Name: Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Keşfedin tavşan ve insan donör korneaları kullanarak herpes simpleks virüs tip I enfeksiyonunu incelemek için ex vivo organotipik kornea modelini. Bu yöntem, geleneksel hücre kültürlerine göre daha fizyolojik olarak uygun sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Delaware Valley Lions Göz Bankası desteğiyle bu iş için çok değerli idi. ICP8 karşı Birincil fare monoklonal antikoru Dr David Knipe (Harvard Tıp Okulu) bir tür hediye oldu. Biz de yararlı tartışmalar ve uzmanlık için Dr Stephen Jennings (Tıp Drexel Üniversitesi) ve Dr Peter Laibson (Wills Göz Enstitüsü) teşekkür ederim.

Tüm reaktifler ve ekipman steril satın alındığı veya prosedür öncesi sterilize edildi. Bu makalede, bir ön-enüklee gözü ile başlayan ex vivo model kurma adımları açıklanmaktadır. Deneylerde, biz genç (8-12 hft) albino tavşanlar (Pel-Freez Biyolojik, Rogers, AR) taze bütün gözbebekleri kullanın. Ayrıca, yerel göz bankasından elde insan korneası kullanın. Enükleasyon kendiniz yapıyorsanız, işlem sırasında kornea veya limbus zarar vermemek için dikkat edin. Tavşan enükleasyon protokolleri başka 2 bulunabilir. Bölüm 1: korneoskleral Düğme eksizyonu <ol><li> PBS ile gazlı bez, dar bir şerit ıslatın ve işlem sırasında tutarak kolaylaştırmak için göz küresi etrafına sarın. </li><li> Yaklaşık 0.5 cm uzaklıkta limbustan, sklera bir teğetsel kesi yapmak için keskin bir neşter kullanın. </li><li> Kesi uzatmak için keskin bir makas kullanın ve c tamamen tüketimorneoscleral düğmesi. </li><li> Korneoskleral düğmesi izole edildikten sonra forseps ile skleral jant tutarken, iris uzak tease. Endotele zarar veya kornea üzerinde aşırı stres uygulamakla kaçının. </li></ol> Bölüm 2: Organotipik Kültür içine Kornea Tanıtımı <ol><li> Eksplante kornealar Temel Olmayan Amino Asitler (1X), L-Glutamin (2 mM), Penisilin (200 U / ml) ve streptomisin (200 mg / ml) ile desteklenmiş Minimum Essential Medium (MEM) kültüre edilmiştir. Gerekirse örneğin amfoterisin gibi bir antifungal ajan, ayrıca ilave edilebilir. </li><li> 55 ° C&#39;de besiyerine% 1 agaroz çözeltisi hazırlayın ve hazır tutmak </li><li> İyice steril PBS içeren penisilin (200 U / ml) ve streptomisin (200 ug / ml) olarak kornea durulama. </li><li> Steril bir nokta plaka bir kuyuya kornea epitel kısmı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. </li><li> Için yeterli miktarda, korneanın endotel çukurluk agaroz içeren ortam eklemetamamen doldurunuz. Agaroz için ~ 1 dk katılaşmasını bekleyin. </li><li> Epitel yüzeyini kapsayacak şekilde 35 mm doku kültürü çanak içine jel iskele epitel tarafı destekleyen ve eklemek besiyeri ile kornea yerleştirin. </li><li> Kornea orta değişiklikleri her 48 saat ile bir hafta boyunca bu şekilde kültüre edilebilir. </li></ol> HSV-1 enfeksiyonu ve Deneysel Uyuşturucu Tedavi: Bölüm 3 <ol><li> Bir 35 mm doku kültürü çanağı içine virüs istenen miktarda ihtiva eden orta 1 ml ilave edilir. Biz genellikle zorlanma KOS korneanın başına HSV-1 1x10 4 PFU ile enfekte. Bizim stok titreleri CV-1 mono tabakaları üzerindeki plak deneyleri yapılarak tespit edilir. </li><li> Virüs içeren ortam içine aşağı agaroz iskele epitel kısmı ile birlikte kornea yerleştirin. </li><li> Aralıklı sallanan her 10-15 dakika ile 1 saat enfekte etmek için bir doku kültürü kuluçka makinesi içine kornea yerleştirin. </li><li> 1 saat sonra, virüs-contai aspireorta ning ve herhangi bir kalıntı virüs parçacıkları çıkarmak için PBS ile 2-3 kez yıkayın. </li><li> Geri önceki konumuna kornea yerleştirin ve epitel yüzeyini kapsayacak şekilde taze kültür ortamı ekleyin. </li><li> Deneysel tedavi deney doğasına bağlı olarak, enfeksiyondan önce veya sonra başlatılabilir. </li><li> Kültür ortamı, her 48 saat değiştirilir. </li></ol> Bölüm 4: Örnek Toplama <ol class="lalpha"><li> Plak tahlil analizleri için orta. Sıra orta karıştırın ve -80 plaket tahlil veya mağaza için hemen kullanmaya ° C farklı zaman noktalarında örneklerin toplanması halinde daha sonra kullanmak için. </li><li> DNA, RNA ve protein ya da kornea epitel hücreleri <ol><li> Agaroz iskele çıkarın ve PBS ile de kornea durulayın. </li><li> Yalnız kornea epitel malzeme sağlamak için kornea dan skleral doku Tüketim halka toplanır. </li><li> Ubir neşter şarkı, izole edilmesi için malzemenin türüne bağlı olarak, uygun bir tampon içinde, kornea epitel hücreleri kazıma. DNA ve RNA izolasyonu için, DNeasy Kan ve Doku Kiti ve RNeasy Mini Kit, sırasıyla (QIAGEN, Hilden, Almanya) kullanın. Protein lizatları toplanması için, Laemmli tampon kullanın. Kornea epitel hücrelerinin akış sitometri analizi için, hücreler tripsin gevşetmek için küçük bir miktar içinde korneaya ön-inkübe edilir ve daha sonra bir bisturi ile tripsin içine bunları çıkarmak. Doku eşit miktarda verim değil kornea epitel kazınması yana, örnekler analiz edilirken uygun kontroller dahil etmek önemlidir. Biz Western blot için bir yükleme kontrol olarak bir referans qPCRs gen ve nucleolin gibi qRT-PCR, GAPDH bir referans transkript olarak 18S rRNA kullanın. </li></ol></li><li> Immünohistokimya veya immünofloresan için doku örnekleri <ol><li> Agaroz iskele çıkarın ve mısır durulamaPBS ile de ea. </li><li> Videoda görüldüğü gibi deneysel hedefe bağlı olarak, parafin doku blok veya dondurulmuş doku blok yapmak için kornea kullanın. Kornea doku bölümleri hazırlanırken Biz standart prosedürleri izleyin. </li></ol></li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Doku kültür içinde hücreleri incelemek için mevcut yöntemlerin çoğu kolayca HSV-1 ile enfekte olan ex vivo olarak kornea kullanım için uyarlanabilir. Burada gösterilen HSV-1 enfeksiyonu okuyan uygulanan en yaygın teknikler birkaç temsilcisi sonuçları - qPCR (Şekil 1D), qRT-PCR (Şekil 1B), Western Blot (Şekil 1F), plak testi (Şekil 1C) ve doku immünofloresan (Şekil 1E). <img src="/files/ftp_upload/3631/3631fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. HSV-1 ex v ile enfekte kornea Analiziivo. Akut kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu ex vivo modelde (A) şematik gösterimi. (BF) Bu video makalede anlatılan yöntemi kullanarak enfekte kornealar analizi. Çıkarılmış tavşan korneası suşu KOS HSV-1 1x10 4 PFU / kornea ile enfekte edilmiş ve varlığında (PAA) ya da phosphonoacetic asit (400 ug / ml), HSV replikasyon bilinen bir inhibitör yokluğunda (Mock) içinde kültüre edildi. (B) Toplam RNA, belirtilen zaman noktalarında toplanmıştır ve viral transkripsiyon HSV-1 polimeraz için primerler ile qRT-PCR ile yapılmıştır. 18S karşı Astarlar rRNA bir referans olarak kullanılmıştır. n = 3. Hata çubukları, ortalama ± SEM göstermektedir. (C) Kültür ortamı 48 hpi toplanmıştır ve bulaşıcı parçacık üretim CV-1 mono tabakaları üzerindeki plak deneyi ile değerlendirilmiştir. (D) Toplam DNA 48 hpi toplanmıştır ve viral genom kopyelenmesi değerlendirilmiştir HSV-1 genomu için primerler ile bir qPCR tahlil. PrGAPDH karşı imers referans olarak kullanılmıştır. n = 3. Hata çubukları ± SEM göstermektedir. (E) Mock-işlenmiş kornealar kesitli 48 hpi, at-flaş donmuş ve enfekte epitel içinde bir viral erken protein (ICP8) varlığı için indirekt immunfloresan tarafından analiz edildi. Çekirdekler Höchst 33258 ile zıt edilir. Proteininin (F) lizatları 48 hpi toplandı ve bir viral protein (ICP0) Western blot ifadesi ile değerlendirildi. BCA tahlil örnekleri arasında eşit yükleme sağlamak için kullanılmıştır. hpi = saat sonrası enfeksiyon.

<ol><li>Kaye, S., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex keratitis.</a> Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).</li>
<li>Holmberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+exotic+pets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enucleation of exotic pets.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).</li>
<li>Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+herpes+simplex+virus+keratitis%3A+the+pathogenesis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul.+Immunol.+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited.</a> Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).</li>
<li>Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+organ+culture+model+for+assessing+the+effects+of+growth+factors+on+corneal+re-epithelialization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization.</a> Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).</li>
<li>Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+organ+culture+model+for+assessing+epithelial+responses+to+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants.</a> Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).</li>
<li>Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Corneal gene therapy.</a> J. Control Release. 124, 107-133 (2007).</li>
<li>Halford, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICP0+antagonizes+Stat+1-dependent+repression+of+herpes+simplex+virus%3A+implications+for+the+regulation+of+viral+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency.</a> Virol. J. 3, 44(2006).</li>
<li>Bhattacharjee, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+ocular+HSK+with+a+human+apolipoprotein+E+mimetic+peptide+in+a+mouse+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model.</a> Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).</li>
<li>Novitskaya, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difficulties+imaging+herpes+simplex+keratitis+with+fluorescein+isothiocynate-labeled+anti-HSV-1+antibodies+in+an+ex+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model.</a> Cornea. 28, 421-425 (2009).</li>
<li>Sharma, A., Shimeld, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunofluorescence+to+diagnose+herpes+simplex+virus+keratitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice.</a> Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu video yazıda bir ex vivo modelde akut kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu çalışmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre kültürü sonuçlarının fizyolojik-doğru doğrulama için izin verir ve böylece, yapılmalıdır hayvan deneyleri miktarını sınırlar, çünkü bu model, in vivo modeller in vitro ve arasında yararlı bir adım. Buna ek olarak, ex vivo modelde bozulmamış insan kornea epitel herpes enfeksiyonu incelemek için eşsiz ve paha biçilmez bir fırsat sağlar. Bu modeli kullanırk...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler / Malzemeleri </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Mediatech </td><td> 10-010-CV </td></tr><tr><td> Temel Olmayan Amino Asitler (100x çözüm) </td><td> Mediatech </td><td> 25-025-CI </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-CI </td></tr><tr><td> Penisilin G Sodyum Tuzu </td><td> Sigma </td><td> P3032 </td></tr><tr><td> Streptomisin Sülfat Tuz </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td></tr><tr><td> Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış </td><td> Laboratuarda hazırlanan </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tripsin EDTA (1x) &lt;/ Td&gt; <td> Mediatech </td><td> 25-053-CI </td></tr><tr><td> DNeasy Kan ve Doku Seti </td><td> QIAGEN </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Laemmli Tampon </td><td> Laboratuarda hazırlanan </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) Bileşik </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Tüm Tavşan Eyes (Genç) </td><td> Pel-Freez </td><td> 41211-2 </td></tr><tr><td> İnsan kornealar ve Tüm Gözler </td><td> Yerel Göz Bankası </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 12 Peki Porselen Noktası Tabak </td><td> Avogadro Lab Kaynağı </td><td> 1877 </td></tr><tr><td> 35 mm Doku Kültürü Bulaşık </td><td> Şahin </td><td> 353001 </td></tr><tr><td> Peki 6Hücre Kültürü Tabak </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Cryomold Orta </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4566 </td></tr></tbody></table>

akut epitel herpes ex vivo organotipik kornea model virüs tip i enfeksiyon simplex

Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection

Herpes keratit, herpes simpleks virüsü tip-1 (HSV-1) ile ilişkili en ciddi patolojilerde biridir. Herpes keratit anda gelişmiş ülkelerde hem kornea kaynaklı ve infeksiyona bağlı körlüğün en önde gelen nedenidir. Herpes keratit Tipik tanıtımı, yara izi gibi kalıcı kornea patolojileri yol açan incelme ve opaklık 1, kornea epitel enfeksiyon ve bazen derin korneal stroma ve endotel içerir. Kornea HSV-1 enfeksiyonu geleneksel deneysel modellerin iki tipte incelenir. Kornea epitel hücrelerinin kültürlü monolayers bir Petri kabındaki enfekte olduğu in vitro modelin de basitlik, tekrarlanabilirliği yüksek düzeyde, hızlı deneyler ve göreceli olarak düşük maliyeti sunmaktadır. Diğer taraftan, böyle bir tavşan veya fare gibi hayvanlarda kornea direkt olarak inoküle edildiği bir in vivo modeli, en son derece gelişmiş bir fizyolojik sunmaktadırsistem, ancak daha yüksek maliyetler, uzun deneyler, gerekli hayvan bakımı ve değişkenliği daha büyük bir derecesi vardır. Bu video yazıda, in vivo modeller in vitro ve hem gücünü birleştiriyor kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu yeni bir ex vivo modelde, ayrıntılı bir gösteri sunmak. Ex vivo modelde organotypically kültür içinde muhafaza edilmekte ve HSV-1 ile enfekte olan bozulmamış korneası kullanmaktadır. Ex vivo modelinin kullanımı çok fizyolojik açıdan dayalı sonuçlar sağlar, yine de oldukça pahalı değildir ve in vitro model ile karşılaştırılabilir zaman kararlılık gerektirir.

Bu video yazıda yeni bir kullanımı tarif<em&gt; Ex vivo</emAkut herpes&gt; modeli virüsü tip I kornea epitel enfeksiyon simpleks.

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Herpes keratiti, herpes simplex virüs tip 1 (HSV-1) ile ilişkili en şiddetli patolojilerden biridir. Herpes keratiti şu anda önde gelen...

Ben Jane Clifford. Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde biyokimya ve moleküler biyoloji profesörü ve bölüm başkanıyım. Benim adım Ola iv ve Dr. Clifford'un laboratuvarında MD PhD öğrencisiyim. Oli ve benim sizin için hazırladığımız bu video, tavşanlardan ve insan donörlerden elde edilen korneaların ex vivo kültürünü göstermektedir.Bu korneaları herpes virüsü enfeksiyonunu incelemek için kullandık; ancak bunlar, korneanın diğer hastalıklarının çalışılması için de kesinlikle uygundur ve hücre tek kültürlerine kıyasla özellikle ilgili bir ex vivo modeldir. Herpes keratiti, herpes simplex virüs tip 1 ile ilişkili en ciddi patolojilerden biridir. Günümüzde, gelişmiş ülkelerde kornea kaynaklı ve enfeksiyona bağlı körlüğün başlıca nedeni konumundadır.Herpes keratiti geleneksel olarak iki tip deneysel modelde incelenir. Korneal epitel hücrelerinin kültürlenmiş tek katmanlarının bir Petri kabında enfekte edildiği in vitro model; basitlik, yüksek tekrarlanabilirlik düzeyi, hızlı deneyler ve nispeten düşük maliyetler sunar. Öte yandan, tavşan veya fare gibi hayvanların korneasına doğrudan inokülasyon yapıldığı herpes keratiti in vivo modeli, oldukça gelişmiş bir fizyolojik sistem sunar; ancak daha yüksek maliyetlere, daha uzun deney sürelerine, gerekli hayvan bakımına ve daha yüksek düzeyde değişkenliğe sahiptir.Bu video makalesinde, hem in vitro hem de in vivo modellerin güçlü yönlerini birleştiren, akut korneal epitel HSV 1 enfeksiyonunun yeni bir ex vivo modelinin ayrıntılı bir gösterimini sunuyoruz. Ex vivo model, tipik olarak kültürde tutulan ve HSV ile enfekte edilen sağlam kornea organlarını kullanır. Ex vivo modelin kullanımı, yüksek derecede fizyolojik temelli sonuçlara olanak tanır; bununla birlikte oldukça düşük maliyetlidir ve in vitro modelle kıyaslanabilir düzeyde bir zaman taahhüdü gerektirir.Prosedüre başlamadan önce şunları hazırlayın. Petri kabı, fosfat tamponlu salin, kornea kültürü ve iskale medyumu, spot plaka, gazlı bez şeridi, taze göz küresi, skalpel, pens ve keskin makas. Dar bir gazlı bez şeridini PBS ile ıslatın ve göz küresini güvenli bir şekilde tutmak için etrafına sarın.Prosedür sırasında, sklera üzerine iris'ten yaklaşık yarım santimetre uzaklıkta tanjiyel bir insizyon yapmak için keskin bir skalpel kullanın. Kornea sklera butonunu tamamen çıkarmak için makas kullanın. İnsizyon genişledikçe, göz küresi içindeki basınç azalacak ve bu durum dokuyu tutmayı ve manipüle etmeyi zorlaştıracaktır.Bu nedenle, bu adımda bilenmiş, güvenilir bir makas kullanmanızı öneririz. Kornea sklera butonu izole edildikten sonra, sklera kenarını pensle tutarak irisi nazikçe ayırın. Endotelye zarar vermekten veya korneaya aşırı stres uygulamaktan kaçının.%1'lik agros orta çözeltisi hazırlayın ve hazır tutun. 55 °C'de, korneayı penisilin ve streptomisin içeren steril PBS ile iyice yıkayın. Korneayı, epitel tarafı aşağı gelecek şekilde steril bir Spotlight kuyucuğuna yerleştirin.Korneanın endotel konkavitesine Medium içeren agar ekleyin. Tamamen dolduracak kadar eklemeniz yeterlidir. Agarın katılaşması için yaklaşık bir dakika bekleyin.Destekleyici agros iskelesi ile birlikte korneayı, epitel yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir doku kültürü kabına yerleştirin ve epitel yüzeyini kaplayacak şekilde desteklenmiş MEM medyumu ekleyin. Kornea, her 48 saatte bir medyum değişimi yapılarak bir haftadan fazla süre boyunca bu şekilde kültüre edilebilir. İstenen miktarda virüs içeren bir mililitre medyumu doku kültürü kabına ekleyin.Korneayı, agro iskeleli epitel tarafı aşağı gelecek şekilde virüs içeren medyumun içine yerleştirin. Virüs enfeksiyonunun gerçekleşmesi için korneayı doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve bir saat boyunca, her 10 ila 15 dakikada bir ara ara sallayarak bekletin. Bir saatin sonunda virüs içeren medyumu aspire edin ve kalıntı viral partikülleri uzaklaştırmak için PBS ile iki ila üç kez durulayın.PBS ile durulama yaparken, korneanın agro iskeletten yerinden çıkmamasına dikkat edin. Epitel yüzeyini kaplayacak şekilde taze besiyeri ekleyin. Deneysel uygulamalara, deneyin doğasına bağlı olarak enfeksiyondan önce veya sonra başlanabilir.Kültür ortamı her 48 saatte bir değiştirilir. Ortamı iyice karıştırın ve bir plak analizi için hemen kullanın. Alternatif olarak, daha sonraki kullanımlar için eksi 80 derece Celsius'ta saklayın. Farklı zaman noktalarında örnek toplayacaksanız, korneayı PBS ile iyice durulayın.Agro iskeletini çıkarın, yalnızca kornea epitelyal materyalin toplandığından emin olmak için sklera dokusu halkasını korneadan ayırın. Bir bistüri kullanarak kornea epitelyal hücrelerini, izole edilecek materyalin türüne bağlı olarak uygun tampon çözeltinin içine kazıyın. Sklera kenarının çıkarılması, kornea stromasının su emerek hızla şişmesini sağlar.Şişme işlemi kazımayı zorlaştırabileceği için, bu adımı hızlıca gerçekleştirmenizi ve tüm örneğin toplandığından emin olmak için Petri kabını durulamanızı öneririz. Agro iskeleyi çıkarın ve korneayı PBS ile iyice durulayın.Deneysel amacınıza bağlı olarak, burada gösterildiği gibi korneayı kullanarak bir parafin doku bloğu veya dondurulmuş doku bloğu hazırlayın. Korneayı bir numune kalıbı içerisinde optimal kesme sıcaklık bileşiğine (OCT) gömün. Korneayı etanol ve kuru buz banyosunda hızlıca dondurun. Bu videoda gösterdiklerimiz korneaların hazırlanması, korneanın diseksiyonu, ex vivo kültüre yerleştirilmesi ve korneaların herpes virüsü ile enfekte edilmesidir.Bu çalışma, herpes virüs enfeksiyonunu ex vivo incelememizde bize çok fayda sağlayan bir model için tekniği sunmuştur ve korneal hücrelerle yapılan deneylerde diğer araştırmacılar için de yararlı olacağını umuyoruz.

ex-vivo-organotypic-corneal-model-acute-epithelial-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Herpetik kornea hastalığı çalışmaların çoğu birincil enfeksiyon modeli kullanın. Ancak, HSV-1 ile birincil infeksiyon genellikle insan hastalığına yol açmaz. Burada daha yakından insan hastalığı taklit herpetik kornea hastalığı, tekrarlayan modeli açıklamak.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Bu videoda, domuz gözünden diseke edilen bir korneoskleral düğme kullanarak bakteriyel keratit için bir ex vivo model oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Aşılanmış bakteriler, altta yatan stromayı istila etmek ve in vivo enfeksiyonu taklit eden kornea dokuları içinde bir enfeksiyon oluşturmak için kornea epitel insizyonlarını geçer.

Domuz Ex vivo Kornea Bakteriyel Keratit Modeli: Kornea Epitel Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon Oluşturma Tekniği

Bu videoda, enfekte domuz korneasından elde edilen bir virüs kullanılarak plak testi gerçekleştirme yöntemi gösterilmektedir. Domuz korneası, deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için kullanılır.

Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

Deri, insan patojeni herpes simpleks virüsü tip 1'in (HSV-1) hedef dokularından biridir. HSV-1'in dokuya invazyon yolunu araştırmak için, cildin en dış tabakasını temsil eden murin epidermal tabakalarının ex vivo bir enfeksiyon modeli oluşturduk.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Bu makalede, bakteriyel keratitin ex vivo porcine modelini kurmak için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Pseudomonas aeruginosa prototipik bir organizma olarak kullanılır. Bu yenilikçi model in vivo enfeksiyonu taklit eder, çünkü bakteri çoğalması bakterinin kornea dokusuna zarar verme yeteneğine bağlıdır.

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Bu makalede, bir taklit hangi bir yöntem...

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Keşfedin tavşan ve insan donör korneaları kullanarak herpes simpleks virüs tip I enfeksiyonunu incelemek için ex vivo organotipik kornea modelini. Bu yöntem, geleneksel hücre kültürlerine göre daha fizyolojik olarak uygun sonuçlar sunar.

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Daha fazla video keşfet