamanda küçük bir büyüme alanında binlerce bitkinin yüksek verimli taranmasını sağlar. Burada, bir kese içinde yetiştirilen bir P bitkisinin kök sistemi, aşılamayı takiben mavi lekeli yumurta kütleleri gösterir. Enfeksiyonun zamanlaması, nematodlarla yapılan bitki tahlilleri için çok kritiktir.

Bu nedenle, enfeksiyonu birkaç gün bile geciktirmek, çok düşük enfeksiyon seviyelerine neden olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, artık bitkileri kök ur nematodları ile nasıl enfekte edeceğinizi ve değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Nematod ile enfekte olmuş köklerin uygun şekilde ele alınması gerektiğini unutmayın.

Kökleri atmadan önce otoklavlamak, nematodun yayılmasını sınırlayacaktır. Ayrıca, yüksek dozlarda olduğu için hava glisin kullanırken dikkatli olun. Kanserojendir.

Bu nedenle, bu kimyasalla enfekte olmuş kökleri işlemek ve bu kimyasalın hazırlanmasında eldiven kullanmanız gerekir.

Explore More Videos

İmmünoloji Sayı 61 Börülce Meloidogyne Kök infeksiyonu kök-ur nematodları domates fide gelişimi torbalar